五倍子瘢痕膏提取液通過miR-21靶向調(diào)控mTOR通路對瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖、凋亡的影響

唐志銘，丁繼存，翟曉翔，荊夢晴，王蒙蒙，陸 鷺

瘢痕疙瘩是因皮膚遭受創(chuàng)傷和刺激后真皮網(wǎng)狀層出現(xiàn)慢性炎癥[1]，從而導致成纖維細胞大量增殖和以膠原為主的細胞外基質(zhì)過度沉積所致。其確切發(fā)生機制尚未闡明，也無理想的治療方法[2]。本課題組應用五倍子瘢痕膏治療瘢痕疙瘩臨床療效確切[3]，且前期實驗研究證實其能抑制瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖[4]，但具體作用機制尚不清楚。有研究者應用基因芯片技術(shù)證明miRNA在病理性瘢痕與正常皮膚組織中存在差異性表達[5,6]，其中miR-21在增生性瘢痕組織中表達顯著高于正常皮膚組織[7]。有研究表明miR-21可靶向抑制10號染色體張力缺失蛋白磷酸酶（phospatase and tensin homologdeleted on chromasom ten，PTEN）表達[8]，而PTEN是哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信號通路的負反饋調(diào)控因子。mTOR信號通路與細胞異常增殖密切相關(guān)，在瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖過程中具有重要作用[9]。五倍子瘢痕膏抑制瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖是否與其通過miR-21靶向調(diào)控mTOR通路有關(guān)？本課題組對此進行了研究探索。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 兔抗人磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）、磷酸化蛋白激酶B（p-Akt）、PTEN、p-mTOR單克隆抗體（武漢博士德生物工程有限公司）、辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗兔IgG二抗（Jackson免疫研究公司）、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒（上海索萊寶生物科技有限公司）、雙螢光素酶報告基因檢測試劑盒（Promega公司）、miR-21 mimic、miR-21 inhibitor（ 廣州銳博生物科技有限公司）、反轉(zhuǎn)錄試劑 盒 superscript III 、Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn) 染 試劑、pmirGLO質(zhì)粒載體（美國Invitrogen公司）。

1.1.2 主要儀器 聚合酶鏈反應（PCR）儀（加拿大Funglyn Biotech公司）、電泳儀（北京六一生物科技有限公司）、Quantity-one凝膠成像分析系統(tǒng)、酶標儀（美國Bio-Rad公司）、紅外熒光成像儀（美國Li-Cor公司）、Image Pro-Plus圖像分析系統(tǒng)（美國Media Cybernetics公司）、流式細胞儀（美國貝克曼庫爾特有限公司）。

1.1.3 標本來源 標本來自徐州市中醫(yī)院皮膚科瘢痕疙瘩患者手術(shù)切除治療后的前胸部瘢痕疙瘩組織及鄰近正常皮膚組織。所有取材操作均經(jīng)徐州市中醫(yī)院倫理委員會批準，且患者或其家屬簽署知情同意書?；颊唏：鄹泶窬幱谠錾钴S期，術(shù)前1年內(nèi)未接受任何治療，并且無系統(tǒng)性疾病，無腫瘤病史。經(jīng)術(shù)后組織病理檢查均證實為瘢痕組織，其中男3例，女5例，共8份瘢痕疙瘩組織標本，8份正常皮膚組織標本。

1.2 方法

1.2.1 瘢痕疙瘩成纖維細胞分離、培養(yǎng) 將所切取的瘢痕疙瘩及正常皮膚組織剪成1 mm3大小的組織塊，用0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液消化14 h后，200目篩網(wǎng)過濾，收集濾液；將濾液離心，1 000 r/min，7 min，棄上清液；用含10%胎牛血清的DMEM液5 ml混勻沉淀細胞，置于1個25 ml的培養(yǎng)瓶中；在37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)48 h后，用含10%胎牛血清的DMEM換液。細胞接近長滿時，按1:3比例進行傳代。本實驗選用第3代細胞。

1.2.2 實驗分組 實驗分為7組：空白對照組（MOCK）、miR-21 mimic 組（MIM）、0.5 mg/ml五 倍子瘢痕膏提取液 +mimic組（0.5 mg/ml Galla+MIM）、1 mg/ml五倍子瘢痕膏提取液 +mimic組（1 mg/ml Galla+MIM）、miR-21 inhibitor 組（IN）、0.5 mg/ml五倍子瘢痕膏提取液 +inhibitor組（0.5 mg/ml Galla+IN）、1 mg/ml五倍子瘢痕膏提取液+inhibitor組（1mg/ml Galla+IN）。

