電針刺激大腸俞及足三里穴對肝缺血再灌注大鼠腸道屏障功能的影響

王成琛　魏來　譚思由　鄒毅　孔高茵

〔摘要〕 目的 探究術(shù)前電針（electric acupuncture， EA）刺激大腸俞及足三里穴，是否對肝缺血再灌注（ischemia-reperfusion， I/R）大鼠的腸道屏障功能具有保護作用。方法 32只SD大鼠隨機分為假手術(shù)組（Sham組）、缺血再灌注組（I/R組）、穴位刺激缺血再灌注組（AS+I/R組）、非穴位刺激缺血再灌注組（nAS+I/R組）;于肝臟缺血1 h再灌注4 h后分別取其下腔靜脈血及小腸標本，使用血清學方法檢測丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase， ALT）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase， AST）濃度，Chiu's法評價HE染色后光鏡下腸黏膜損傷程度，ELISA法檢測血清D-乳酸（D-lactate， D-Lac）、二胺氧化酶（diamine oxidase， DAO）水平，免疫組化檢測小腸組織中閉鎖小帶（ZO-1 tight junction， ZO-1）蛋白表達情況。結(jié)果 與Sham組比較，I/R組大鼠AST、ALT濃度較高，腸黏膜損傷嚴重，血清D-lac、DAO濃度較高，ZO-1蛋白表達較低（P<0.05）;與I/R組和nAS+I/R組比較，AS+I/R組大鼠Chiu's評分較低，血清AST、ALT濃度較低，血清D-Lac、DAO水平較低，ZO-1蛋白表達較高（P<0.05）;且與I/R組比較，nAS+I/R組血清AST、ALT濃度和血清DAO水平較低，ZO-1蛋白表達較高（P<0.05）。結(jié)論 EA刺激大腸俞及足三里穴，能減輕肝I/R大鼠的腸道損傷，減少菌群入血，對其腸道的屏障功能具有保護作用。

〔關(guān)鍵詞〕 肝缺血再灌注;腸道屏障功能;電針;大腸俞;足三里

〔中圖分類號〕R245? ? ? ?〔文獻標志碼〕A? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2021.03.010

〔Abstract〕 Objective To explore whether electroacupuncture （EA） stimulation on Dachangshu （BL25） and Zusanli （ST36） acupoints before surgery has protective effects on intestinal barrier function in hepatic ischemia reperfusion （I/R） rats. Methods 32 SD rats were randomly divided into the sham operation group （Sham group）， ischemia-reperfusion group （I/R group）， acupoint-stimulated ischemia reperfusion group （AS+I/R group） and non-acupoint-stimulated ischemia reperfusion group （nAS+I/R group）. After 1 hour of ischemia and 4 hours of reperfusion， inferior vena cava blood specimens and small intestine samples of rats were taken respectively， serological methods were used to detect alanine aminotransferase （ALT） and aspartate aminotransferase （AST） concentrations， Chius evaluation method was used to evaluate the degree of intestinal mucosal damage under microscope after HE staining， ELISA method was used to detect serum D-lacticate （D-Lac） and diamine oxidase （DAO）， immunohistochemistry was used to detect the expression of ZO-1 tight junction （ZO-1） protein in small intestine. Results Compared with the Sham group， the concentrations of AST and ALT in I/R group were higher， the intestinal mucosa injury was serious， the concentrations of serum D-lac and DAO were higher， and the expression of ZO-1 protein was lower （P<0.05）; compared with I/R group and nAS+I/R group， the Chiu's score， the concentrations of serum AST and ALT， the levels of serum D-lac and DAO were lower， and the expression of ZO-1 protein was higher in AS+I/R group （P<0.05）; and compared with I/R group， the concentrations of serum AST and ALT， the level of serum DAO were lower， the expression of ZO-1 protein was higher in nAS+I/R group （P<0.05）. Conclusion The stimulation of EA on Dachangshu （BL25） and Zusanli （ST36） points can alleviate the intestinal damage of hepatic I/R rats， reduce the influx of bacteria into the blood， and protect the intestinal barrier function.

