響應(yīng)面法優(yōu)化輔助降糖降脂的海藻果蔬提取物復(fù)配配方

周賽楠，張 青，王發(fā)合，王曉梅，李兆杰，薛長湖,3，唐慶娟,*

（1.中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266100；2.青島明月海藻集團有限公司，海藻活性物質(zhì)國家重點實驗室，山東 青島 266400；3.青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點國家實驗室海洋藥物與生物制品功能實驗室，山東 青島 266237）

如今超重和肥胖成為一種全球性的“流行病”，中國已成為世界上肥胖人口最多的國家[1]。肥胖使人易患冠心病[2]、高血壓[3]、內(nèi)分泌及代謝性疾病[4]。肥胖者患病率比常人高，如患糖尿病的概率約為常人的5 倍[5]。部分肥胖患者服用減肥和降脂藥來達(dá)到減肥降脂的目的，然而這些藥物都具有較為明顯的副作用，如運用最多的減肥藥奧利司他會導(dǎo)致服用者體內(nèi)脂溶性維生素缺乏[6]、肝臟損傷[7]、形成油性便[8]。他汀類降脂藥物會損害人體肌肉和肝臟[9]。這些藥物不能滿足如今人類對健康的要求。因此，研發(fā)輔助減肥、降糖降脂的綠色天然健康食品及配方來代替減肥降脂藥物是食品科學(xué)與人類健康領(lǐng)域的重要研究課題之一，也是當(dāng)下的研究熱點。

近年來海洋生物資源漸漸被開發(fā)利用。海藻產(chǎn)量豐富、易獲得，是一種具有食藥兩用價值的海洋生物資源[10]。來自海藻的許多天然產(chǎn)物具有抗炎、降血脂、降血糖等活性[11]。羊棲菜（Sargassum fusiforme）是褐藻門馬尾藻科馬尾藻屬植物，在我國沿海地帶均有分布，是一種低脂低熱、高蛋白、高膳食纖維和富含礦物元素的天然食品[12]。研究發(fā)現(xiàn)羊棲菜具有抗氧化、抗癌和減肥等功效[13]。與此同時，對果蔬中天然產(chǎn)物的開發(fā)利用也越來越多。從姜科植物姜黃中提取的姜黃素是一種常見的食用色素，具有抗氧化、抗炎等功能，還可以調(diào)節(jié)體內(nèi)脂質(zhì)代謝[14]。從石榴皮中提取的多酚物質(zhì)安石榴苷在抗炎抗癌等方面具有重要作用，同時也具有降脂減肥的功效[15]。這些海藻、果蔬來源的天然產(chǎn)物安全無毒、無害、社會認(rèn)可度高[16]。利用上述海藻、果蔬開發(fā)輔助降糖降脂的綠色天然健康食品及配方對自然資源開發(fā)利用和人類健康都具有重要意義。

從天然產(chǎn)物中篩選糖脂代謝關(guān)鍵酶抑制劑，是開發(fā)輔助降糖降脂食品的有效途徑[17]。α-葡萄糖苷酶是碳水化合物消化吸收的關(guān)鍵酶，將淀粉、蔗糖等水解為單糖后被吸收進(jìn)入血液[18]。胰脂肪酶是人體脂質(zhì)消化的關(guān)鍵酶，能夠?qū)⒅|(zhì)大分子分解成小分子、形成乳糜微粒吸收入腸[19]。精準(zhǔn)靶向抑制α-葡萄糖苷酶和胰脂肪酶活性，可抑制葡萄糖和脂質(zhì)的吸收，控制血糖[20]、減少脂質(zhì)攝入[21]。Wang等[22]使用響應(yīng)面法以α-葡萄糖苷酶和二肽基肽酶-4的體外抑制活性為評價指標(biāo)優(yōu)化配方，動物實驗顯示配方能顯著降低肥胖小鼠的血糖水平，改善了糖耐量。由此可知消化代謝酶抑制活性可以作為配方設(shè)計的依據(jù)[23]。因此本實驗以羊棲菜水提物為主，姜黃、石榴提取物（姜黃素、安石榴苷）為輔，以體外α-葡萄糖苷酶和胰脂肪酶抑制率為依據(jù)，通過響應(yīng)面法優(yōu)化輔助降糖降脂的配方，為開發(fā)輔助降糖降脂的保健食品提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羊棲菜（Sargassum fusiforme）采摘自浙江溫州沿海。

