杜仲葉茯磚茶加工過程中活性成分及微生物多樣性

曾 橋，段 潔，邊文文，劉 靜，余鄭綠，胡 歆，楊文娟，呂生華

（1.陜西科技大學(xué)輕工科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 西安 710021；2.陜西科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，陜西 西安 710021；3.陜西省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，陜西 西安 710048；4.陜西樸道茶業(yè)股份有限公司，陜西 西安 713700；5.咸陽涇渭茯茶有限公司，陜西 咸陽 712000）

茯磚茶為黑茶類全發(fā)酵茶[1]，傳統(tǒng)上主要以黑毛茶為原料，經(jīng)原料篩選、渥堆、氣蒸、壓制成型、發(fā)花干燥和陳化等一系列復(fù)雜工藝制作而成，為所有黑茶中加工工藝最復(fù)雜、最獨(dú)特的產(chǎn)品[2-3]。其中發(fā)花是以冠突散囊菌為主的多菌群發(fā)酵過程，為決定茯磚茶品質(zhì)的關(guān)鍵制作工序，對于形成茯磚茶金花普茂、菌香濃郁、湯色紅濃、口感醇厚的獨(dú)特特征和風(fēng)味具有重要作用。研究表明，茯磚茶具有降脂減肥、抗氧化、抗腫瘤和抑菌等[4-7]多種保健作用，近年來受到消費(fèi)者的青睞。

杜仲為杜仲科杜仲屬植物，為我國特有樹種。杜仲可利用程度高，其皮和葉為名貴中藥材，杜仲雄花、杜仲籽為新資源食品。《中國藥典》記載杜仲樹皮性甘、溫，而杜仲葉微辛、溫，二者歸肝、腎經(jīng)，具有補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨的功能，常用于治療肝腎不足、腰膝酸痛、筋骨無力、頭暈?zāi)垦?。傳統(tǒng)上杜仲主要以皮入藥，對葉的利用相對較少。研究表明，杜仲葉含有豐富的黃酮、綠原酸、多糖、氨基酸、木質(zhì)素、環(huán)烯醚萜類、多酚等[8-12]活性成分，具有降血壓、降血脂、抗疲勞、降血糖、抗氧化、抗腫瘤、抗炎和抗骨質(zhì)疏松等作用[13-17]，早在2002年就被列入保健食品物品名單。2019年11月25日，國家衛(wèi)生健康委發(fā)布公告，對杜仲葉等9 種物質(zhì)開展按照藥食同源物質(zhì)生產(chǎn)經(jīng)營試點(diǎn)工作，進(jìn)一步擴(kuò)大了杜仲葉的應(yīng)用范圍，這對于促進(jìn)杜仲產(chǎn)業(yè)持續(xù)健康發(fā)展具有重要意義。杜仲葉作為可再生資源，在我國分布廣泛，產(chǎn)量巨大，但仍有待于開發(fā)和利用。

當(dāng)前，杜仲葉的開發(fā)主要以杜仲葉茶為主，包括杜仲葉綠茶、杜仲葉普洱茶、杜仲茶粉、杜仲茶飲料以及以杜仲葉為主的拼配茶等[18]，然而現(xiàn)有杜仲葉茶普遍青辛味較重，茶湯發(fā)綠或發(fā)黑，滋味略苦，口感較差，因而未得到市場廣泛認(rèn)可。茯磚茶加工工藝復(fù)雜，其獨(dú)特的發(fā)花工藝不僅賦予了茯磚茶金花普茂的特征，而且可有效改善其風(fēng)味和口感，從而大幅提升產(chǎn)品品質(zhì)，為此，本課題組前期以采摘于陜西漢中略陽的杜仲葉為原料，經(jīng)殺青、揉捻、干燥等工藝制成杜仲葉茶，進(jìn)一步采用茯磚茶加工工藝制作成杜仲葉茯磚茶，不僅豐富了茯磚茶產(chǎn)品類型，而且為促進(jìn)杜仲葉的高值化利用提供了新的途徑和方法。本實(shí)驗(yàn)在杜仲葉茯磚茶成功制作基礎(chǔ)上，對杜仲葉茯磚茶加工過程中主要活性成分以及微生物群落結(jié)構(gòu)變化進(jìn)行了研究，并對兩者相關(guān)性進(jìn)行分析，旨在揭示杜仲葉茯磚茶的品質(zhì)形成機(jī)制，為生產(chǎn)高品質(zhì)的杜仲葉茯磚茶提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

