山藥-蛹蟲草雙向發(fā)酵的抗氧化活性增效性

李慧星，周永康，方佩琦，鄭立霖，哈海洋，許 彬,*

（1.南陽理工學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院，河南 南陽 473004；2.河南省工業(yè)微生物資源與發(fā)酵技術(shù)重點實驗室，河南 南陽 473004）

山藥（Dioscorea oppositifoliaL.）是傳統(tǒng)的藥食同源食物，是《中華本草》收載的草藥[1]，山藥提取物具有抗氧化活性，可用于清除自由基[2-5]。山藥中富含淀粉、纖維素等物質(zhì)[1]，可以用作食藥用真菌發(fā)酵底物。楊海龍等[6]以山藥作為碳源通過液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)靈芝，當山藥用量為3%（質(zhì)量分數(shù)）時，靈芝菌體生物量可達2.05 g/100 mL。于匯等[7]以山藥等中藥材和糧食原料進行搭配，經(jīng)猴頭菌發(fā)酵后制成飲料，產(chǎn)品的藥用作用明顯。張志才等[8]將蛹蟲草接種于山藥和其他糧食成分組成的基質(zhì)上進行固態(tài)發(fā)酵，生產(chǎn)功能性食品。

蛹蟲草又名北冬蟲夏草，是一種常用的食藥用真菌，能代謝產(chǎn)生核苷類、多糖類、甾醇、氨基酸等生物活性物質(zhì)[9]，且蟲草素含量和抗氧化活性高于冬蟲夏草[10-11]。

本研究基于莊毅等[12]提出的“雙向發(fā)酵”概念，以山藥為基質(zhì)，以蛹蟲草為發(fā)酵真菌進行固態(tài)發(fā)酵。山藥可以為蛹蟲草菌絲生長代謝提供營養(yǎng)物質(zhì)，蛹蟲草的酶系能夠改變山藥成分組成和空間結(jié)構(gòu)，最終使得發(fā)酵后的山藥可能在某一活性上獲得增效，即發(fā)酵具有“雙向性”，發(fā)酵所得的山藥-蛹蟲草-代謝產(chǎn)物混合物稱為菌質(zhì)。本實驗通過測定菌質(zhì)和山藥的超氧陰離子自由基（O2－?）清除率、2,2-二苯基-1-苦基肼（2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除率和羥自由基（?OH）清除率來評價兩者的抗氧化活性差異，并通過抗氧化活性成分含量的測定、高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）指紋圖譜、掃描電子顯微鏡（scanning electron microscopy，SEM）和傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR）儀分析研究菌質(zhì)和山藥存在抗氧化活性差異的原因，為將山藥-蛹蟲草菌質(zhì)開發(fā)成相關(guān)抗氧化食品提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

山藥 南陽市萬德隆超市；蛹蟲草14013 中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；葡萄糖、水楊酸、無水乙醇、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、三羥甲基氨基甲烷、鹽酸、連苯三酚、氯仿（均為分析純） 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；VB1北京酷來搏科技有限公司；瓊脂粉北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司；DPPH（分析純）、蟲草素標準品（色譜純）、薯蕷皂苷標準品（色譜純）合肥博美生物科技有限責任公司；乙腈、甲酸（色譜純） 上海麥克林生化科技有限公司；溴化鉀（光譜純） 天津中世沃克科技發(fā)展有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

PHS-3C精密酸度計 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；TU-1901雙光束紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；LCD250N超聲波細胞破碎機上海冠森生物科技有限公司；FreeZone?TriadTM2.5L真空冷凍干燥機 美國LABCONCO有限公司；LRHS-300-II恒溫恒濕培養(yǎng)箱、HH.S11-4-S控溫水浴鍋上海躍進醫(yī)療器械有限公司；LDZX-30FB立式滅菌器上海申安醫(yī)療器械有限公司；LC1260 HPLC儀（配有二極管陣列檢測器） 美國安捷倫公司；180EII超聲波清洗器 寧波海曙科生超聲設(shè)備有限公司；RE-52C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；Spectrum TWO FTIR儀美國Perkin-Elmer公司；SU8000 SEM 日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 山藥-蛹蟲草菌質(zhì)的發(fā)酵

