外源γ-氨基丁酸對(duì)發(fā)芽大豆酚類物質(zhì)富集及抗氧化能力的影響

丁羽萱，王 堯，姚羿安，李皖梅，王 冕，王 沛，顧振新，楊潤(rùn)強(qiáng)

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，江蘇 南京 210095）

種子萌發(fā)涉及一系列形態(tài)和生理生化的變化。研究表明，大豆萌發(fā)能夠富集γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）[1]、總酚[2]、總黃酮[3]、異黃酮[4]等成熟大豆籽粒中含量低或不含有的功能成分。其中GABA是一種廣泛存在于生物體內(nèi)的非蛋白質(zhì)氨基酸，最初發(fā)現(xiàn)GABA對(duì)哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)具有普遍抑制作用[1]。同時(shí)，GABA對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育具有重要影響[5]，植物在受到冷刺激、缺氧和機(jī)械刺激時(shí)會(huì)大量積累GABA以響應(yīng)生物或非生物的脅迫。

酚類物質(zhì)是植物體內(nèi)廣泛存在的一類次級(jí)代謝產(chǎn)物，是植物抗氧化系統(tǒng)的重要組成成分[6]，在逆境脅迫下，植物受到氧化損傷導(dǎo)致酚類物質(zhì)的積累。研究證明，GABA與植物的抗氧化系統(tǒng)之間存在一定關(guān)系。外源GABA處理能顯著提高NaCl脅迫番茄幼苗葉片超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化物酶（peroxidase，POD）和過氧化氫酶（catalase，CAT）活力，最高可分別比NaCl處理組提高6.1%、41.3%和72.9%，且外源GABA處理顯著降低了NaCl處理造成的葉片和根系內(nèi)超氧陰離子自由基產(chǎn)生速率和丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量，表明外源GABA能夠減輕鹽脅迫導(dǎo)致的膜脂過氧化傷害[7]。李敬蕊等[8]研究表明，外源施加GABA能提高低氧脅迫下CmSOD、CmPOD1、CmPOD2、CmCAT和CmAPX基因的表達(dá)量，而這些基因與抗氧化酶活性密切相關(guān)。外源GABA能促進(jìn)蕓苔屬植物根系吸收和利用土壤硝酸鹽，說(shuō)明GABA可能作為上游信號(hào)分子在植物體內(nèi)起關(guān)鍵作用[9]。Shi Shengqing等[10]在鹽脅迫下用GABA處理錦雞兒根部，發(fā)現(xiàn)外源GABA能激活體內(nèi)信號(hào)傳遞、蛋白質(zhì)降解調(diào)控、激素合成、活性氧的形成和多胺代謝等多重生理生化反應(yīng)，進(jìn)一步證明GABA能作為一種上游生物信號(hào)分子，參與植物體內(nèi)與鹽脅迫相關(guān)的基因表達(dá)調(diào)控。

可見，GABA對(duì)植物生長(zhǎng)和抗逆能力有重要作用。作為植物抗氧化系統(tǒng)的重要組成部分，酚類物質(zhì)在植物體內(nèi)的大量累積可能受到GABA的調(diào)節(jié)。因此，本實(shí)驗(yàn)擬通過研究外源添加GABA對(duì)發(fā)芽大豆酚類物質(zhì)富集的影響，以明確GABA在酚類富集中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆（品種為‘云鶴’）籽粒購(gòu)于江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，置于－20 ℃冰柜保藏待用。千粒質(zhì)量為（161.6±0.8）g。

GABA購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；福林-酚試劑購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

BX801發(fā)芽機(jī) 永康市貝欣五金電器廠；755B型分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司；PYX-DHS-BS型隔水電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；冷凍離心機(jī) 上海市安亭科學(xué)儀器廠；LC-20A高效液相色譜儀日本島津公司；DZF-6020型真空干燥器 上海一恒科技有限公司；818型pH測(cè)量?jī)x 美國(guó)Orion Research公司；HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州國(guó)華電器有限公司；WH-3微型旋渦混合儀 上海滬析分析儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 大豆籽粒預(yù)處理

稱取適量顆粒飽滿、大小均勻的大豆籽粒，經(jīng)去離子水沖洗后，置于體積分?jǐn)?shù)0.5%次氯酸鈉溶液中浸泡消毒15 min，然后用蒸餾水沖洗至pH 7.0左右，置于30 ℃水浴鍋中用去離子水以液料比5∶1浸泡6 h。浸泡后的大豆均勻攤于發(fā)芽機(jī)的苗盤上，置于30 ℃培養(yǎng)箱中黑暗發(fā)芽。分別配制2.5、5、10、20 mmol/L GABA溶液作為培養(yǎng)液，以去離子水為對(duì)照進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。處理過程中，每24 h更換培養(yǎng)液，發(fā)芽時(shí)長(zhǎng)4 d，測(cè)定發(fā)芽大豆生長(zhǎng)指標(biāo)（芽長(zhǎng)、鮮質(zhì)量、干質(zhì)量）、總酚含量、酚酸含量及抗氧化指標(biāo)。