〔Keywords〕 hepatic ischemia reperfusion; intestinal barrier function; electroacupuncture; Dachangshu （BL25）; Zusanli （ST36）

肝臟手術(shù)常需暫時性阻斷入肝血流，而重新恢復血液供應后可能造成肝缺血再灌注損傷（hepatic ischemia-reperfusion injury， HIRI）[1-3]。這種損傷不僅僅局限于肝臟本身，也可能對全身其他臟器功能造成影響[4]，導致圍術(shù)期一系列不良反應及并發(fā)癥，腸道是缺血再灌注（ischemia-reperfusion， I/R）損傷最常累及的器官。穴位刺激（acupoint stimulation， AS）是中醫(yī)的重要組成部分，電針（electric acupuncture， EA）作為目前臨床上常用的AS方法，通過對神經(jīng)、內(nèi)分泌、免疫等系統(tǒng)的調(diào)控，對多個器官和系統(tǒng)產(chǎn)生保護作用[5-6]。在現(xiàn)有的針對胃腸保護行AS的動物實驗及臨床研究中，大腸俞和足三里穴選用較多，功能效果較為明確。本實驗擬探究肝臟手術(shù)前EA刺激大腸俞及足三里穴對肝I/R大鼠腸道的屏障功能的影響，為AS保護腸道功能運用于臨床提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1? 動物及分組

清潔級成年健康雄性SD大鼠，體質(zhì)量180～210 g，購買于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，合格證號：SYXK（湘）2015-0013，于湖南省人民醫(yī)院實驗動物中心適應性生存7 d，正常飲食;術(shù)前禁食12 h，不禁飲。按隨機數(shù)字表分為假手術(shù)組（Sham組）、缺血再灌注組（I/R組）、穴位刺激缺血再灌注組（AS+I/R組）、非穴位刺激缺血再灌注組（nAS+I/R組），每組8只。Sham組僅行剖腹、肝門暴露1 h后縫合，4 h內(nèi)不行其他任何操作;I/R組開腹后充分暴露肝門，解剖并分離供應肝中葉和肝左葉的動脈、靜脈和膽管，使用無創(chuàng)動脈夾將其阻斷1 h，再灌注4 h;AS+I/R組取SD大鼠雙側(cè)大腸俞及足三里穴[7]，使用華佗牌無菌針灸針（0.30 mm×25 mm，蘇州醫(yī)療用品廠有限公司），接華佗牌電針儀（SDZ-II型，蘇州醫(yī)療用品廠有限公司）刺激處理，采用疏密波，頻率2 Hz/100 Hz，強度以剛剛觀察到大鼠肌肉顫動為宜，時間0.5 h，余處理同I/R組;nAS+I/R組夾閉動脈夾前取雙側(cè)任意非穴位部位，使用華佗牌0.30 mm×25 mm無菌針灸針接華佗牌電針儀刺激處理，波型、頻率、強度、時間同前，余處理同I/R組。

1.2? 模型制備及取材方法

10%水合氯醛（天津市科密歐化學試劑有限公司，302-17-0）腹腔注射麻醉，固定大鼠、備皮、消毒，腹正中線開腹，切口約3 cm，暴露肝門，血管夾夾閉肝十二指腸韌帶（肝動脈、門靜脈和膽管）及正中葉，誘發(fā)70%肝臟熱缺血（70% liver warm ischemia， 70%IWI）[8]，縫合腹部。1 h后開腹，松止血鉗，縫合腹部。4 h后，處死大鼠并取材。HIRI模型構(gòu)建成功的標志：阻斷后可見肝左、中葉變白，右、尾狀葉持續(xù)灌注。

開腹經(jīng)下腔靜脈取血2～5 mL，室溫靜置30 min，離心處理（3 000 r/min，20 min，4 ℃），取上清液

-20 ℃冰箱凍存;取部分肝左葉組織及十二指腸以下10 cm處小腸組織，經(jīng)10%甲醛溶液處理備用。

1.3? 觀察指標及方法

1.3.1? 測定血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase， ALT）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase， AST）濃度? 取各組大鼠血清，嚴格按ALT測試盒（南京建成生物工程研究所，貨號：C009-1-1賴氏法）、AST測試盒（南京建成生物工程研究所，貨號：C01-1-1賴氏法）說明書步驟操作。

1.3.2? HE染色光鏡下評定小腸黏膜損傷程度? 取各組大鼠小腸組織，4%多聚甲醛固定。石蠟包埋、切片，HE染色，光學顯微鏡下觀察小腸黏膜組織形態(tài)學改變，使用Chius法[9]對小腸黏膜損傷程度進行評分。0級：絨毛正常;1級：絨毛頂端下間隙增寬;2級：絨毛頂端上皮脫落、破潰;3級：絨毛頂端破壞擴展到基底部;4級：上皮完全脫落;5級：固有層崩潰，出現(xiàn)潰瘍及出血點。