α-葡萄糖苷酶、阿卡波糖（純度≥98%）、對硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷（p-nitrophenol-α-D-glucopyranoside，PNPG）、奧利司他（純度≥98%）上海源葉生物科技有限公司；豬胰脂肪酶、4-甲基傘形酮油酸酯（4-methylumbelliferyl oleate，4-MUO）美國Sigma公司；姜黃素（純度95%） 河北天旭生物科技有限公司；安石榴苷（純度98%） 四川維克奇生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

GIPP-4000FD真空冷凍干燥機 上海繼譜電子科技有限公司；N-1100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海愛朗儀器有限公司；MR-23i型高速冷凍離心機 法國Jouan公司；MB100-4A微孔板恒溫孵育器 常州邁科諾儀器有限公司；Milli-Q超純水系統(tǒng) 美國Millipore公司；Sunrisebasic酶標(biāo)儀 瑞士Tecan公司。

1.3 方法

1.3.1 羊棲菜水提物制備

將真空冷凍干燥的羊棲菜樣品室溫下水中浸泡10 h，研磨粉碎，以料液比1∶50將羊棲菜粉末與蒸餾水混合均勻，85 ℃水浴攪拌6 h[24]。將提取液在室溫下以4 500 r/min離心15 min，隨后收集上清液進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，至冷凝管無水滴流下時轉(zhuǎn)移到恒溫箱中35 ℃烘干，獲得的干燥粉末即為羊棲菜水提物。

1.3.2α-葡萄糖苷酶活力測定

采用PNPG比色法進(jìn)行測定，參考文獻(xiàn)[25]并稍作修改。測定原理為α-葡萄糖苷酶與PNPG底物反應(yīng)會產(chǎn)生有色物質(zhì)。用磷酸鹽緩沖液（pH 6.8）溶解樣品（各單獨的配方組分、復(fù)合配方組分）得到質(zhì)量濃度分別為2.5、2、1.5、1、0.5 mg/mL的溶液。實驗在96 孔酶標(biāo)板中進(jìn)行，20 μL樣品溶液與20 μL 2 U/mLα-葡萄糖苷酶溶液37 ℃孵育15 min，向其中加入20 μL 20 mmol/L PNPG溶液（溶劑為0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液），37 ℃孵育10 min，再加入100 μL 0.2 mol/L Na2CO3溶液終止反應(yīng)，通過酶標(biāo)儀測定體系在405 nm波長處的吸光度。實驗設(shè)置3 個組：樣品組、背景組（蒸餾水代替酶溶液）、空白組（蒸餾水代替樣品溶液）。酶溶液和樣品溶液均現(xiàn)用現(xiàn)配。根據(jù)式（1）計算α-葡萄糖苷酶活力抑制率。

式中：A0為空白組吸光度；A1為背景組吸光度；A2為樣品組吸光度。

1.3.3 胰脂肪酶活力測定

胰脂肪酶活力測定的原理為胰脂肪酶降解4-MUO生成具有熒光吸收的產(chǎn)物4-甲基傘形酮[26]。樣品（各單獨的配方組分、復(fù)合配方組分）用二甲基亞砜助溶后用Tris-HCl緩沖液（pH 8.0）稀釋得到質(zhì)量濃度分別為2.5、2、1.5、1、0.5 mg/mL的溶液。0.5 mg豬胰脂肪酶粉末溶解在1 mL Tris-HCl緩沖液中。酶溶液和樣品溶液均現(xiàn)用現(xiàn)配。25 μL樣品溶液與25 μL胰脂肪酶溶液混合后加入96 孔板中，預(yù)孵育10 min后，向其中加入50 μL 4-MUO啟動反應(yīng)，37 ℃反應(yīng)30 min后使用酶標(biāo)儀讀取激發(fā)波長360 nm、發(fā)射波長465 nm處體系熒光強度。實驗設(shè)置3 個組：樣品組、背景組（蒸餾水代替酶溶液）、空白組（蒸餾水代替樣品溶液）。按式（1）計算胰脂肪酶活力抑制率。

1.3.4 海藻果蔬提取物復(fù)配單因素試驗

以羊棲菜水提物、姜黃素、安石榴苷為配方組分，設(shè)計以羊棲菜水提物為主，姜黃素、安石榴苷為輔的復(fù)配配方。以3 個組分對2 種酶活力的半數(shù)抑制濃度（median inhibition concentration，IC50）平均值為各組分配比的確定依據(jù)[27]，確定各組分質(zhì)量比例范圍。以0.5 mg/mL復(fù)合配方對2 種酶的活力抑制率為指標(biāo)，通過預(yù)實驗確定每個單因素試驗中兩個固定因素的配比，進(jìn)行海藻果蔬提取物復(fù)配單因素試驗，確定各組分最佳配比。