1.3.2 生長(zhǎng)指標(biāo)的測(cè)定

大豆芽長(zhǎng)的測(cè)定：隨機(jī)選取30 株發(fā)芽大豆，用游標(biāo)卡尺測(cè)定其芽長(zhǎng)，以所測(cè)30 株發(fā)芽大豆芽長(zhǎng)平均值表示。大豆鮮質(zhì)量的測(cè)定：隨機(jī)選取10 株發(fā)芽大豆，用吸水紙吸干表面水分，稱量并記錄每10 株發(fā)芽大豆的鮮質(zhì)量，精確到0.001 g。干質(zhì)量的測(cè)定：隨機(jī)選取10 株發(fā)芽大豆，用吸水紙吸干表面水分，冷凍干燥，稱量并記錄每10 株發(fā)芽大豆的干質(zhì)量，精確到0.001 g。

1.3.3 游離酚提取

參考Chen Zhijie等[11]的方法。發(fā)芽大豆冷凍干燥后研磨粉碎，過40 目篩。取2 g發(fā)芽大豆粉用體積分?jǐn)?shù)80%甲醇溶液提取3 次（每次20 mL），在振蕩器上200 r/min振蕩1 h，25 ℃下充氮?dú)獗芄馓崛。缓笤谝?0 000 r/min、4 ℃離心15 min，離心后提取液合并過濾，在40 ℃條件下旋轉(zhuǎn)蒸干，用體積分?jǐn)?shù)50%甲醇溶液溶解并定容至10 mL，作為游離酚提取液，充氮?dú)夂笾糜冢?0 ℃，供分析用。

1.3.4 結(jié)合酚提取

參考Chen Zhijie等[11]的方法。提取游離酚后的殘余物用40 mL 2 mol/L NaOH溶液水解，混合物200 r/min條件下振蕩水解4 h，25 ℃下充氮?dú)獗芄馓崛?，水解液? mmol/L HCl溶液調(diào)整pH值至1.5～2.0之間，取50 mL乙酸乙酯與水解液充分混合15 min后，靜置5 min，然后混合液在10 000 r/min、4 ℃下離心5 min，取上層乙酸乙酯層，重復(fù)上述操作3 次，合并乙酸乙酯層，于40 ℃條件下旋轉(zhuǎn)蒸干，用體積分?jǐn)?shù)50%甲醇溶液溶解并定容至10 mL，作為結(jié)合酚提取液，充氮?dú)夂笾糜冢?0 ℃，供分析用。

1.3.5 總酚含量測(cè)定

采用福林-酚比色法[12]測(cè)定總酚含量。分別取上述游離酚和結(jié)合酚提取液200 μL（根據(jù)濃度適當(dāng)稀釋），加入1.5 mL 10 倍體積稀釋的福林-酚試劑，漩渦振蕩后靜置5 min，然后加入1.5 mL 75 g/L Na2CO3溶液混勻，置于室溫下暗處反應(yīng)2 h，在765 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以體積分?jǐn)?shù)50%甲醇溶液代替提取液作為空白對(duì)照。以沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品配制標(biāo)準(zhǔn)曲線，游離酚和結(jié)合酚含量以每克干質(zhì)量樣品中沒食子酸的質(zhì)量計(jì)，單位為mg/g。游離酚或結(jié)合酚含量按公式（1）進(jìn)行計(jì)算。

式中：ω為游離酚或結(jié)合酚含量/（mg/g）；ρ為沒食子酸質(zhì)量濃度/（μg/mL）；V為提取液體積/mL；N為稀釋倍數(shù)；m為取樣量/g。

大豆芽菜的總酚含量為各處理?xiàng)l件下所測(cè)得游離酚和結(jié)合酚含量之和，單位為mg/g。

1.3.6 酚酸含量測(cè)定

采用高效液相色譜法[12]測(cè)定酚酸含量。分別取20 μL 1.3.3節(jié)和1.3.4節(jié)提取液，經(jīng)0.45 μm的有機(jī)濾膜過濾后采用高效液相色譜（以外標(biāo)法定量）進(jìn)行分析。采用LC-20A高效液相色譜，配備C18110A（4.6 mm×150 mm，5 μm）色譜柱，高效液相色譜條件：流速為0.9 mL/min，流動(dòng)相A溶液為0.1%的醋酸溶液，流動(dòng)相B為0.1%的醋酸-甲醇溶液，分離時(shí)間55 min，柱溫35 ℃，測(cè)定波長(zhǎng)280 nm。流動(dòng)相梯度洗脫程序見表1。

表1 高效液相色譜流動(dòng)相梯度洗脫程序Table 1 Mobile phase gradient elution procedure of high performance liquid chromatography