1.2.3 將第3代成纖維細胞配成單個細胞懸液，以1.0×l04/ml的密度接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔200 μl，置于CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，待細胞生長至融合度為60%～70%時，更換無血清培養(yǎng)基后進行轉(zhuǎn)染，MIM 組、0.5 mg/ml Galla+MIM 組 及 1 mg/ml Galla+MIM 組轉(zhuǎn)染 miR-21 mimic，而 IN 組、0.5 mg/ml Galla+IN 組 及 1 mg/ml Galla+IN 組 轉(zhuǎn) 染 miR-21 inhibitor，MOCK組不轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染12 h后吸去培養(yǎng)板孔內(nèi)舊培養(yǎng)液，再每孔加入DMEM液180 μl，然后各個實驗組分別加入相應濃度五倍子瘢痕膏提取液[為五倍子瘢痕膏藥物組方（五倍子、蜈蚣、丹參、威靈仙、地骨皮、黑醋、白礬）的提取物]20 μl，MOCK組則加入含10%胎牛血清的DMEM液20 μl，培養(yǎng)24 h后收集細胞提取總RNA，48 h后收集細胞提取蛋白。

1.2.4 逆轉(zhuǎn)錄（RT）-PCR檢測miR-21、PTEN mRNA的表達 將所切取的瘢痕疙瘩和正常皮膚組織制成組織勻漿后用RT-PCR試劑盒進行總RNA提取。瘢痕疙瘩成纖維細胞按前述方法分離培養(yǎng)及分組干預后，標準環(huán)境下孵育24 h，然后采用RT-PCR試劑盒進行總RNA提取。電泳鑒定提取RNA的完整性。取6 μl RNA 為反轉(zhuǎn)錄模板。反轉(zhuǎn)錄反應體系為 20 μl，反應條件 ：37℃ 1 h，95℃ 3 min。標準曲線定量法制備cDNA模板標準品，依次10倍梯度稀釋，制備成5個梯度的cDNA模板定量標準品。內(nèi)參基因選用?-肌動蛋白，在GenBank數(shù)據(jù)庫中獲得目的基因mRNA序列，采用Primer express2.0軟件，在CDS區(qū)設計特異性引物。引物序列見表1。

表1 miR-21、PTEN基因引物序列及擴增產(chǎn)物片段長度

PCR反應體系為50 μl，反應條件：93℃預變性3 min，93℃變性 30 s，57℃退火 30 s，共循環(huán) 30 次，72℃延伸 5 min。取 6 μl PCR 產(chǎn)物于 1.5% 瓊脂糖凝膠中電泳，用Quantity-one凝膠成像分析系統(tǒng)分析各條帶的灰度值，以各目的基因與內(nèi)參基因U6的灰度值比值表示mRNA的相對表達量。

1.2.5 Western Blot檢測 PTEN、PI3K、P-Akt、p-mTOR蛋白的表達 收集培養(yǎng)的瘢痕疙瘩成纖維細胞，用預冷的磷酸鹽緩沖液洗2次，加入細胞裂解液，在冰面上靜置 10 ～ 20 min，用細胞刮勻漿后，4℃下 15 000 r/min離心10 min，取上清。用Lowry 法對上清進行蛋白定量，取50 μg蛋白上樣到15% 的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。待溴酚藍進入凝膠底部后，將蛋白質(zhì)再印跡到硝酸纖維素膜上，加入一抗4℃孵育過夜，最后加入HRP標記的相應二抗，室溫孵育1 h，洗膜后，odyssey紅外熒光成像儀掃描膜并成像，成像圖用Image Pro-Plus圖像分析系統(tǒng)測定其灰度值，以?-肌動蛋白為內(nèi)參計算蛋白相對表達量。

1.2.6 螢光素酶報告基因檢測 應用生物信息學方法預測miR-21與PTEN mRNA 的結(jié)合位點，然后合成PTEN-WT 3'UTR和PTEN-MT 3'UTR引物序列，并插入雙酶切位點。以人瘢痕成纖維細胞基因組 DNA為模板進行 PCR擴增，獲得含miR-21靶序列的3'-UTR基因片段?；厥掌危盖衟mirGLO與3'-UTR基因片段連接，構(gòu)建野生型pmirGLO -PTEN-3'UTR-WT和突變型pmirGLOPTEN-3'UTR-MT重組載體質(zhì)粒。應用Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑，將PTEN野生型和突變型質(zhì)粒分別與 miR-21 mimic、miR-21 inhibitor及陰性對照共轉(zhuǎn)染瘢痕疙瘩成纖維細胞72 h，然后應用螢光素酶檢測試劑盒檢測螢光素酶活性。

