響應面優(yōu)化超臨界CO2 萃取大果紫檀揮發(fā)油的工藝研究*

李寶志 李 鋒 樸永革 陳 明 佟亞楠

（吉林煙草工業(yè)有限責任公司技術研發(fā)中心，吉林 長春 130031）

大果紫檀（Pterocarpus macrocarpusKurz）為蝶形花科紫檀屬植物，別名緬甸花梨、草花梨，是最常見的花梨木類木材之一，原產(chǎn)于緬甸、泰國、老撾、柬埔寨和越南[1-3]。其心材是制作實木家具、高端樂器、美工飾品等的優(yōu)選材料[4-5]。樹皮和根可以入藥，味辛、性溫、無毒[6-7]，入脾、胃、肺經(jīng)。大果紫檀心材本身香氣濃郁，具有凝神和抗疲勞等作用，其含揮發(fā)油3%～5%，主要為萜烯、萜醇和類黃酮等多種活性成分，是貴重的藥材和名貴的香料[8-10]。大果紫檀心材在加工過程中，會產(chǎn)生大量的邊角料和刨花，未被有效利用，造成資源的浪費。利用這些加工產(chǎn)生的邊角料和刨花提取大果紫檀揮發(fā)油，作為特色天然植物香原料使用，可提高其經(jīng)濟實用價值[11-12]。

香料在刺激人類味覺和嗅覺神經(jīng)方面起到關鍵性的作用，已被廣泛應用于食品、日化、煙草、醫(yī)藥等行業(yè)[13-14]。天然香料因其制備工藝不同而性狀不同，分為精油、凈油、浸膏、酊劑、油樹脂等[15-16]。目前，傳統(tǒng)的香料提取方法雖然多樣，但在提取時會對草本植物中有效成分和香氣品質造成破壞，降低其有效成分的收率，同時增加生產(chǎn)成本[17-19]。因此，本文采用超臨界CO2萃取的方法提取大果紫檀揮發(fā)油成分，通過單因素試驗探究萃取溫度、萃取壓力、萃取時間等因素對提取效果的影響，采用響應面分析法優(yōu)化了揮發(fā)油工藝條件，并以氣相色譜-質譜法（GC-MS）對大果紫檀揮發(fā)油化學成分進行分離和鑒定，研究成果對于充分挖掘利用天然香源植物資源優(yōu)勢，研制開發(fā)新型特色天然植物香料具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

大果紫檀（心材）切片，由云南農(nóng)業(yè)大學（云南省高原特色農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)研究院）提供；CO2（食品級），純度≥99.9%，長春市氧氣廠；二氯甲烷為色譜純，德國Merck公司；水楊酸乙酯，純度≥98%，美國Sigma-Aldrich公司；無水硫酸鈉為分析純，北京化工廠。

1.2 設備

超臨界CO2萃取儀（HA220-50-06 型），南通市華安超臨界萃取有限公司； LG-1 食品型真空冷凍干燥機，北京松源華興科技公司；多功能粉碎機，上海兆申科技有限公司；氣相色譜-質譜聯(lián)用儀（Agilent 7890B/5977C），美國安捷倫公司；ML204T型電子分析天平，瑞士Mettler Toledo公司；超純水機（Milli-Qintegral 10），美國Millipore公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品制備

大果紫檀心材經(jīng)切片后，用食品型真空冷凍干燥機進行低溫干燥，干燥12 h后，用多功能植物粉碎機粉碎，過80 目篩網(wǎng)，即制得大果紫檀試樣。

1.3.2 超臨界萃取單因素試驗設計

采用單因素試驗，對影響大果紫檀揮發(fā)油得率的工藝條件進行優(yōu)化和分析。稱取200 g大果紫檀粉末置于超臨界CO2萃取釜（1 L）中，在一定萃取溫度、萃取壓力和萃取時間下進行提取，計算揮發(fā)油得率。