1.3.4.1 羊棲菜水提物配比對復(fù)配配方抑制酶活性的影響

固定m（姜黃素）∶m（安石榴苷）＝4∶2（定義配比為混合物中各成分質(zhì)量比的數(shù)值，比如此處姜黃素、安石榴苷的配比分別為4、2），改變羊棲菜水提物的配比，分別為150、450、750、1 050、1 350，以配方質(zhì)量濃度0.5 mg/mL下對α-葡萄糖苷酶和胰脂肪酶活力的抑制率為指標(biāo)，判定羊棲菜水提物最佳配比。

1.3.4.2 姜黃素配比對復(fù)配配方抑制酶活性的影響

固定羊棲菜水提物配比和安石榴苷配比分別為450和2，改變姜黃素的配比，分別為2、4、6、8、10，以配方質(zhì)量濃度0.5 mg/mL下對2 種酶活力的抑制率為指標(biāo)，判定姜黃素最佳配比。

1.3.4.3 安石榴苷配比對復(fù)配配方抑制酶活性的影響

確定羊棲菜水提物配比和姜黃素配比分別為450和4，改變安石榴苷的配比，分別為1、2、3、4、5，以配方質(zhì)量濃度0.5 mg/mL下對2 種酶活力的抑制率為指標(biāo)，判定安石榴苷最佳配比。

1.3.5 響應(yīng)面法優(yōu)化海藻果蔬提取物復(fù)配配方

以羊棲菜水提物、姜黃素、安石榴苷的配比為3 個因素，每個因素設(shè)3 個水平（單因素篩選出），總質(zhì)量濃度是0.5 mg/mL，以配方對α-葡萄糖苷酶和胰脂肪酶活性的抑制率為響應(yīng)值，響應(yīng)值越大，配比效果越好，用響應(yīng)面法進(jìn)行配方優(yōu)化分析[28]，確定各成分配比。試驗因素與水平設(shè)計見表1。

表1 響應(yīng)面設(shè)計因素與水平Table 1 Independent variables and their coded and actual levels used for response surface design

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

實驗采用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行響應(yīng)面試驗設(shè)計，采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。實驗數(shù)據(jù)均為3 次平行實驗的平均值，結(jié)果以表示。P＜0.05為具有統(tǒng)計學(xué)意義的顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 配方組分對α-葡萄糖苷酶和胰脂肪酶活力的抑制率

圖1比較了配方組分對α-葡萄糖苷酶和胰脂肪酶活力的IC50，IC50越小抑制效果越好。安石榴苷對兩種酶的抑制效果明顯強于其他成分，其對α-葡萄糖苷酶和胰脂肪酶活力的IC50分別是（0.420 0±0.001 3）mg/mL和（0.090 0±0.010 9）mg/mL；姜黃素的抑制效果次之，其IC50分別是（0.730 0±0.018 6）mg/mL和（0.740 0±0.028 6）mg/mL；羊棲菜水提物的抑制效果相對較弱，其IC50分別是（38.22±1.57）mg/mL和（1.02±0.02）mg/mL。3 個組分（羊棲菜水提物、姜黃素、安石榴苷）對兩種酶活力的IC50平均值之比約為150∶6∶2。以此比值為依據(jù)，確定各組分配比范圍，即羊棲菜水提物配比：150、450、750、1 050、1 350；姜黃素配比：2、4、6、8、10；安石榴苷配比：1、2、3、4、5。在此基礎(chǔ)上優(yōu)化以羊棲菜水提物為主，姜黃素、安石榴苷為輔的復(fù)配配方，首先進(jìn)行海藻果蔬提取物復(fù)配單因素試驗。

圖1 配方組分對α-葡萄糖苷酶和胰脂肪酶活力的IC50Fig. 1 IC50 values for inhibition of α-glucosidase and pancreatic lipase by formulation ingredients

2.2 海藻果蔬提取物復(fù)配單因素試驗結(jié)果

如圖2A所示，0.5 mg/mL質(zhì)量濃度下，配方對α-葡萄糖苷酶活力抑制率隨羊棲菜水提物配比的增加逐漸降低。配方對胰脂肪酶活力抑制率隨羊棲菜水提物配比的增加先升高后降低，在羊棲菜水提物配比為450時達(dá)到最高。綜合分析確定羊棲菜水提物最佳配比為450。