1.2.7 CCK8法檢測細胞增殖狀況 將瘢痕疙瘩成纖維細胞以1.0×l04/ml密度接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100 μl，每組設8個復孔，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中過夜，吸去細胞上清液，加入無血清DMEM培養(yǎng)液100 μl靜置24 h，使其同步化。吸去培養(yǎng)板孔內(nèi)舊培養(yǎng)液，按分組加入含相應濃度藥品的培養(yǎng)液100 μl，空白對照組則直接加入 DMEM 液 100 μl。繼續(xù)培養(yǎng)，然后分別于不同時間點（24 h、36 h、48 h），每孔加入 CCK-8 10 μl，37℃繼續(xù)培養(yǎng) 4 h 后，在酶標儀波長490 nm處測定各孔吸光度（A）值，以A值大小表示細胞增殖能力。

1.2.8 流式細胞儀檢測細胞凋亡及周期情況 收集培養(yǎng)48 h后的瘢痕疙瘩成纖維細胞，PBS洗3次，將Annexin V-FITC 5 μL 加入細胞懸液 195 μl中，避光孵育 15 min，加入碘化丙啶（ PI） 5 μl，4℃避光反應5 min，然后用流式細胞儀檢測細胞凋亡率及細胞周期各時相DNA水平。

1.3 統(tǒng)計學方法

應用SPSS20.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，多樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，多樣本均數(shù)間的兩兩比較采用q檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖狀況

CCK8法檢測結(jié)果顯示，miR-21 mimic能明顯促進瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖，而五倍子瘢痕膏提取液能減弱這一作用且呈時間、濃度依賴性（圖1a）；miR-21 inhibitor能明顯抑制瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖，而五倍子瘢痕膏提取液能增強這一作用且呈時間、濃度依賴性（圖1b）。

圖1 各組瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖狀況

2.2 瘢痕疙瘩成纖維細胞凋亡及周期情況

流式細胞儀檢測結(jié)果顯示（n=8），MIM組、0.5 mg/ml Galla+MIM 組 及 1 mg/ml Galla+MIM 組 瘢 痕疙瘩成纖維細胞總凋亡率分別為3.13±0.78、5.10±1.02、8.19±1.26，均低于MOCK組（10.17±1.64），差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，圖2）；IN組、0.5 mg/ml Galla+IN 組及 1 mg/ml Galla+IN 組瘢痕疙瘩成纖維細胞總凋亡率分別為18.36±2.37、22.50±2.65、29.47±2.86，均高于MOCK組，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，圖2）。

細胞周期分析結(jié)果顯示，與MOCK組[G1期、S 期細胞比例分別為（57.7±5.8）%、（20.5±2.7）%]相比， MIM 組 [（32.8±3.2）%、（21.3±2.9）%]、0.5 mg/ml Galla+MIM 組 [（38.4±3.5）%、（19.5±2.5）%]及 1 mg/ml Galla+MIM 組 [（47.8±4.5）%、（15.6±2.2）%]G1期、S 期細胞比例降低；與MOCK相比，IN 組、0.5 mg/ml Galla+IN 組及 1 mg/ml Galla+IN 組G1期細胞比例 [分別為（67.6±5.8）%、（70.7±6.3）%、（75.5±6.8）%]明顯性增加，尤以 1 mg/ml Galla+MIM組增加明顯，而S 期細胞比例降低[分別為（12.4±2.4）%、（11.3±2.1）%、（15.8±3.2）%]（圖3）。

2.3 雙螢光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果

將野生型或突變型PTEN-3'UTR質(zhì)粒與miR-21 mimic、miR-21 inhibitor或陰性對照（miR-NC）共轉(zhuǎn)染到瘢痕疙瘩成纖維細胞中（n=8），然后檢測熒光素酶相對活性。結(jié)果顯示，共轉(zhuǎn)染野生型pmirGLO-PTEN-3'UTR-WT質(zhì)粒轉(zhuǎn)染時，miR-21 mimic能降低螢光素酶活性（0.28±0.07），而miR-21 inhibitor能增加螢光素酶活性（1.56±0.17），與陰性對照組（1.00±0.00）相比具有顯著性差異（P＜0.05，圖4）；而共轉(zhuǎn)染突變型pmirGLO-PTEN-3'UTR-MT質(zhì)粒，兩組螢光素酶活性（1.01±0.03、0.98±0.02）與陰性對照組（1.00±0.00）相比均無明顯變化（P＞0.05）。這提示 miR-21可直接結(jié)合于 PTEN 3'-UTR，靶控 PTEN的表達。