杜仲葉于2019年5月采于陜西省略陽縣。

綠原酸、梔子苷、桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸、葡萄糖、蘆丁、咖啡因、谷氨酸、沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品 上海源葉生物科技有限公司；乙腈、乙酸、甲醇、磷酸（均為色譜純） 德國Fisher公司；濃硫酸、濃鹽酸、亞硝酸鈉、硝酸鋁、乙二胺四乙酸二鈉、茚三酮（均為分析純）國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；氫氧化鈉、堿式乙酸鉛、碳酸鈉、福林-酚、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、氯化亞錫（均為分析純） 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；苯酚、無水乙醇、甲醇（均為分析純） 天津市天力化學(xué)試劑有限公司。

土壤基因組DNA提取試劑盒 美國MP Biomedicals公司；瓊脂糖 西班牙Biowest公司；FastPfuDNA聚合酶北京全式金生物技術(shù)有限公司；AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒 美國Axygen公司；NEXTFLEX?Rapid DNA-Seq Kit建庫試劑盒 美國Bioo Scientific公司；測序試劑盒 美國Illumina公司。

1.2 儀器與設(shè)備

U3000高效液相色譜儀（配有二極管陣列檢測器和Chromeleon 7.10色譜工作站） 美國Thermo-Fisher Scientific公司；UV-1100紫外分光光度計(jì) 上海美譜達(dá)儀器有限公司；FA2004電子分析天平 上海精科天平有限公司；EX125DZH電子天平 奧豪斯儀器（常州）有限公司；GZX-GF101-2-BS-II電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司；KH5200DE型醫(yī)用數(shù)控超聲波清洗器 昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；HH-2電熱恒溫水浴鍋 金壇市江南儀器廠；DW-86L486超低溫冰箱青島海爾生物醫(yī)療股份有限公司；TD5A大容量低速離心機(jī) 長沙英泰儀器有限公司；FD5-2.5冷凍干燥機(jī)美國SIM公司；ELx800酶標(biāo)儀 美國BioTek公司；QuantusTMFluorometer微型熒光計(jì) 美國Promega公司；GeneAmp?9700型聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國ABI公司；Illumina Miseq測序儀 美國Illumina公司。

1.3 方法

1.3.1 杜仲葉茯磚茶的制作工藝

以同一批次杜仲葉茶（陜西略陽）為原料，經(jīng)篩選、渥堆、氣蒸、壓制成型、發(fā)花干燥、陳化等工藝制成。分別于加工過程中的原料篩選、渥堆、氣蒸與壓制成型（即發(fā)花0 d），發(fā)花4、8、12、18、25 d及陳化1 年這9 個(gè)時(shí)間點(diǎn)取樣，依次編號(hào)為S0～S8，所有樣品分別取樣約200 g，無菌包裝袋密封后貯藏于－80 ℃條件下待用。

1.3.2 杜仲葉茯磚茶中活性成分分析

將貯存于－80 ℃下各樣品冷凍干燥后進(jìn)行活性成分分析。水浸出物質(zhì)量分?jǐn)?shù)參考GB/T 8305—2013《茶 水浸出物測定》進(jìn)行測定；多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)參考文獻(xiàn)[19]進(jìn)行測定；總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)參照文獻(xiàn)[20]進(jìn)行測定；咖啡堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)參考GB/T 8312—2013《茶 咖啡堿測定》進(jìn)行測定；游離氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)參考GB/T 8314—2013《茶 游離氨基酸總量的測定》進(jìn)行測定；多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)參考GB/T 8313—2018《茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測方法》進(jìn)行測定；綠原酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)參考文獻(xiàn)[21]進(jìn)行測定；京尼平苷、京尼平苷酸和桃葉珊瑚苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)參考文獻(xiàn)[22]進(jìn)行測定。