山藥-蛹蟲草菌質(zhì)的發(fā)酵方法參考文獻[13]。山藥洗凈、切碎，得到邊長2～3 mm左右的正方體顆粒、自然晾干至水分質(zhì)量分數(shù)10%左右。實驗分為接種組和空白對照組，每組3 個平行培養(yǎng)瓶，在每個培養(yǎng)瓶中分裝山藥33.7 g、蒸餾水37.2 mL，拌勻，浸潤2 h。將裝有山藥的培養(yǎng)瓶置于121 ℃下滅菌30 min。蛹蟲草菌種在馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基固體平板上于溫度25 ℃、相對濕度75%條件下培養(yǎng)10 d后，從平板上刮取邊長0.8 cm的正方形蛹蟲草菌苔接種于裝有山藥的培養(yǎng)瓶中，每個培養(yǎng)瓶接種13 個邊長0.8 cm的正方形蛹蟲草菌苔。接種后在溫度25 ℃、相對濕度75%的條件下發(fā)酵生產(chǎn)山藥-蛹蟲草菌質(zhì)。實驗以不接種蛹蟲草菌種的山藥作為空白對照。

1.3.2 提取物的制備

提取物的制備參考文獻[14]。1）蛹蟲草菌絲提取物的制備：蛹蟲草菌種在馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基固體平板培養(yǎng)10 d后，刮取邊長約0.8 cm的正方形菌苔10 塊，用研缽將菌苔研碎，用50 mL乙醇將研碎菌苔洗至圓底燒瓶中，在70 ℃水浴中回流提取1 h，濾去固體后將乙醇蒸干，再加入色譜級乙腈溶解，定容至5.0 mL。采用0.22 μm濾膜過濾溶液后備用。2）菌質(zhì)提取物的制備：山藥-蛹蟲草菌質(zhì)冷凍干燥后稱取1.0 g，加入50 mL乙醇超聲處理（250 W、25 min），然后在70 ℃水浴中回流提取1 h，濾去固體后將乙醇提取液濃縮干燥，加入色譜級乙腈溶解，定容至10 mL。采用0.22 μm濾膜過濾溶液后備用。

1.3.3 自由基清除率的測定

以自由基清除率表征菌質(zhì)的抗氧化活性，其中?OH清除率的測定參考文獻[15]，DPPH自由基清除率的測定參考文獻[16]，O2－?清除率的測定參考文獻[17]。

1.3.4 抗氧化活性成分含量的測定

總酚含量的測定參考文獻[18]，總黃酮含量的測定參考文獻[19]，總皂苷含量的測定參考文獻[20]，總多糖含量的測定參考文獻[21]。

1.3.5 HPLC指紋圖譜分析

色譜條件：InfinityLab Poroahell C18色譜柱（4.6 mm×100 mm，4 μm）；檢測波長260 nm；柱溫35 ℃；進樣量10 μL；流動相A為體積分數(shù)0.1%甲酸-水溶液，流動相B為乙腈；流速0.8 mL/min。梯度洗脫程序見表1。

表1 HPLC梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program of HPLC

1.3.6 SEM觀察

樣品在60 ℃下干燥至恒質(zhì)量，粉碎過100 目篩后以SEM觀察分析菌質(zhì)的表面形態(tài)和結(jié)構(gòu)。

1.3.7 FTIR分析

樣品在60 ℃下干燥至恒質(zhì)量，粉碎過100 目篩后采用溴化鉀壓片法制備試樣。FTIR在波數(shù)4 000～450 cm－1范圍內(nèi)分析，掃描16 次，分辨率4 cm－1。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Excel 2016和SPSS 22.0對數(shù)據(jù)進行處理、繪圖和差異顯著性分析，采用最小顯著極差法（least significant ranges，LSR）進行多重比較，P＜0.05說明差異顯著。實驗結(jié)果除有特殊說明外，均為3 次實驗平均值±標準偏差。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌質(zhì)的抗氧化活性