1.3.3 大果紫檀揮發(fā)油得率計算

式中：Y為揮發(fā)油得率，%；Mq為揮發(fā)油質量，g；My為大果紫檀粉末質量，g。

1.3.4 響應面法優(yōu)化超臨界萃取工藝條件

根據(jù)大果紫檀揮發(fā)油單因素試驗結果，確定萃取溫度（A）、萃取壓力（B）和萃取時間（C）為影響揮發(fā)油得率的3 個主要因素，運用Box-Behnken響應面法優(yōu)化試驗（Design-Expert8.0.6 軟件），以大果紫檀揮發(fā)油得率（Y）為響應面值，取最優(yōu)異的水平組合進行三因素三水平響應面試驗，試驗因素與水平見表 1。

表1 響應面試驗因素與水平Tab.1 Factors and levels used in response surface design

1.3.5 大果紫檀揮發(fā)油的GC-MS分析[20]

稱取0.01 g大果紫檀揮發(fā)油于50 mL具塞三角瓶中，依次加入二氯甲烷萃取劑10 mL和50 μL水楊酸乙酯內標溶液（濃度為10 mg/mL），混合均勻后進行無水硫酸鈉脫水處理，靜置至樣品分層，取下層溶液用0.45 μm微孔過濾膜過濾，備用。

采用氣質聯(lián)用對萃取得到的大果紫檀揮發(fā)油進行化學分析。GC-MS分析條件：Agilent HP-5MS毛細管色譜柱（30 m × 0.25 mm × 0.25 μm）；進樣體積：1 μL；分流比：不分流；流速：1.0 mL/min；進樣口溫度：250 ℃；程序升溫：起始溫度50 ℃保持2 min，以8 ℃/min的速率，升至240 ℃保持2 min，再以10 ℃/min的速率，升到270 ℃保持8 min；電離方式：電子轟擊；電離能量：70 eV；傳輸線溫度：250 ℃；離子源溫度：230 ℃；掃描范圍：40～400 m/z；使用Nist和Wiley譜庫檢索。

2 結果與分析

2.1 大果紫檀揮發(fā)油提取單因素試驗[21-22]

2.1.1 萃取溫度對揮發(fā)油得率的影響

稱取200 g大果紫檀粉末置于超臨界CO2萃取釜中，萃取壓力25 MPa，萃取時間90 min，研究在35、40、45、50、55、60 ℃不同溫度下?lián)]發(fā)油提取率的變化，結果如圖1 所示。由圖可知，在相同萃取壓力和萃取時間條件下，大果紫檀揮發(fā)油得率隨著萃取溫度的升高先增加后減少。35～45 ℃時，提取率隨著溫度的升高而快速增加；45～50 ℃時，提取率的增加速度趨于平緩；50 ℃后，提取率隨著溫度的升高呈現(xiàn)下降趨勢，并且得到的揮發(fā)油色澤變深、性狀較差，可能是溫度升高，導致了某些香氣物質和活性成分分解，同時心材中的色素、纖維和果膠等物質也被提取出來，使得揮發(fā)油得率略有下降。因此，萃取溫度選擇50 ℃為宜。

圖1 萃取溫度對揮發(fā)油提取率的影響Fig. 1 Effect of temperature on the extraction rate

2.1.2 萃取壓力對揮發(fā)油得率的影響

保持其他萃取條件一定，分別在15、20、25、30、35、40 MPa萃取壓力下進行揮發(fā)油的提取，結果如圖2所示。從圖中可見，揮發(fā)油得率隨著壓力的升高呈先增加后下降的趨勢。在15～25 MPa時，提取率隨著溫度的升高而急劇上升；在25～30 MPa時，揮發(fā)油得率增加趨于緩和；壓力超過30 MPa后，揮發(fā)油得率隨著壓力的升高反而下降。因此，萃取壓力選擇25 MPa為宜。