1.3.3 杜仲葉茯磚茶中微生物的DNA提取和PCR擴(kuò)增

采用土壤基因組DNA提取試劑盒分別提取S0～S8階段樣品總DNA，使用質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的提取質(zhì)量，使用NanoDrop 2000測定DNA質(zhì)量濃度和純度。提取后的各樣品DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，細(xì)菌16S rDNA V3～V4區(qū)引物為338F（ACTCCTACGGGAGGCAGCAG）和806R（GGACTACHVGGGTWTCTAAT），真菌ITS擴(kuò)增區(qū)引物為ITS1F（CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA）和ITS2R（GCTGCGTTCTTCATCGATGC）。PCR程序：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，27 個(gè)循環(huán)；72 ℃穩(wěn)定延伸10 min，最后在10 ℃保持至停止。

1.3.4 杜仲葉茯磚茶中微生物的16S rDNA和ITS序列高通量測序

將1.3.3節(jié)得到的PCR產(chǎn)物混合后使用質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%瓊脂糖凝膠回收PCR產(chǎn)物，利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit進(jìn)行回收產(chǎn)物純化，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并用QuantusTMFluorometer微型熒光計(jì)對回收產(chǎn)物進(jìn)行檢測定量，使用NEXTFLEX?Rapid DNA-Seq Kit進(jìn)行建庫，在上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司基于Illumina平臺(tái)對細(xì)菌V3～V4和真菌ITS1區(qū)序列進(jìn)行高通量測序分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

各不同加工階段杜仲葉茯磚茶樣活性成分檢測均重復(fù)3 次，數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，活性成分實(shí)驗(yàn)結(jié)果均采用Graph Pad Prism軟件進(jìn)行分析，采用t檢驗(yàn)進(jìn)行多重比較，相關(guān)性分析采用SPSS Statistics 20軟件處理。原始測序數(shù)據(jù)分別使用Trimmomatic和FLASH軟件進(jìn)行質(zhì)控和拼接[23]，進(jìn)一步使用UPARSE軟件根據(jù)97%的相似度對序列進(jìn)行可操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）聚類分析[24]，利用RDP Classifier對每條序列進(jìn)行物種分類注釋，16S細(xì)菌和ITS真菌分別使用Silva數(shù)據(jù)庫和Unite真菌數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，確定生物分類信息[25]。

2 結(jié)果與分析

2.1 杜仲葉茯磚茶不同加工階段活性成分變化

杜仲葉茯磚茶加工過程中水浸出物、多糖、總黃酮、咖啡堿、游離氨基酸、多酚、綠原酸、京尼平苷、京尼平苷酸以及桃葉珊瑚苷等活性成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化見表1。

表1 杜仲葉茯磚茶不同加工階段活性成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)分析Table 1 Analysis of bioactive components content of samples from the manufacturing process of Fuzhuan tea from Eucommia ulmoides leaves%

由表1可知，杜仲葉茯磚茶中活性成分較為豐富，其中水浸出物、多糖、總黃酮等常見活性成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)均高于傳統(tǒng)茯磚茶[26]。在S0～S8階段，檢測的所有活性成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)均呈下降趨勢，其中與S0階段相比，S8階段的水浸出物、咖啡堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別下降6.68%和24.00%，差異顯著，但未達(dá)到極顯著水平（P＞0.01）。多糖、總黃酮、游離氨基酸、多酚、綠原酸、京尼平苷、京尼平苷酸和桃葉珊瑚苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)在加工過程中明顯下降，和S0階段相比，S8階段上述活性成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別下降29.60%、32.79%、26.19%、30.71%、62.91%、65.63%、10.83%和30.61%，差異均極顯著（P＜0.01）。