由圖1可知，山藥-蛹蟲草雙向發(fā)酵過程中，菌質(zhì)對各種自由基的清除率隨發(fā)酵時間延長而提高，在發(fā)酵前2 d，菌質(zhì)自由基清除率變化不顯著（P＞0.05），而在發(fā)酵2～8 d，菌質(zhì)自由基清除率有明顯提高，在發(fā)酵時間達到8 d以后，菌質(zhì)自由基清除率總體來說變化不顯著（P＞0.05）。在發(fā)酵前2 d，菌絲剛萌發(fā)，在基質(zhì)中局部分布（圖2A），因此菌質(zhì)整體的抗氧化活性未發(fā)生明顯改變。當發(fā)酵8 d后，菌絲已經(jīng)基本布滿基質(zhì)（圖2B），發(fā)酵接近終點時菌質(zhì)的抗氧化活性基本穩(wěn)定，相對于發(fā)酵初期有顯著提高（P＜0.05），說明菌質(zhì)的抗氧化活性與菌絲的生長存在一定相關(guān)性。

圖1 菌質(zhì)抗氧化活性隨培養(yǎng)時間的變化Fig. 1 Change in antioxidant activity of Chinese yam during fermentation

圖2 山藥-蛹蟲草菌質(zhì)表觀情況Fig. 2 Apparent situation of Chinese yam fermented with Cordyceps militaris

發(fā)酵結(jié)束后山藥和菌質(zhì)的抗氧化活性如表2所示。菌質(zhì)的各項自由基清除率均顯著高于山藥的自由基清除率（P＜0.05），說明山藥經(jīng)蛹蟲草發(fā)酵后得到的菌質(zhì)其抗氧化活性明顯提高。因此，可以認為山藥-蛹蟲草雙向發(fā)酵在抗氧化活性方面具有增效性。

表2 山藥和菌質(zhì)的自由基清除率Table 2 Free radical scavenging rates of Chinese yam and Chinese yam fermented with Cordyceps militaris

2.2 山藥和菌質(zhì)的抗氧化活性成分含量分析結(jié)果

除總多糖外，菌質(zhì)中各種抗氧化活性成分含量均顯著高于山藥（P＜0.05）（表3），這與張志才等[8]的研究結(jié)果一致。山藥-蛹蟲草雙向發(fā)酵后菌質(zhì)總多糖含量降低，這是由于蛹蟲草在發(fā)酵過程中分解利用了山藥中總多糖。山藥-蛹蟲草雙向發(fā)酵后，菌質(zhì)中總酚、總黃酮和總皂苷含量顯著提高（P＜0.05），因此菌質(zhì)的抗氧化活性高于山藥的抗氧化活性。

表3 山藥和菌質(zhì)的抗氧化活性成分含量Table 3 Contents of antioxidants in Chinese yam and Chinese yam fermented with Cordyceps militaris

2.3 HPLC指紋圖譜分析結(jié)果

山藥-蛹蟲草菌質(zhì)、蛹蟲草菌絲提取物的HPLC指紋圖譜如圖3所示。蟲草素標準品和薯蕷皂苷標準品的HPLC圖如圖4、5所示。對圖3～5中的特征峰進行統(tǒng)一編號，并將編號標注于各圖中。

圖3 菌質(zhì)、山藥和蛹蟲草菌絲提取物HPLC指紋圖譜Fig. 3 HPLC fingerprints of the extracts of Chinese yam fermented with Cordyceps militaris, Chinese yam and Cordyceps militaris mycelium