圖2 萃取壓力對揮發(fā)油提取率的影響Fig. 2 Effect of pressure on the extraction rate

2.1.3 萃取時間對揮發(fā)油得率的影響

保持其他萃取條件一定，在萃取時間分別為30、60、90、120、150、180 min條件下進行揮發(fā)油提取試驗，結果如圖3 所示。由圖可見，當萃取時間為90 min時，揮發(fā)油提取率最高；90 min以后，提取率隨時間變化稍有下降。因此，綜合考慮，確定萃取時間選為90 min。

圖3 萃取時間對揮發(fā)油提取率的影響Fig. 3 Effect of time on the extraction rate

2.2 大果紫檀揮發(fā)油提取響應面試驗

2.2.1 響應面試驗結果及分析[23-24]

響應面試驗結果如表2 所示。采用Box-Behnken設計方案對表2 中的優(yōu)化試驗結果進行回歸分析，對各因素進行回歸擬合，得到大果紫檀揮發(fā)油得率對萃取溫度(A)、萃取壓力(B)和萃取時間(C)的二次多項回歸方程：Y=3.84-0.100A+0.25B+0.028C-0.018AB-0.002 5AC+0.027BC-0.25A2-0.46B2-0.19C2。響應值的影響程度可由回歸方程中各項系數(shù)的大小來判斷，各因素對響應值的影響程度與二次回歸方程中各項系數(shù)的絕對值大小成正比關系，系數(shù)的正、負反映了影響方向。從回歸方程一次項系數(shù)可知，影響大果紫檀揮發(fā)油萃取因素的主次順序為：萃取壓力(B)＞萃取溫度(A)＞萃取時間(C)。

表2 Box-Behnken試驗設計及結果Tab.2 Box-Behnken experimental design and results

2.2.2 回歸方程及方差分析

回歸方程的方差分析和顯著性檢驗結果見表 3。

從表3 可知，回歸項中P值＜0.01，說明所選擇模型差異極顯著。失擬項P值為0.348 9，此失擬項差異不顯著(P＞0.05)。由此可知，該模型較顯著地擬合了萃取溫度、萃取壓力和萃取時間對揮發(fā)油得率的影響，該模型所得的二次回歸方程可代替試驗真實點對試驗結果進行分析。由此模型的決定系數(shù)R2Adj =0.959 6可知其具有較好的擬合程度，95.96 %的響應值變化可通過該模型解釋，因此該模型極顯著且準確，能夠很好地顯示大果紫檀揮發(fā)油的變化，較好地對揮發(fā)油得率進行預測。由表3 可知該二次回歸方程系數(shù)的顯著性，萃取溫度(A)、萃取壓力(B)、萃取溫度的二次項A2、萃取壓力的二次項B2、萃取時間的二次項C2對揮發(fā)油得率具有極顯著的影響；萃取時間(C)、萃取溫度與萃取壓力的交互項AB、萃取溫度與萃取時間的交互項AC、萃取壓力與萃取時間的交互項BC對揮發(fā)油得率影響不顯著。

表3 回歸模型方差分析表Tab.3 The analysis table of variance of regression model

2.2.3 響應面與等高線分析[25-27]

按照回歸模型繪制響應面和等高線圖，圖4～6 反映了萃取溫度、萃取壓力、萃取時間的相互效應之間的關系。

圖4 萃取溫度與萃取壓力交互作用對揮發(fā)油得率的影響Fig. 4 Interaction between extraction temperature and extraction pressure effects on the extraction rate of volatile oil

圖4 顯示了萃取時間位于中心水平時，萃取溫度(A)和萃取壓力(B)的交互作用對揮發(fā)油得率的影響。由圖4 可知，萃取溫度和萃取壓力對揮發(fā)油得率變化的影響較強，萃取溫度變化對揮發(fā)油得率的影響較大，表現(xiàn)為響應曲面圖形的坡度較陡和等高線較密；萃取壓力變化對揮發(fā)油得率的影響相對較弱，表現(xiàn)為響應曲面圖形坡度較緩和等高線較稀疏。