進(jìn)一步對各主要活性成分分析可以發(fā)現(xiàn)：在杜仲葉茯磚茶加工程中，水浸出物質(zhì)量分?jǐn)?shù)主要在發(fā)花中期（S4～S5）以及陳化過程中（S7～S8）下降較快，分別下降2.29%和2.91%，上述兩個(gè)階段水浸出物下降量占總下降量的76.02%，這可能是由于S4～S5階段冠突散囊菌生長旺盛，消耗了大量的營養(yǎng)成分，而S7～S8階段下降較快可能是間隔時(shí)間較長導(dǎo)致的。杜仲葉茯磚茶中多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高，和其他活性成分不同的是，多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)在S0～S6階段逐步下降，而在發(fā)花后期及陳化階段（S6～S8）多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)又逐漸上升。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，S5～S6階段下降最為明顯，多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)差異顯著（P＜0.05），這可能是由于一方面冠突散囊菌的生長繁殖利用多糖作為碳源；另一方面糖類物質(zhì)自身在發(fā)酵所產(chǎn)生的較高溫度作用下發(fā)生了脫水、縮合、聚合等焦糖化反應(yīng)，從而產(chǎn)生令人愉快的湯色和焦糖香[27]。而S6～S8階段多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)上升可能是由于冠突散囊菌等微生物所產(chǎn)生的胞外酶將茶磚中的粗纖維降解為可溶性糖，從而使多糖含量有所增加[28]?？傸S酮、游離氨基酸和多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)在杜仲葉茯磚茶加工過程中變化趨勢類似，S0、S1和S2階段中總黃酮、游離氨基酸和多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)均呈下降趨勢，但差異未達(dá)到極顯著水平（P＞0.01）。從S3階段開始，樣品中總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)與S0階段相比，差異達(dá)到極顯著水平（P＜0.01），而多酚、游離氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)從S4階段起，與S0階段相比差異達(dá)到極顯著水平（P＜0.01）。綠原酸為杜仲葉中重要活性成分，在杜仲葉茯磚茶加工前期S0～S3階段含量變化不大，而S3～S8階段，綠原酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)大幅下降，除S6和S7兩個(gè)階段質(zhì)量分?jǐn)?shù)差異未達(dá)到極顯著水平外（P＞0.01），其余各階段相互之間綠原酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)差異均達(dá)到極顯著水平（P＜0.01）。京尼平苷和桃葉珊瑚苷在杜仲葉茯磚茶中質(zhì)量分?jǐn)?shù)均較低，其中，京尼平苷在加工過程中變化較桃葉珊瑚苷明顯，且京尼平苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)下降主要集中于S3～S6階段。京尼平苷酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)下降主要為S1～S2階段，S2較S1階段質(zhì)量分?jǐn)?shù)下降5.88%，占整個(gè)加工過程中下降總量的53.85%，這可能由于京尼平苷酸熱穩(wěn)定性不高，因而在氣蒸時(shí)使其部分降解造成質(zhì)量分?jǐn)?shù)下降較快。

2.2 杜仲葉茯磚茶加工過程中微生物群落結(jié)構(gòu)

2.2.1 不同加工階段真菌群落結(jié)構(gòu)

由圖1A可知，S0～S8階段樣品的真菌群落基于門分類水平注釋到明確分類地位的有3 個(gè)門，其他相對豐度較低的合并為一類（其他）。子囊菌門（Ascomycota）在所有樣品中均為優(yōu)勢菌，相對豐度介于67.52%～100%。從各樣品來看，S0階段樣品中子囊菌門的相對豐度為91.63%，其次是相對豐度為8.07%的擔(dān)子菌門（Basidiomycota）以及少數(shù)未知分類地位的unclassified_k_Fungi及其他的真菌。而經(jīng)過渥堆處理，子囊菌門的相對豐度下降至67.52%，至S2階段，其相對豐度逐漸上升，特別是從S4階段起，子囊菌門在各樣品中的相對豐度均在99.99%以上，占絕對優(yōu)勢。

圖1 基于門（A）和屬（B）水平不同加工階段杜仲葉茯磚茶真菌群落結(jié)構(gòu)Fig. 1 Fungal community structure of samples collected from the manufacturing process of Fuzhuan tea from Eucommia ulmoides leaves at phylum (A) and genus (B) levels