如圖2B所示，0.5 mg/mL質(zhì)量濃度下，配方對α-葡萄糖苷酶活力抑制率隨姜黃素配比的增加先升高后降低，在姜黃素配比為4時達(dá)到最高。配方對胰脂肪酶活力抑制率隨姜黃素配比的增加先升高后降低，在姜黃素配比為6時達(dá)到最高；在姜黃素配比為4時，配方對胰脂肪酶活力抑制率也達(dá)到了較高水平。綜合分析后確定姜黃素最佳配比為4。

如圖2C所示，0.5 mg/mL質(zhì)量濃度下，配方對α-葡萄糖苷酶和胰脂肪酶活力的抑制率均隨著安石榴苷配比的增加先升高后降低，且均在安石榴苷配比為2時達(dá)到最高。因此確定安石榴苷最佳配比為2。

圖2 組分配比對配方α-葡萄糖苷酶和胰脂肪酶活力抑制率的影響Fig. 2 Effect of ratios of ingredients on the inhibition rate of α-glucosidase and pancreatic lipase activities by formulation

2.3 D優(yōu)化響應(yīng)面試驗結(jié)果

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以羊棲菜水提物配比（A）、姜黃素配比（B）和安石榴苷配比（C）為自變量，以α-葡萄糖苷酶活力抑制率和胰脂肪酶活力抑制率為響應(yīng)值，通過D優(yōu)化響應(yīng)面法進(jìn)行配方優(yōu)化分析，確定各成分最優(yōu)配比。試驗設(shè)計及結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

運用Design-Expert 8.0.6軟件對試驗結(jié)果進(jìn)行回歸擬合，得到的回歸方程，見式（2）、（3）。

為了檢驗方程的有效性，對結(jié)果進(jìn)行方差分析（表3）和可信度分析（表4）。由表3可知，對于α-葡萄糖苷酶活力抑制率和胰脂肪酶活力抑制率兩個響應(yīng)值，模型的P值均小于0.05，判斷模型顯著；模型失擬誤差P值均大于0.05，說明模型失擬項不顯著。由表4可知，模型響應(yīng)值α-葡萄糖苷酶活力抑制率和胰脂肪酶活力抑制率的決定系數(shù)R2分別為0.99、0.94，校正后R2分別為0.97、0.82，表明模型擬合度高；模型的變異系數(shù)均小于10%，說明模型對響應(yīng)值的置信度良好，該模型可以較好地反映真實的實驗結(jié)果。綜上所述，該回歸模型對響應(yīng)值的擬合程度較高，方程能夠較好地反映響應(yīng)值與自變量的關(guān)系。

表4 模型可信度分析Table 4 Reliability analysis of models

為更直觀地反映各因素對響應(yīng)值的影響，對回歸模型進(jìn)行響應(yīng)面圖分析。隨著羊棲菜水提物配比的增加，配方對α-葡萄糖苷酶活力抑制率先降低后升高；配方對α-葡萄糖苷酶活力抑制率隨著姜黃素和安石榴苷配比的增加而升高（圖3A、B、C）。結(jié)合表3中三因素P值可知，三因素對配方α-葡萄糖苷酶活力抑制率的影響力由高到低：羊棲菜水提物配比＞安石榴苷配比＞姜黃素配比。

圖3 配方組分配比對配方抑制α-葡萄糖苷酶活力的影響Fig. 3 Response surface plots showing the effect of ratios of ingredients on the inhibition of α-glucosidase activity by formulation

表3 回歸方程方差分析Table 3 Analysis of variance of regression equations

圖4是三因素之間的交互作用對配方抑制胰脂肪酶活力影響的響應(yīng)面圖。配方對胰脂肪酶活力的抑制率隨著羊棲菜水提物配比和安石榴苷配比的增加先升高后降低；隨著姜黃素配比的增加而升高。結(jié)合表3中三因素P值可知，三因素對配方胰脂肪酶活力抑制率的影響力：姜黃素配比＞羊棲菜水提物配比＞安石榴苷配比。

圖4 配方組分配比對配方抑制胰脂肪酶活力的影響Fig. 4 Response surface plots showing the effect of ratios of ingredients on the inhibition of pancreatic lipase activity by formulation