圖4 雙螢光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果

2.4 瘢痕疙瘩組織中miR-21、PTEN的表達

RT-PCR檢測結(jié)果顯示（n=8），與正常皮膚組織（0.73±0.04）相比，miR-21在瘢痕疙瘩組織中（1.76±0.13）表達明顯增加（P＜0.05，圖5a）；Western blot檢測結(jié)果顯示（n=8），與正常皮膚組織（2.13±0.21）相比，瘢痕疙瘩組織中（0.94±0.10）PTEN表達顯著降低（P＜0.05，圖5b，5c）。Pearson法相關(guān)性分析顯示，miR-21與PTEN 相對表達量呈負相關(guān)（r=-0.772，P＜ 0.05）。

圖5 正常皮膚組織和瘢痕疙瘩組織中miR-21及 PTEN表達

2.5 瘢痕疙瘩成纖維細胞中miR-21、PTEN mRNA的表達

RT-PCR檢測結(jié)果顯示（n=8），與MOCK組（1.00±0.00）相比，miR-21mRNA相對表達量在MIM組、0.5 mg/ml Galla+MIM 組及 1 mg/ml Galla+MIM 組（分別為8.13±0.97、6.26±0.86、4.37±0.81）中增加，尤以MIM組表達量增加明顯（P＜0.01，圖6a），而PTEN mRNA相對表達量（分別為0.29±0.04、0.44±0.06、0.68±0.08）降低，尤以MIM組表達量降低明顯（P＜0.05，圖6b）。與MOCK組（1.00±0.00）相比，miR-21mRNA相對表達量在IN組、0.5 mg/ml Galla+IN組及1mg/ml Galla+IN組（分別為0.69±0.08、0.45±0.07、0.28±0.04） 中 降 低， 尤 以 1 mg/ml Galla+IN組表達量降低明顯（P＜0.05，圖6c），而PTEN mRNA相對表達量（分別為8.85±1.04、10.39±1.26、12.99±1.82）增加，尤以 1 mg/ml Galla+IN組表達量增加明顯（P＜0.01，圖6d）。

圖6 各組瘢痕疙瘩成纖維細胞miR-21、PTEN mRNA相對表達量

2.6 瘢痕疙瘩成纖維細胞PI3K、PTEN、p-Akt、p-mTOR蛋白表達

Western Blot檢測結(jié)果顯示（n=8），PI3K 蛋白相對表達量在 MIM 組、0.5 mg/ml Galla+MIM 組及1mg/ml Galla+MIM 組分別為 0.80±0.07、0.87±0.08、0.88±0.11，與MOCK組（1.00±0.00）相比無明顯差異（P＞ 0.05），在 IN 組、0.5 mg/ml Galla+IN 組及 1 mg/ml Galla+IN 組分別為 1.02±0.17、0.95±0.15、0.95±0.14，與MOCK組（1.00±0.00）相比亦無明顯差異（P＞0.05，圖7a）。

圖7 各組瘢痕疙瘩成纖維細胞PI3K、PTEN、p-Akt、p-mTOR蛋白表達

與MOCK相比（1.00±0.00），MIM組、0.5 mg/ml Galla+MIM 組 及 1 mg/ml Galla+MIM 組 PTEN 蛋白相對表達量（分別為0.53±0.04、0.74±0.06、0.83±0.08）降低，尤以MIM組降低明顯（P＜0.05，圖 7b）；與 MOCK 相比（1.00±0.00）， MIM 組、0.5 mg/ml Galla+MIM組p-Akt蛋白相對表達量（分別為1.54±0.17、1.44±0.16）及p-mTOR蛋白相對表達量（分別為1.38±0.18、1.27±0.21）增加，而1 mg/ml Galla+MIM 組 p-Akt、p-mTOR 蛋白相對表達量（分別為0.87±0.08、0.78±0.09）降低（P＜0.05，圖 7c，7d）。