由圖1B可知，S0～S8階段樣品的真菌群落在屬分類水平上注釋到明確分類地位的有23 個(gè)屬，其他相對豐度較低的合并為一類（其他）。其中相對豐度較高的有曲霉屬（Aspergillus）、毛孢子菌屬（Trichosporon）、Cutaneotrichosporon、Apiotrichum、德巴利酵母屬（Debaryomyces）、節(jié)擔(dān)菌屬（Wallemia）、枝孢屬（Cladosporium）、念珠菌屬（Candida）、青霉屬（Penicillium）和Cyberlindnera等，曲霉屬在所有樣品中的相對豐度均較高，在各不同加工階段相對豐度介于56.34%～100%，為杜仲葉茯磚茶中的優(yōu)勢菌群。通過對不同加工階段分析可以發(fā)現(xiàn)，S0～S2階段，曲霉屬相對豐度逐步下降，Cutaneotrichosporon相對豐度逐步上升，毛孢子菌屬相對豐度呈先上升后下降趨勢，微生物多樣性發(fā)生了較明顯的變化。隨著發(fā)花的進(jìn)行，至S3階段，曲霉屬相對豐度大幅上升，達(dá)到了95.58%，而在S4～S8階段，其相對豐度均在99.99%以上，為杜仲葉茯磚茶中的絕對優(yōu)勢菌群。

2.2.2 不同加工階段細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)

由圖2A可知，在門分類水平上，不同加工階段杜仲葉茯磚茶樣品的細(xì)菌群落共注釋到7 個(gè)明確分類地位的門，分別為放線菌門（Actinobacteriota）、藍(lán)細(xì)菌門（Cyanobacteria）、變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、Bacteroidota、Acidobacteriota和綠彎菌門（Chloroflexi）。不同加工階段樣品在門水平上微生物的組成有較大差異，在S0～S2階段，藍(lán)細(xì)菌門為優(yōu)勢菌，其相對豐度介于73.73%～93.19%，其次為變形菌門，相對豐度為3.97%～20.16%。而在發(fā)花初期的S3、S4階段，變形菌門為優(yōu)勢菌，相對豐度分別為60.68%和66.53%，其次為藍(lán)細(xì)菌門、厚壁菌門和放線菌門。在發(fā)花中后期及陳化階段，即S5～S8階段，各樣品在門水平上的菌群結(jié)構(gòu)較相似，放線菌門在各樣品中均為優(yōu)勢菌，相對豐度均在83.35%以上，其次為變形菌門，在各樣品中相對豐度介于10.92%～13.31%，說明門水平上細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)趨于穩(wěn)定。

圖2 基于門（A）和屬（B）水平不同加工階段杜仲葉茯磚茶細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)Fig. 2 Bacterial community structure of samples collected from the manufacturing process of Fuzhuan tea from Eucommia ulmoides leaves at phylum (A) and genus (B) levels

由圖2B可知，基于屬水平的S0～S8階段樣品的細(xì)菌群落共注釋到明確分類地位的屬有47 個(gè)，其余相對豐度較低的合并為一類（其他），其中相對豐度較高的為紅球菌屬（Rhodococcus）、雷爾氏菌屬（Ralstonia）、Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia、不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、乳桿菌屬（Lactobacillus）、norank_f_Mitochondria、泛菌屬（Pantoea）、屬級(jí)分類地位未知的黃色桿菌屬（unclassified_f_Xanthobacteraceae）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、Terrisporobacter、魏斯氏菌屬（Weissella）、克雷伯氏菌屬（Klebsiella）和叢毛單胞菌屬（Comamonas）等。在S0～S4階段，雷爾氏菌屬為各樣品中的優(yōu)勢菌，其相對豐度介于29.45%～55.74%，其次為紅球菌屬（4.31%～6.83%）和Burkholderia-Caballeronia Paraburkholderia（4.01%～7.79%）。從S5階段起，雷爾氏菌屬在此后各樣品中的相對豐度大幅下降，S5～S8階段，雷爾氏菌屬在各樣品中的相對豐度為8.43%～9.90%，紅球菌屬從S5階段起，在各樣品中的相對豐度則大幅上升，在S5～S8階段，其相對豐度84.70%～88.02%，為優(yōu)勢菌群。整體來看，杜仲葉茯磚茶加工過程中，S0～S4階段各樣品細(xì)菌群落多樣性明顯高于S5～S8階段，而S4～S5階段為杜仲葉茯磚茶中細(xì)菌群落多樣性發(fā)生變化的關(guān)鍵階段。

