金亮華， 劉官成， 王齡鶴， 閆姿安， 許唱,3， 元海丹,3*

(1.延邊神圣制藥有限公司；2.延邊大學(xué) 藥學(xué)院；3.延邊大學(xué)長白山天然藥物研究教育部重點實驗室；4.延邊大學(xué) 融合學(xué)院: 吉林 延吉 133002)

肥胖是一種由多因素引起的慢性代謝性疾病，通常表現(xiàn)為脂肪在體內(nèi)分布異常或堆積過多，進而導(dǎo)致體重增加.研究表明，肥胖容易導(dǎo)致高血脂癥、心血管疾病以及糖尿病等代謝疾病，現(xiàn)已成為全球重大公共衛(wèi)生問題之一[1-2].東莨菪內(nèi)酯(6-甲氧基-7-羥基香豆素)是存在于多種植物(如丁公藤(ErycibeobtusifoliaBenth.)[3]、紫花地丁(ViolaPhilippica.)[4]、茵陳蒿(Artemisiacapillaris)[5]、白芷(AngelicaeDahuricaeRadix)[6]、諾麗果[7]、紅薯[8]等)中的一種活性物質(zhì)，具有抗炎[9]、抗腫瘤[10]、抗氧化[11]、降血壓[12]和降血糖[4]等多種藥理作用.目前，關(guān)于東莨菪內(nèi)酯對調(diào)節(jié)脂肪代謝方面的研究較少，如東莨菪內(nèi)酯對脂肪肝的抑制作用雖已被證實，但其相關(guān)作用機制尚不完全清楚[13-15].為了進一步闡明東莨菪內(nèi)酯對小鼠脂肪代謝的調(diào)節(jié)機制，本文利用由45 kcal%高脂飼料(HFD)-誘導(dǎo)的肥胖小鼠模型探究東莨菪內(nèi)酯對肥胖小鼠脂肪積蓄的抑制作用及其機制.

1 材料與儀器

1.1 實驗材料

40只雄性ICR(institute of cancer research)小鼠(4周齡，體重為18～20 g)，長春億斯實驗動物技術(shù)有限公司；東莨菪內(nèi)酯，東京化成工業(yè)株式會社；水飛薊素、羧甲基纖維素鈉、中性甲醛固定液、油紅O、蘇木素(hematoxylin，H)、伊紅(eosin，E)、三羥甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸、溴化乙錠、異氟烷，Sigma-aldrich公司；O.C.T(optimal cutting temperature compound)冷凍切片包埋劑，Tissue Tek公司；中性樹膠、甘油明膠，Merck公司；甘油三酯(TG)、膽固醇(TC)測定試劑盒，南京建成生物工程研究所；總RNA提取試劑盒，iNtRON公司；M-MLV第一鏈cDNA合成試劑盒，Promega公司；ExTaq酶，大連寶生物工程有限公司；SREBP-1α、FAS、SCD1、PPAR-γ和aP2引物，上海Bioneer公司；瓊脂糖凝膠，Bio-rad公司；甲醇、乙醇、異丙醇、二甲苯、乙醚等均為分析純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司.

1.2 實驗儀器

分析天平，上海精天電子儀器有限公司；低速離心機，Eppendorf公司；多功能酶標儀，Tecan公司；組織勻漿機，上海弗魯克流體機械制造有限公司；冰凍切片機，Leica公司；倒置顯微鏡，Olympus公司；恒溫磁力攪拌器，上海司樂儀器廠；酸度計，上海奧豪斯儀器有限公司；-80 ℃超低溫冰箱，Sanyo公司；電泳儀，北京君意東方電泳設(shè)備有限公司；凝膠成像儀，UVP公司.

2 實驗方法

2.1 實驗動物分組與給藥方法

將40只適應(yīng)環(huán)境1周后的小鼠隨機分為5組(正常對照組(CON)、模型組(HF)、東莨菪內(nèi)酯高劑量組(HFH)、東莨菪內(nèi)酯低劑量組(HFL)和陽性對照組(水飛薊素，HFS))，每組8只.正常組飼以10 kcal%飼料，其他組均飼以45 kcal% HFD.共喂養(yǎng)小鼠13周，且在最后4周中每天灌胃給藥1次，其中CON組和HF組為質(zhì)量分數(shù)為0.5%的羥甲基纖維素鈉溶液，HFH組和HFL組分別為20 mg/kg和10 mg/kg的東莨菪內(nèi)酯，HFS組為30 mg/kg的水飛薊素.喂食前，東莨菪內(nèi)酯和水飛薊素分別用質(zhì)量分數(shù)為0.5%的羥甲基纖維素鈉溶液溶解.