與 MOCK 相 比，IN 組、0.5 mg/ml Galla+IN 組及1 mg/ml Galla+IN組PTEN蛋白相對表達量（分別為1.53±0.18、2.07±0.31、2.23±0.36）增加，尤以 1 mg/ml Galla+MIM組增加明顯（P＜0.05，圖7e）；而p-Akt蛋白相對表達量（分別為0.83±0.07、0.69±0.05、0.36±0.03）及p-mTOR蛋白相對表達量（分別為0.63±0.06、0.52±0.05、0.46±0.02）降低，尤以 1 mg/ml Galla+MIM組降低明顯（P＜0.05，圖7f，7g）。

3 討論

中醫(yī)學認為瘢痕疙瘩屬“肉龜瘡”、“肉蜈蚣”、“蟹足腫”等范疇，其基本病機為“濕毒搏結(jié)，氣血瘀滯”，即機體素有濕濁內(nèi)蘊，復有金刀、火毒和蟲毒外襲，傷及肌膚，致營衛(wèi)不和，濕毒搏結(jié)，日久則經(jīng)絡痹阻，氣血瘀滯而成[10]。五倍子瘢痕膏是已故中醫(yī)皮膚科大家歐陽恒教授在這一病機理論指導下，以化瘀軟堅解毒法為組方原則創(chuàng)制而成（具體方藥為黑醋、五倍子、蜈蚣、丹參、威靈仙、地骨皮、白礬）。本課題組前期臨床研究表明五倍子瘢痕膏治療瘢痕疙瘩療效確切[3]。此外，前期實驗研究顯示五倍子瘢痕膏能抑制瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖[4]及膠原合成[11]，但具體作用機制尚不清楚。

有研究表明，miRNAs在瘢痕疙瘩瘢痕形成過程中起著重要作用[12]，其在病理性瘢痕與正常皮膚組織中存在著差異性表達[5,6]，其中miR-21在增生性瘢痕組織中表達顯著高于正常皮膚組織[7]。這提示miR-21與瘢痕疙瘩的發(fā)生有密切的關(guān)系。有研究證實miR-21可靶向抑制PTEN表達促進肺癌細胞增殖侵襲[8],而PTEN是具有磷酸酶活性的抑癌基因[13]，也是mTOR信號通路的一個重要負反饋調(diào)控因子。mTOR信號通路是調(diào)控蛋白質(zhì)合成的主要信號通路，與細胞增殖、分化密切相關(guān)。mTOR信號通路包括PI3K、PTEN、Akt、mTOR等關(guān)鍵分子，其中PTEN是負反饋調(diào)節(jié)因子。研究證實，mTOR基因與細胞異常增殖及腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，在多種腫瘤組織中表達明顯增強[14,15]。瘢痕疙瘩屬于良性實體瘤，可向周圍正常組織呈侵襲性生長，其組織病理特點與腫瘤極為相似，具有類腫瘤特性。因此，筆者推測在瘢痕疙瘩形成過程中mTOR信號通路具有重要的作用，且miR-21對該信號通路存在調(diào)控作用，而五倍子瘢痕膏抑制瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖可能與其通過miR-21靶向調(diào)控mTOR通路有關(guān)。

為證實以上科研假設，本課題組應用雙螢光素酶報告基因驗證了miR-21可直接結(jié)合于 PTEN 3'-UTR而靶向調(diào)控 PTEN的表達。RT-PCR及Western Blot檢測結(jié)果顯示，瘢痕疙瘩組織中miR-21高表達而PTEN低表達。CCK8法、流式細胞儀、RT-PCR、Western Blot等檢測結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染 miR-21 mimic 后瘢痕疙瘩成纖維細胞miR-21表達增加、PTEN表達降低及p-Akt、p-mTOR表達增加，且能明顯促進瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖并抑制其凋亡，而五倍子瘢痕膏提取液能減弱這一作用且呈濃度依賴性。轉(zhuǎn)染miR-21 inhibitor后瘢痕疙瘩成纖維細胞miR-21表達降低、PTEN表達增加及p-Akt、p-mTOR表達降低，且能明顯抑制瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖并促進其凋亡，而五倍子瘢痕膏提取液能增強這一作用且呈濃度依賴性。

以上研究結(jié)果表明，miR-21 可通過靶基因PTEN調(diào)控瘢痕疙瘩成纖維細胞mTOR信號通路關(guān)鍵分子p-Akt、p-mTOR的表達。而五倍子瘢痕膏抑制瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖的機制與其抑制miR-21表達進而上調(diào)mTOR信號通路中PTEN表達，從而抑制p-Akt、p-mTOR表達有關(guān)，這為五倍子瘢痕膏治療瘢痕疙瘩提供了理論依據(jù)。