2.2.3 主成分分析和OTU聚類分析結(jié)果

2.2.3.1 真菌主成分分析和維恩圖分析結(jié)果

通過主成分分析（principal component analysis，PCA）杜仲葉茯磚茶不同加工階段茶樣的OTU組成來反映樣品間的差異和距離，樣品組成越相似，則反映在PCA圖中的距離越近。由圖3A可以看出，PC1和PC2的主要貢獻(xiàn)之和為99.46%，說明該P(yáng)CA結(jié)果可以較好地反映不同茶樣間真菌群落結(jié)構(gòu)差異的影響因素。S0、S1、S2階段各樣品相互之間距離均較遠(yuǎn)，說明真菌群落結(jié)構(gòu)差異較大，S3～S8階段的各樣品在PCA圖上聚集在一起，說明S3～S8階段各樣品真菌群落結(jié)構(gòu)相似，而與S0、S1、S2階段各樣品間距離較遠(yuǎn)，表明S0、S1、S2階段和S3～S8階段樣品相互間真菌群落結(jié)構(gòu)差異較大。

將S0、S1、S2階段樣品分別記為Group1、Group2和Group3，而S3～S8階段的各樣品因群落結(jié)構(gòu)相似而歸為一組，記為Group4，進(jìn)一步對97%相似水平下的OTU進(jìn)行生物信息統(tǒng)計(jì)分析并繪制維恩圖。從圖3B可以看出，所有4 組樣品可以劃分為156 個(gè)OTU，S0、S1、S2和S3～S8組樣品OTU分別為69、77、61 個(gè)和63 個(gè)。其中，S0～S1、S2、S3～S8組中OTU分別為28、25 個(gè)和18個(gè)，S1與S2、S3～S8組共有OTU分別為44 個(gè)和31 個(gè)，而S2與S3～S8組共有OTU為32 個(gè)。S0、S1、S2和S3～S8組各自獨(dú)有的OTU分別為37、25、10 個(gè)和22 個(gè)，分別占各自O(shè)TU總數(shù)的53.62%、32.47%、16.39%和34.92%，而S0、S1、S2和S3～S8組4 組樣品共有的OTU為12 個(gè)，占所有4組樣品OTU總數(shù)的7.69%，說明4 組樣品真菌群落組成有明顯的不同。

圖3 杜仲葉茯磚茶不同加工階段真菌群落PCA（A）和OTU的維恩圖分析（B）Fig. 3 Principal component analysis (A) and Venn diagram analysis of OTU distribution (B) of fungal communities in samples collected from the manufacturing process of Fuzhuan tea from Eucommia ulmoides leaves

2.2.3.2 細(xì)菌PCA和維恩圖分析結(jié)果

由圖4A可知，不同加工階段細(xì)菌群落PCA圖中PC1為93.55%，PC2為6.33%，合計(jì)為99.88%，說明該P(yáng)CA結(jié)果可以較好地反映不同茶樣間細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異的影響因素。S0、S1和S2階段樣品在PCA圖上距離較近，說明組成上較為相似，而S3和S4階段樣品距離較近，說明S3和S4階段樣品細(xì)菌群落組成相似，同時(shí)S3和S4與S0、S1、S2階段樣品呈明顯的分離狀態(tài)，說明細(xì)菌群落組成與S0、S1、S2階段樣品有較明顯的差異。S5、S6、S7和S8階段樣品在PCA圖上聚集在一起，說明S5～S8階段各樣品細(xì)菌群落組成相似，同時(shí)與其他樣品距離較遠(yuǎn)，說明與其他階段樣品細(xì)菌群落組成有明顯的差異。

圖4 杜仲葉茯磚茶不同加工階段細(xì)菌群落PCA（A）和OTU的維恩圖分析（B）Fig. 4 Principal component analysis (A) and Venn diagram analysis of OTU distribution (B) of bacterial communities in samples collected from the manufacturing process of Fuzhuan tea from Eucommia ulmoides leaves