1.3.3? ELISA檢測血清D-乳酸（D-lactate， D-Lac）、二胺氧化酶（diamine oxidase， DAO）水平? 嚴格按照D-Lac測試盒（南京建成生物工程研究所，貨號：H263 競爭法）、DAO測試盒（南京建成生物工程研究所，貨號：A088-1 速率法）說明書步驟操作。

1.3.4? IHC檢測閉鎖小帶（ZO-1 tight junction， ZO-1）蛋白的表達? 取小腸組織石蠟切片脫蠟至水、熱修復抗原，加入1%高碘酸，室溫10 min以滅活內(nèi)源性酶，PBS沖洗3 min×3次，孵育一抗ZO-1（艾博抗貿(mào)易有限公司，貨號：ab22154，來源：Rabbit）、二抗抗兔IgG抗體-HRP多聚體（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，貨號：pv-9000），DAB顯色、蘇木素復染、各級酒精（60%～100%）脫水后，置于二甲苯10 min，2次，中性樹膠封片、顯微鏡觀察。隨機取3個不重疊高倍視野（×400）拍照，采像為普通的電腦采像，圖像分析軟件為IPP（Image-Pro-Plus），計算視野下的陽性表達部位的累積光密度和視野下樣品面積的比值（IOD/Area）。

1.4? 統(tǒng)計學分析

以 SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件對結(jié)果進行分析，計量資料呈正態(tài)分布，以“x±s”表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較使用LSD檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1? 各組大鼠血清ALT、AST濃度比較

與Sham組比較，I/R組ALT、AST濃度顯著增高（P<0.05）;與I/R組比較，AS+I/R組和nAS+I/R組ALT、AST濃度均降低（P<0.05）;且AS+I/R組ALT、AST濃度低于nAS+I/R組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見表1。

2.2? 各組大鼠小腸組織HE染色及Chius法評分比較

Sham組示大致正常絨毛;I/R組絨毛破損脫落嚴重、可見毛細血管擴張充血;AS+I/R組可見上皮下間隙增大、毛細血管充血，偶見絨毛破損;nAS+I/R組可見上皮下間隙擴張、毛細血管充血、絨毛破損。I/R組與nAS+I＼R組大鼠小腸組織腸黏膜損傷明顯，可見上皮與固有層分離，絨毛破損裸露，固有層毛細血管擴張，固有層破壞、斷裂。與Sham組相比，AS+I/R組仍可見少中量絨毛破損、上皮下間隙增寬，但其腸黏膜損傷程度較I/R組為輕，極少出現(xiàn)固有層破壞及出血。Chius法評分顯示，I/R組、AS+I/R組和nAS+I/R組均高于Sham組（P<0.05），但AS+I/R組低于I/R組與nAS+I/R組（P<0.05），見表2、圖1。

2.3? 各組大鼠血清D-Lac、DAO的含量

與Sham組比較，I/R組含量增高（P<0.05）;與I/R組比較，AS+I/R組D-Lac、DAO含量均降低（P<0.05）;且AS+I/R組D-Lac、DAO含量低于nAS+I/R組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表3。

2.4? 各組大鼠腸組織ZO-1蛋白的表達

ZO-1在腸組織中為胞漿表達，陽性表達呈棕色，Sham組腸組織Z0-1蛋白持續(xù)表達;與Sham組相比，I/R組ZO-1蛋白表達明顯下降（P<0.05）;nAS+I/R組ZO-1蛋白表達高于I/R組（P<0.05），AS+I/R組ZO-1蛋白表達明顯高于I/R組與nAS+I/R組（P<0.05）。見表4、圖2。

3 討論

腸道是隔離機體內(nèi)部與腸道菌群及毒素的重要屏障[10]，炎癥、應激、創(chuàng)傷、低血容量、I/R損傷等可引起腸道屏障功能損傷[11]，其中機械屏障起主要作用[12]。當腸道機械屏障受損時，腸內(nèi)菌群失調(diào)，腸道通透性改變[13]，腸內(nèi)細菌中的D-Lac及小腸黏膜上層絨毛中的DAO進入血液循環(huán)。在腸黏膜上皮細胞之間存在著細胞間連接，ZO-1為腸上皮重要的緊密連接蛋白（tight junction protein， TJP），對于維護腸黏膜屏障的完整性有非常重要的意義，若ZO-1蛋白數(shù)量減少，說明腸道黏膜結(jié)構(gòu)受損。綜合本實驗各項結(jié)果，I/R組SD大鼠行70% IWI處理后可見肝左、中葉變白，右、尾狀葉持續(xù)灌注，I/R組大鼠血清ALT、AST濃度較Sham組明顯增高，證明其HIRI模型構(gòu)建成功。本研究采用腸組織的HE染色、血清D-Lac、DAO的ELISA檢測、腸組織ZO-1蛋白的表達檢測的方法，發(fā)現(xiàn)AS可減輕腸道黏膜損傷、減少其上皮組織的破壞及減少腸道菌群入血，從而對其屏障功能具有保護作用。