經(jīng)Design-Expert 8.0.6軟件分析得出最佳配方為：羊棲菜水提物配比150，姜黃素配比6，安石榴苷配比3；相應(yīng)的模型預(yù)測α-葡萄糖苷酶活力抑制率為45.98%，胰脂肪酶活力抑制率為73.88%。選取預(yù)測所得的最佳配比進(jìn)行復(fù)配，測定復(fù)配配方對這兩種酶活力的抑制率。配方α-葡萄糖苷酶活力抑制率為（47.77±2.15）%，胰脂肪酶活力抑制率為（74.18±0.46）%。實際值與預(yù)測值相近，說明該模型能夠較好地預(yù)測配方最佳配比。因此，最佳配比為m（羊棲菜水提物）∶m（姜黃素）∶m（安石榴苷）＝150∶6∶3。測定配方體外酶活力抑制效果，配方對α-葡萄糖苷酶和胰脂肪酶的IC50分別為（0.56±0.04）mg/mL和（0.210 0±0.000 3）mg/mL，優(yōu)于羊棲菜水提物單一成分。說明以羊棲菜水提物為主，復(fù)配以姜黃素、安石榴苷之后，體外抑制α-葡萄糖苷酶和胰脂肪酶活力的能力得到了很大提高。

3 討 論

本研究結(jié)果表明，配方組分羊棲菜水提物、姜黃素、安石榴苷均對α-葡萄糖苷酶和胰脂肪酶活力有較好的抑制作用。汪財生等[29]研究發(fā)現(xiàn)羊棲菜中的巖藻黃質(zhì)提取物可顯著降低肥胖小鼠體質(zhì)量和Lee’s指數(shù)，具有良好的減肥作用。本研究中羊棲菜水提物對胰脂肪酶活力的IC50為（1.02±0.02）mg/mL，表現(xiàn)出了較強的輔助降血脂能力。王令充等[30]研究表明姜黃素可以顯著降低血清和肝臟中的膽固醇含量。本實驗發(fā)現(xiàn)姜黃素對兩種糖脂代謝酶（α-葡萄糖苷酶和胰脂肪酶）活力均具有較好的抑制活力，IC50分別為（0.730 0±0.018 6）mg/mL和（0.740 0±0.028 6）mg/mL。相比之下，3 種成分中安石榴苷的酶活力抑制效果最優(yōu)，對α-葡萄糖苷酶和胰脂肪酶的IC50分別為（0.420 0±0.001 3）mg/mL和（0.090 0±0.010 9）mg/mL，說明安石榴苷具有較強的降血糖、降血脂活性。3 種成分均具有開發(fā)成為輔助減肥、降糖降脂保健食品的潛力。

利用上述3 種活性成分，以海藻水提物為主，果蔬提取物為輔進(jìn)行復(fù)配，設(shè)計綠色健康的食品配方，有助于控制血糖、血脂以及減少相關(guān)并發(fā)癥的出現(xiàn)，達(dá)到輔助降糖降脂的目的，還可以促進(jìn)對藻類的開發(fā)利用。以三者對α-葡萄糖苷酶和胰脂肪酶活力的抑制效果IC50為判別依據(jù)，以配方對兩種酶活力的抑制率為評價指標(biāo)，通過單因素試驗和D優(yōu)化響應(yīng)面法最終確定了海藻果蔬配方最佳配比：m（羊棲菜水提物）∶m（姜黃素）∶m（安石榴苷）＝150∶6∶3。該配方體外對α-葡萄糖苷酶和胰脂肪酶活力的IC50分別為（0.56±0.04）mg/mL和（0.210 0±0.000 3）mg/mL。將姜黃素和安石榴苷與羊棲菜水提物復(fù)配后，對α-葡萄糖苷酶和胰脂肪酶活力的抑制效果優(yōu)于單一成分羊棲菜水提物。此配方原料均為海藻、果蔬的天然產(chǎn)物，安全無毒、無害。

雖然本研究優(yōu)化得到的海藻果蔬提取物復(fù)配最佳配方在體外有良好的輔助降糖降脂的效果，但其體內(nèi)輔助降糖降脂效果及作用機理有待進(jìn)一步探討。并且本研究中的配方組分均是從植物中分離提取的純度高的成分，不是食品原料，不能直接用于保健食品。因此，符合保健食品規(guī)格的輔助降糖降脂配方還需在本研究的基礎(chǔ)上進(jìn)行進(jìn)一步研究和開發(fā)。