為便于進(jìn)行OTU分析，將在PCA圖上距離較近的樣品分為一組，即S0、S1、S2階段樣品合并為Group1，S3和S4階段樣品合并為Group2，S5、S6、S7和S8階段樣品歸為Group3，進(jìn)一步對97%相似水平下的OTU進(jìn)行生物信息學(xué)統(tǒng)計(jì)分析并繪制維恩圖。由圖4B可知，3 組樣品一共可以劃分為1 250 個(gè)OTU，Group1、Group2和Group3各組樣品OTU分別為555、885 個(gè)和542 個(gè)。其中，Group1和Group2共有的OTU為359 個(gè)，和Group3共有的OTU為253 個(gè)，Group2和Group3共有的OTU為341 個(gè)。Group1、Group2和Group3各組獨(dú)有的OTU為164、406 個(gè)和169 個(gè)，分別占各自O(shè)TU總數(shù)的29.55%、45.88%和31.18%，而3 組共有的OTU為221 個(gè)，占所有組OTU總數(shù)的17.68%，說明杜仲葉茯磚茶加工過程中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯的變化。

2.3 屬水平主要菌群與活性成分相關(guān)性分析結(jié)果

表2為S0～S8階段杜仲葉茯磚茶活性成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)與屬水平上相對豐度較高菌群之間相關(guān)性分析，由表2可知，曲霉屬相對豐度與多糖、總黃酮、游離氨基酸、多酚、綠原酸、京尼平苷和桃葉珊瑚苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)均顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05），Apiotrichum相對豐度與多糖、游離氨基酸、多酚、綠原酸、京尼平苷和桃葉珊瑚苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)均顯著正相關(guān)（P＜0.05），與總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），節(jié)擔(dān)菌屬相對豐度與多糖、總黃酮、游離氨基酸、多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著正相關(guān)（P＜0.05），紅球菌屬相對豐度與水浸出物、多糖、總黃酮、游離氨基酸、多酚、綠原酸、京尼平苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)均呈極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01），與京尼平苷酸、桃葉珊瑚苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05），雷爾氏菌屬和Burkholderia-Caballeronia Paraburkholderia相對豐度均與水浸出物質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），二者相對豐度與綠原酸和京尼平苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)均顯著正相關(guān)（P＜0.05），芽孢桿菌屬相對豐度與多糖、游離氨基酸、京尼平苷酸和桃葉珊瑚苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)均顯著正相關(guān)（P＜0.05）。此外，毛孢子菌屬、Cutaneotrichosporon、德巴利酵母屬、不動(dòng)桿菌屬和乳桿菌屬相對豐度與主要活性成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)相關(guān)性均不顯著（P＞0.05），咖啡堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)與屬水平上主要菌群相對豐度相關(guān)性均不顯著（P＞0.05）。

表2 不同加工階段杜仲葉茯磚茶活性成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)與屬水平主要菌群相對豐度Pearson相關(guān)性分析Table 2 Pearson’s correlation between the relative abundance of important genera and bioactive components of samples collected from the manufacturing process of Fuzhuan tea from Eucommia ulmoides leaves