圖4 蟲草素標準品的HPLC圖Fig. 4 HPLC chromatogram of cordycepin reference substance

由圖3可知，17號峰在各種樣品的提取物中均存在，該峰分離度較好且穩(wěn)定，因此選擇該峰為參照峰。以其峰面積和保留時間為基準，分別計算各提取物中其他成分的峰面積和保留時間與17號峰面積和保留時間的比值，記為相對峰面積和相對保留時間[22-23]，如表4所示。

表4 HPLC指紋圖譜特征峰的相對保留時間和相對峰面積Table 4 Relative retention times and relative peak areas of characteristic peaks in HPLC fingerprints

由圖3和表4可知，4、7、11、15號峰在山藥和蛹蟲草菌絲中均未出現(xiàn)，參考潘揚等[24]對HPLC圖譜中新物質(zhì)的判定方法，可以認為這4 種物質(zhì)是山藥-蛹蟲草雙向發(fā)酵后生成的新物質(zhì)。3、12、23、24號峰在菌質(zhì)和蛹蟲草菌絲中出現(xiàn)，而在山藥中未出現(xiàn)，表明這4 種成分是蛹蟲草發(fā)酵后生成的物質(zhì)，進一步與圖4對比分析，3號峰對應(yīng)的物質(zhì)為蟲草素。5、8、9、13、14、16號峰在菌質(zhì)、山藥中均有出現(xiàn)，但菌質(zhì)中這6 種物質(zhì)的相對峰面積相明顯減小，9、13號峰相對峰面積減小尤為明顯，說明這幾種成分被蛹蟲草代謝分解或轉(zhuǎn)化為其他成分。圖3山藥中的1號峰和10號峰在菌質(zhì)中沒有檢測到，可能是由于蛹蟲草的代謝作用改變了這兩種物質(zhì)的結(jié)構(gòu)。17～22號峰（保留時間為74.3～87.5 min）在菌質(zhì)、山藥、蛹蟲草菌絲中均有出現(xiàn)，與圖5對比可知，保留時間在該范圍內(nèi)的物質(zhì)應(yīng)為五環(huán)三萜類化合物。由于蛹蟲草菌絲是以馬鈴薯培養(yǎng)基培養(yǎng)的，而該培養(yǎng)基的主要成分為馬鈴薯提取液。馬鈴薯中含有三糖五環(huán)三萜類化合物，與薯蕷皂苷具有相同的骨架結(jié)構(gòu)[25-26]，因此在HPLC指紋圖譜中與薯蕷皂苷的保留時間接近，且相對峰面積也接近。在從馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基斜面上分離蛹蟲草菌絲時有培養(yǎng)基殘留，因此圖3各物質(zhì)提取物中都出現(xiàn)了五環(huán)三萜類化合物的特征峰。由以上分析可知，菌質(zhì)和山藥的成分存在較大差異，菌質(zhì)因蛹蟲草的代謝作用產(chǎn)生了山藥中原本不存在的物質(zhì)，并改變了山藥中原有成分的含量，這可能是菌質(zhì)抗氧化活性高于山藥的另一個原因。

圖5 薯蕷皂苷標準品的HPLC圖Fig. 5 HPLC chromatogram of dioscin reference substance

2.4 山藥和菌質(zhì)的SEM圖觀察結(jié)果

由圖6A可知，山藥表面有褶皺，形態(tài)完整、連續(xù)。由圖6B可知，菌質(zhì)的形態(tài)和結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，山藥基質(zhì)的表面附著有蛹蟲草菌絲體，表面褶皺減少、形態(tài)不再完整，有碎片分布。說明山藥的完整結(jié)構(gòu)因蛹蟲草菌絲的生長和分解作用而被破壞，活性物質(zhì)更加容易提取，這也是菌質(zhì)抗氧化活性提高的原因之一。

圖6 山藥（A）和菌質(zhì)（B）的SEM圖Fig. 6 SEM images of Chinese yam (A) and Chinese yam fermented with Cordyceps militaris (B)