2.2 血液指標的測定

給藥過程結(jié)束后，用異氟烷對小鼠進行麻醉，并以心臟穿刺法取全血.全血離心15 min(3 000 r/min，4 ℃)后取血清，然后再分別按照TG、TC試劑盒的操作說明進行操作.

2.3 組織病理學(xué)觀察

解剖小鼠，采集肝臟、肩胛骨棕色脂肪及白色附睪丸脂肪組織后，再取適當大小的組織分別用冷凍切片包埋劑包埋；用冷凍切片機將組織切成5 μm厚度的切片，然后對切片進行H&E染色和油紅O染色；完成染色后，在光學(xué)顯微鏡下觀察各染色切片組織的病理學(xué)變化.

2.3.1肝臟組織和脂肪組織的H&E染色

分別將切好的肝臟組織切片和附睪丸中的白色脂肪組織切片放入乙醚-乙醇溶液(V(乙醚)∶V(乙醇)=1∶1)中固定1 min，然后水洗(1 min)、H染色(肝臟組織1 min，附睪丸白色脂肪組織20 s)；水洗3 min后進行E染色(肝臟組織2 min，附睪丸白色脂肪組織40 s)；自來水沖洗10 min后用梯度乙醇(體積分數(shù)分別為70%、80%、90%、95%)進行脫水，然后用二甲苯溶液浸泡3 min后用中性樹膠封片.

2.3.2脂肪組織的油紅O染色

將切好的肝臟組織切片在室溫下用體積分數(shù)為10%的中性甲醛固定液固定5 min，然后用水沖洗10 min；在體積分數(shù)為60%的異丙醇溶液中浸泡5 min后用油紅O溶液染色5 min，然后再用體積分數(shù)為60%的異丙醇調(diào)色3 min；自來水沖洗3 min后進行H染色(3 s)，然后再用自來水沖洗5 min后用甘油明膠封片.

2.4 RT-PCR實驗

首先，采用Trizol一步法[16]提取小鼠白色附睪丸脂肪組織中的總RNA，并采用M-MLV第一鏈cDNA合成試劑盒完成逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng).然后，以合成的cDNA為模板，按照RT-PCR操作步驟對cDNA進行PCR擴增.PCR的反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性60 s，30個循環(huán)(每個循環(huán)為95 ℃變性5 s)，50 ℃(FAS)、55 ℃(PPAR-γ)、56 ℃(SCD1，SREBP-1α)、57 ℃(CPN)、60 ℃(aP2)退火30 s，72 ℃下延伸30 s.在72 ℃下繼續(xù)反應(yīng)10 min，然后將樣品在4 ℃下放置1 h.在100 V恒定電壓下用質(zhì)量分數(shù)為1%的瓊脂糖凝膠(含0.01%溴化乙錠)對樣品進行電泳，并用凝膠成像系統(tǒng)對凝膠進行掃描和拍攝.RT-PCR的引物序列見表1.

表1 RT-PCR的引物序列

2.5 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 24.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析.實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準偏差(mean±S.D)表示，兩組樣本比較采用t檢驗，以P< 0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義.

3 結(jié)果與分析

3.1 東莨菪內(nèi)酯對小鼠血液指標的影響

表2為ICR小鼠的血液指標.由表2可以看出：與CON組相比，HF組小鼠的TG和TC水平分別增高了98.8%和38.6%；與HF組相比，HFH組和HFL組的TG水平呈劑量依賴性地顯著降低了47.0%和26.2%，TC的水平呈劑量依賴性地降低了17.0%和5.3%.以上結(jié)果說明，東莨菪內(nèi)酯對HFD-誘導(dǎo)的小鼠血脂水平具有良好的改善作用.

3.2 小鼠脂肪組織的病理形態(tài)學(xué)觀察

為了觀察東莨菪內(nèi)酯對HFD-誘導(dǎo)的肥胖小鼠脂肪積蓄的抑制作用，對小鼠肝臟組織的冰凍切片進行H&E染色和油紅O染色，對小鼠的肩胛骨棕色脂肪組織和白色附睪丸脂肪組織的冰凍切片進行H&E染色，結(jié)果如圖1所示.由圖1可以看出，在CON組小鼠的肝臟組織中無明顯的脂滴存在，而在HF組小鼠的肝臟組織中存在較多的脂滴；東莨菪內(nèi)酯給藥組和HFS組小鼠肝臟組織中的脂滴數(shù)量比HF組小鼠肝臟組織中的脂滴數(shù)量顯著減少，且東莨菪內(nèi)酯給藥組小鼠肝臟組織中的脂滴數(shù)量明顯少于HFS組.上述結(jié)果說明，東莨菪內(nèi)酯可劑量依賴性地抑制HFD-誘導(dǎo)的肥胖小鼠的脂肪在肝臟中的積蓄.