3 討 論

杜仲葉茯磚茶加工過程中活性成分分析結(jié)果表明，主要活性成分在加工過程中均呈下降趨勢，比較S8和S0兩個(gè)階段活性成分含量可以發(fā)現(xiàn)，除水浸出物和咖啡堿差異未達(dá)到極顯著外，其余活性成分含量下降差異均達(dá)到極顯著水平（P＜0.01），這與以黑毛茶為原料加工的傳統(tǒng)茯磚茶類似。然而，Li Qin等[29]認(rèn)為，盡管茯磚茶加工和儲(chǔ)藏過程中主要功能成分含量呈下降趨勢，但茯磚茶仍具有較好的保健作用，這是由于茯磚茶生產(chǎn)過程中產(chǎn)生了其他新的成分或茯磚茶中原有的一些成分含量增加的緣故，由于本研究過程中所檢測的活性成分種類有限；因此，杜仲葉茯磚茶是否也存在類似的情況還有待于通過后續(xù)深入研究來證實(shí)。冠突散囊菌是茯磚茶中的優(yōu)勢金花菌，屬于曲霉屬真菌[30]，通過對杜仲葉茯磚茶加工過程中屬水平上真菌群落結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，曲霉屬在S0階段即開始大量存在，渥堆和氣蒸降低了曲霉屬在樣品中相對豐度，而杜仲葉茯磚茶進(jìn)入發(fā)花階段后，由于環(huán)境溫度和濕度適中，金花菌大量生長繁殖，因此在S2～S3階段曲霉屬豐度大幅上升，從S4階段起，曲霉屬在樣品中的相對豐度已達(dá)到了99.99%以上。由于冠突散囊菌是衡量茯磚茶品質(zhì)的重要指標(biāo)，因此，曲霉屬在杜仲葉茯磚茶中的豐度高，間接說明工藝控制良好，產(chǎn)品質(zhì)量較高。Li Qin等[29]對以黑毛茶為原料加工茯磚茶過程中真菌群落變化進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在以黑毛茶為原料加工茯磚茶過程中曲霉屬相對豐度在渥堆和氣蒸階段呈上升趨勢，而在進(jìn)入發(fā)花室后的0～3 d，曲霉屬相對豐度呈下降趨勢，這與杜仲葉茯磚茶有明顯不同，說明原料不同對茯磚茶加工前期樣品中的真菌群落結(jié)構(gòu)有一定影響，但進(jìn)入發(fā)花中期后，曲霉屬在兩種茯磚茶中均為絕對優(yōu)勢菌群，在中后期及最終產(chǎn)品中各不同原料茯磚茶真菌群落結(jié)構(gòu)差異不大[31]。相關(guān)性分析結(jié)果表明，曲霉屬相對豐度與杜仲葉茯磚茶加工過程中多數(shù)活性成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05），節(jié)擔(dān)菌屬相對豐度與多糖、總黃酮、游離氨基酸和多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），這與以黑毛茶為原料加工的傳統(tǒng)茯磚茶類似，而在杜仲葉茯磚茶加工過程中豐度較高的Apiotrichum在傳統(tǒng)茯磚茶中未發(fā)現(xiàn)[29]。細(xì)菌是茯磚茶加工過程中非常重要的菌群，但由于發(fā)酵過程中細(xì)菌數(shù)量相對于真菌處于劣勢地位，因而沒有受到研究者重視[32]。紅球菌屬、雷爾氏菌屬、Burkholderia-Caballeronia Paraburkholderia、不動(dòng)桿菌屬、芽孢桿菌屬和乳桿菌屬是杜仲葉茯磚茶加工過程中主要的細(xì)菌屬，其中，紅球菌屬相對豐度僅與所檢測活性成分中的咖啡堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)相關(guān)性不顯著（P＞0.05），而與其余9 種活性成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)均呈顯著（P＜0.05）或極顯著（P＜0.01）負(fù)相關(guān)，雷爾氏菌屬、Burkholderia-Caballeronia Paraburkholderia相對豐度與水浸出物、綠原酸和京尼平苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著（P＜0.05）或極顯著（P＜0.01）正相關(guān)，而芽孢桿菌屬相對豐度與多糖、游離氨基酸、京尼平苷酸和桃葉珊瑚苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），這說明細(xì)菌在杜仲葉茯磚茶加工過程中可能發(fā)揮了重要的作用，在后續(xù)研究中應(yīng)予以重視。

綜上，杜仲葉茯磚茶中水浸出物、多糖、總黃酮、咖啡堿、游離氨基酸、多酚、綠原酸、京尼平苷、京尼平苷酸以及桃葉珊瑚苷10 種活性成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)在加工過程中呈逐步下降趨勢。杜仲葉茯磚茶在加工前期（S0～S4階段）真菌和細(xì)菌屬菌群均較加工后期（S5～S8階段）豐富，發(fā)花后期以及陳化階段，杜仲葉茯磚茶中微生物菌群逐漸趨于穩(wěn)定。屬水平上主要菌群相對豐度與活性成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的相關(guān)性分析結(jié)果表明，杜仲葉茯磚茶加工過程中細(xì)菌和真菌豐度與多樣性均可能對活性成分的變化產(chǎn)生影響。研究結(jié)果可為進(jìn)一步通過定向調(diào)控菌群結(jié)構(gòu)提高杜仲葉茯磚茶發(fā)花質(zhì)量和產(chǎn)品品質(zhì)提供理論依據(jù)。