圖5 顯示了萃取壓力位于中心水平時，萃取溫度(A)和萃取時間(C)的交互作用對揮發(fā)油得率的影響。由圖5 可知，萃取溫度和萃取時間對揮發(fā)油得率變化的影響較弱，響應曲面坡度緩和；等高線趨于圓形，表明萃取溫度與萃取時間交互作用不顯著。

圖5 萃取溫度與萃取時間交互作用對揮發(fā)油得率的影響Fig. 5 Interaction between extraction temperature and extraction time effects on the extraction rate of volatile oil

圖6 顯示了萃取溫度位于中心水平時，萃取壓力(B)和萃取時間(C)的交互作用對揮發(fā)油得率的影響。由圖6 可知，萃取壓力和萃取時間對揮發(fā)油得率變化的影響相對較弱，萃取壓力對揮發(fā)油得率影響相對較小，表現(xiàn)為響應曲面坡度較緩，等高線較稀疏；萃取時間對揮發(fā)油得率變化的影響較大，響應曲面圖形的坡度較陡，等高線較密。

圖6 萃取壓力與萃取時間交互作用對揮發(fā)油得率的影響Fig. 6 Interaction between extraction pressure and extraction time effects on the extraction rate of volatile oil

2.2.4 驗證試驗分析

通過中心組合設計優(yōu)化提取條件，得到提取大果紫檀揮發(fā)油理想的工藝參數(shù)為萃取溫度48.94 ℃、萃取壓力26.40 MPa、萃取時間92.82 min，此時揮發(fā)油得率3.88%。考慮到試驗的可操作性和可行性，以萃取溫度50 ℃，萃取壓力25 MPa，萃取時間90 min進行3 次重復萃取試驗，測得得率為3.92%，與模型預測值較接近。因此，響應面法優(yōu)化得到超臨界CO2萃取大果紫檀揮發(fā)油的工藝參數(shù)準確、可靠。

2.3 大果紫檀揮發(fā)油成分分析

采用GC-MS對萃取的大果紫檀揮發(fā)油成分進行分析，結果如表4 所示。由總離子流圖可知，大果紫檀揮發(fā)油中含有的化合物種類較多，通過利用Nist和Wiley譜庫檢索和人工質譜分析2 種分析方法，綜合分析后共鑒定出22 種化學成分，主要成分為沉香螺醇、β-桉葉醇、7-(2-羥丙基)-1,4a-二甲基十氫萘-1-醇、桉油烯醇、3-(2,6,6-三甲基-1-環(huán)己烯-1-基)烯丙醇、1,3,3-三甲基-2-(2-甲基環(huán)丙基)-環(huán)己烯、高紫檀素、美迪紫檀素、紫檀素、3,9-二甲氧基-6H苯并呋喃[3,2-c][1]苯并吡喃等。

表4 大果紫檀揮發(fā)油成分的分析結果Tab.4 Analytical results of volatile oil from Pterocarpus macrocarpus Kurz

3 結論

本文采用超臨界CO2萃取大果紫檀揮發(fā)油成分，并通過單因素考察和響應面試驗確定適宜的提取工藝為萃取溫度50 ℃、萃取壓力25 MPa、萃取時間90 min，此時揮發(fā)油提取率為3.92%。所得回歸模型擬合程度較高。通過GC-MS鑒定得出，大果紫檀揮發(fā)油包含22 種化學成分，主要成分有沉香螺醇、β-桉葉醇、7-(2-羥丙基)-1,4a-二甲基十氫萘-1-醇、桉油烯醇、3-(2,6,6-三甲基-1-環(huán)己烯-1-基)烯丙醇、1,3,3-三甲基-2-(2-甲基環(huán)丙基)-環(huán)己烯、高紫檀素、美迪紫檀素、紫檀素、3,9-二甲氧基-6H苯并呋喃[3,2-c][1]苯并吡喃等。使用超臨界CO2萃取得到的大果紫檀揮發(fā)油味道獨特優(yōu)雅，木香、樹脂香和清香突出，且留香時間持久、綿延性好，在日化、食品、醫(yī)藥等行業(yè)中具有良好的應用價值。