中醫(yī)學認為，手術(shù)后腸道功能障礙[14]屬于“脾胃運化失?！钡姆懂?，脾胃受損必致氣血兩虛，其病位在胃和脾[15]，因此，中醫(yī)針對胃腸功能的治療重在調(diào)理脾胃。圍術(shù)期AS可在一定程度上減輕組織氧化應激損傷[16]，降低炎癥因子的產(chǎn)生，調(diào)節(jié)機體免疫功能[17]，以及在一定程度上鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、緩解焦慮[18]，且較西醫(yī)方法副作用小、創(chuàng)傷小、療效好。大腸俞屬足太陽膀胱經(jīng)，為大腸的背俞穴，《脈經(jīng)》中記載其可以理氣止痛、通降腸腑。足三里穴屬足陽明胃經(jīng)，是中醫(yī)針灸中足陽明胃經(jīng)的一個重要合穴和胃之下合穴，是補虛要穴，《靈樞》中記載其可以燥化脾濕、生發(fā)胃氣，促進脾胃功能恢復。有研究[19]發(fā)現(xiàn)，EA內(nèi)關(guān)和大腸俞穴可降低大鼠內(nèi)臟敏感性，EA敏化穴“大腸俞”能顯著改善大鼠腸道動力功能的紊亂[20]。而針刺足三里穴可顯著抑制大鼠小腸I/R損傷后炎癥反應，改善腸黏膜通透性及緊密連接蛋白表達，促進腸黏膜結(jié)構(gòu)和功能修復[21]。EA足三里聯(lián)合大承氣湯敷臍可以減輕膿毒癥腸功能障礙患者的炎癥反應，對膿毒癥腸功能障礙患者腸屏障功能具有保護作用[22]。其結(jié)果表明，本實驗EA大腸俞及足三里穴的AS+I/R組和單獨針刺足三里穴[21]的電針組，分別與本實驗的I/R組及單獨針刺足三里穴I/R損傷組的Chius評分差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），EA治療有效;本實驗選取大腸俞及足三里穴，綜合兩個穴位的功效及優(yōu)點，而既往關(guān)于腸道屏障功能在炎癥相關(guān)機制方面的研究較多，結(jié)果也較為確切，因此，本實驗選用的腸道屏障功能相關(guān)血清標志物D-Lac和DAO，均可驗證EA大腸俞及足三里穴后，腸內(nèi)菌群代謝產(chǎn)物D-Lac入血減少（P<0.05），腸黏膜上皮成分DAO入血減少（P<0.05），腸黏膜屏障損傷較I/R組小。而免疫組化ZO-1蛋白的表達可通過計算及直觀看到，AS+I/R組較I/R組及nAS+I/R組表達高（P<0.05），腸上皮TJP完整程度高，腸黏膜屏障損傷較小。

在本實驗中，AS+I/R組血清ALT、AST較Sham組也降低，考慮足三里穴的相關(guān)調(diào)節(jié)免疫的作用[17]，可能對肝臟功能也有一定的保護作用;nAS+I/R組較I/R組各項指標稍降低，可能是隨機采用的某些針刺部位靠近某些神經(jīng)結(jié)構(gòu)并影響相關(guān)通路等，使得術(shù)前的EA預處理具有一定的保護作用[5]，但本實驗中機制不明、效果不顯著。本實驗為EA大腸俞及足三里穴以改善腸道屏障功能運用于臨床提供了實驗依據(jù)，但HIRI涉及到微循環(huán)障礙、鈣超載及細胞凋亡等多種因素，腸道屏障功能損傷相關(guān)病理生理機制復雜，進一步研究HIRI中腸黏膜屏障功能障礙的影響及機制，探索有效的防治方法，對降低肝臟缺血再灌注損傷及減少肝臟外科術(shù)后并發(fā)癥的發(fā)生率具有重要意義。

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