2.5 山藥和菌質(zhì)的FTIR分析結(jié)果

山藥和菌質(zhì)的FTIR結(jié)果如圖7所示。山藥和菌質(zhì)的FTIR圖在2 000～1 845 cm－1和710～576 cm－1范圍內(nèi)有差異。苯環(huán)上有取代基的物質(zhì)在2 000～1 660 cm－1內(nèi)存在低強度的特征吸收峰，環(huán)醚在該區(qū)域也存在低強度的多個吸收峰[27]，結(jié)合多酚類化合物的分子結(jié)構(gòu)以及劉琪[28]關(guān)于橡子果仁多酚研究的紅外光譜圖，推斷圖7中2 000～1 845 cm－1區(qū)域內(nèi)的吸收峰是由多酚中的共軛雙鍵（C＝C）和鄰取代芳烴（C－H）結(jié)構(gòu)的伸縮振動產(chǎn)生的。菌質(zhì)相比山藥在2 000～1 845 cm－1區(qū)域的吸收峰更明顯。結(jié)合總酚測定結(jié)果，推斷這種差異可能是由于蛹蟲草發(fā)酵山藥后產(chǎn)生了更多的多酚類物質(zhì)。1 650～500 cm－1范圍內(nèi)的吸收峰屬于山藥的特征吸收峰[29-30]，860～500 cm－1范圍內(nèi)的吸收峰主要是由多糖、纖維素、皂苷中糖苷鍵振動產(chǎn)生的[30-32]。比較山藥和菌質(zhì)的FTIR圖發(fā)現(xiàn)，710～576 cm－1范圍內(nèi)菌質(zhì)的吸收峰數(shù)量減少而吸收強度略有增加，這可能是由于山藥中的多糖、纖維素等作為碳源被菌絲所代謝，而一部分降解產(chǎn)物被菌絲用于合成了更多的皂苷。根據(jù)山藥和菌質(zhì)的FTIR圖變化可以推斷，蛹蟲草能夠分解山藥中的組分供自身生長，而產(chǎn)生的代謝物對菌質(zhì)的抗氧化活性具有貢獻作用，即山藥-蛹蟲草發(fā)酵體系具有雙向性，并對山藥抗氧化活性具有增效作用。

圖7 山藥和菌質(zhì)的FTIR圖Fig. 7 FTIR spectra of Chinese yam and Chinese yam fermented with Cordyceps militaris

3 結(jié) 論

山藥經(jīng)蛹蟲草雙向發(fā)酵后，菌質(zhì)的各項自由基清除率明顯高于山藥，說明菌質(zhì)的抗氧化活性優(yōu)于山藥，山藥-蛹蟲草雙向發(fā)酵體系在抗氧化活性方面具有增效性。菌質(zhì)成分的種類和含量變化、菌質(zhì)結(jié)構(gòu)變化是產(chǎn)生抗氧化活性增效性的主要原因。由活性成分含量分析可知，山藥-蛹蟲草菌質(zhì)中總酚、總黃酮和總皂苷含量明顯高于山藥；由HPLC指紋圖譜分析結(jié)果可知，山藥-蛹蟲草菌質(zhì)提取物的HPLC指紋圖譜與山藥提取物圖譜有明顯不同，不僅產(chǎn)生了一些山藥中不存在的新成分，而且山藥中原有成分的含量也發(fā)生明顯變化。由SEM分析結(jié)果可知，蛹蟲草對山藥的空間結(jié)構(gòu)有分解破壞作用，利于蛹蟲草利用山藥基質(zhì)生成活性物質(zhì)。由FTIR分析結(jié)果可知，蛹蟲草代謝了山藥中的多糖、纖維素等碳源物質(zhì)，生成了多酚類物質(zhì)等。結(jié)果表明菌質(zhì)成分的種類和含量變化、菌質(zhì)結(jié)構(gòu)變化是產(chǎn)生抗氧化活性增效性的主要原因。