圖1 東莨菪內(nèi)酯對小鼠肝臟組織的病理形態(tài)學(xué)影響(放大倍數(shù)×200)

圖2(A)為小鼠肩胛骨脂肪組織(棕色)和附睪丸脂肪組織(白色)的H&E染色結(jié)果.由圖2(A)可以看出，與CON組小鼠的單個脂肪細胞的面積相比，HF組小鼠的單個脂肪細胞的面積明顯增大，而東莨菪內(nèi)酯給藥組及HFS組小鼠的單個脂肪細胞的面積有所減小，且東莨菪內(nèi)酯給藥組小鼠的單個脂肪細胞的面積小于HFS組小鼠的單個脂肪細胞面積.圖2(B)為對白色附睪丸脂肪組織的細胞大小進行統(tǒng)計的結(jié)果.從圖2(B)可以看出：在CON組中，附睪丸脂肪組織的細胞直徑小于400 μm的比例占總細胞數(shù)的96.4%.在HF組中，附睪丸脂肪組織的細胞直徑大于400 μm的比例占總細胞數(shù)的31.5%，而直徑小于200 μm的細胞比例低于總細胞數(shù)量的13.5%.在HFH組中，附睪丸脂肪組織的細胞直徑大于400 μm的比例低于總細胞數(shù)量的1.8%，而直徑小于200 μm的比例高于總細胞數(shù)量的53.6%.在HFL組及HFS組中，附睪丸脂肪組織的細胞直徑大于400 μm的細胞比例分別占總細胞數(shù)量的26.3%和30.1%，而小于200 μm的細胞比例分別占總細胞數(shù)量的14.9%和18.0%.上述結(jié)果說明，東莨菪內(nèi)酯可劑量依賴性地抑制HFD-誘導(dǎo)的肥胖小鼠的脂肪在肩胛骨組織和附睪丸組織中的積蓄.

圖2 東莨菪內(nèi)酯對小鼠脂肪組織的病理形態(tài)學(xué)影響(放大倍數(shù)×200)

3.3 東莨菪內(nèi)酯對小鼠附睪丸脂肪組織的基因表達影響

固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1α(SREBP-1α)是一類位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的膜連接蛋白，是參與脂肪合成的主要轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，并可以對參與脂肪酸合成的下游靶基因FAS和SCD1進行調(diào)控[17].過氧化物酶體增殖活化體受體-γ(PPAR-γ)是脂肪細胞分化的關(guān)鍵調(diào)控因子，它不僅使脂肪細胞數(shù)量增加，還能夠促進脂肪細胞TG的合成；aP2為PPAR-γ的下游,它與脂類儲存及脂類代謝的靶基因調(diào)節(jié)相關(guān)[18].脂肪組織中的SREBP-1α、FAS、SCD1、PPAR-γ、aP2基因表達增多說明脂肪的合成能力增強.由圖3可以看出，與CON組的小鼠相比，HF組小鼠的白色附睪丸脂肪組織中的SREBP-1α、FAS、SCD1、PPAR-γ及aP2基因表達增多，而東莨菪內(nèi)酯給藥組的上述基因表達明顯呈劑量依賴性地減少，即東莨菪內(nèi)酯能夠通過下調(diào)SREBP-1α、FAS、SCD1、PPAR-γ、aP2基因的表達來減少脂肪在小鼠附睪丸組織中的積蓄.

圖3 東莨菪內(nèi)酯對小鼠附睪丸脂肪組織基因表達的影響

4 結(jié)論

本文實驗結(jié)果表明，東莨菪內(nèi)酯對HFD-誘導(dǎo)的肥胖小鼠的血脂及其脂肪積蓄具有良好的改善作用，同時可顯著減小小鼠附睪丸脂肪組織的細胞大小.此外，東莨菪內(nèi)酯還能夠下調(diào)小鼠附睪丸脂肪組織中與脂肪合成有關(guān)基因(SREBP-1α、FAS、SCD1、PPAR-γ、aP2)的表達.本文結(jié)果可為東莨菪內(nèi)酯在預(yù)防或治療肥胖方面的藥物開發(fā)提供理論基礎(chǔ).