1.3.7 抗氧化能力測(cè)定

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力參照Chen Zhijie等[13]的方法。分別取上述游離酚和結(jié)合酚提取液200 μL（以體積分?jǐn)?shù)50%甲醇溶液適當(dāng)稀釋），加入3.8 mL DPPH溶液，漩渦后置于室溫下暗處反應(yīng)1 h，在515 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度A。以體積分?jǐn)?shù)50%甲醇溶液代替各提取液作為空白組測(cè)定吸光度Acontrol。DPPH自由基清除率按公式（2）計(jì)算。以不同濃度Trolox繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（配制不同濃度的Trolox標(biāo)準(zhǔn)溶液，測(cè)定其在515 nm波長(zhǎng)處吸光度，以Trolox標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，R2≥0.99），DPPH自由基清除能力以每克干質(zhì)量樣品反應(yīng)生成Trolox的物質(zhì)的量計(jì)，單位為μmol/g。

式中：A為樣品組的吸光度；Acontrol為空白組的吸光度。

2,2’-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)（2-2’-azinobis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）陽(yáng)離子自由基清除能力：參照Chen Zhijie等[13]的方法。取上述游離酚和結(jié)合酚提取液100 μL（以體積分?jǐn)?shù)50%甲醇溶液適當(dāng)稀釋），加入3.0 mL ABTS溶液，漩渦后置于室溫下暗處反應(yīng)30 min，在734 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度A。以體積分?jǐn)?shù)50%甲醇溶液代替提取液作為空白對(duì)照Acontrol。ABTS陽(yáng)離子自由基清除率按公式（2）計(jì)算。以不同濃度Trolox繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（配制不同濃度的Trolox標(biāo)準(zhǔn)溶液，測(cè)定其在734 nm波長(zhǎng)處吸光度，以Trolox標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，其對(duì)應(yīng)吸光度為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，R2≥0.99），ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力以每克干質(zhì)量樣品反應(yīng)生成Trolox的物質(zhì)的量計(jì)，單位為μmol/g。

1.3.8 苯丙氨酸解氨酶活力測(cè)定

苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia lyase，PAL）活力參照Ma Yan等[12]的方法。稱取2 g發(fā)芽大豆鮮樣置于預(yù)冷研缽中，加入事先預(yù)冷的4 mL 0.2 mol/L pH 8.8硼酸鈉緩沖液，冰浴研磨。研磨后倒入10 mL離心管內(nèi)，在4 ℃條件下，8 000 r/min離心20 min，取上清液作為PAL提取液。PAL活力測(cè)定反應(yīng)體系：2.2 mL 0.05 mol/LL-苯丙氨酸、0.8 mL酶提取液。加入酶提取液后，迅速搖勻，以上述硼酸鈉緩沖液代替PAL提取液作為空白對(duì)照，立即使用紫外-可見光分光光度計(jì)測(cè)定在290 nm波長(zhǎng)處的吸光度（A1）。然后在37 ℃恒溫水浴鍋中水浴90 min，水浴之后滴加0.2 mL 6 mol/L HCl溶液終止反應(yīng)，再次使用紫外-可見光分光光度計(jì)測(cè)定在290 nm波長(zhǎng)處的吸光度（A2）。以每克鮮樣每小時(shí)在290 nm波長(zhǎng)處吸光度變化0.01為一個(gè)酶活力單位（U），PAL活力計(jì)算如式（3）所示。

1.3.9 抗氧化酶活力測(cè)定

過氧化物酶（peroxidase，POD）活力的測(cè)定參照Chen Zhijie等[14]的方法并作適當(dāng)修改。稱取5 g發(fā)芽大豆鮮樣，置于研缽中，加入15 mL 0.1 mol/L乙酸-乙酸鈉緩沖液（pH 5.5，內(nèi)含1 mmol/L聚乙二醇6000、質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%聚乙烯吡咯烷酮（polyvinyl pyrrolidone，PVP）和體積分?jǐn)?shù)1% Triton X-100），在冰浴條件下研磨成勻漿。將勻漿液全部轉(zhuǎn)入至離心管中，在4 ℃條件下10 000 r/min離心20 min，上清液即為酶提取液。取3 mL 25 mmol/L愈創(chuàng)木酚溶液和20 μL酶提取液，在37 ℃預(yù)保溫平衡5 min，在上述溶液中加入100 μL 0.5 mol/L H2O2啟動(dòng)反應(yīng)，以蒸餾水作為參比空白調(diào)零，測(cè)定反應(yīng)體系在470 nm波長(zhǎng)處吸光度。POD活力以每克鮮樣每分鐘在470 nm波長(zhǎng)處吸光度變化0.1為一個(gè)酶活力單位，結(jié)果表示為U/g。

過氧化氫酶（catalase，CAT）活力的測(cè)定參照Chen Zhijie等[14]的方法并作適當(dāng)修改。稱取5 g發(fā)芽大豆鮮樣，置于研缽中，加入15 mL 0.1 mol/L磷酸鈉緩沖液（pH 7.5，內(nèi)含5 mmol/L二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）和質(zhì)量分?jǐn)?shù)5% PVP），在冰浴條件下研磨成勻漿。將勻漿液全部轉(zhuǎn)入至離心管中，在4 ℃條件下10 000 r/min離心20 min，上清液即為酶提取液。取2.9 mL 20 mmol/L H2O2溶液，在25 ℃預(yù)保溫平衡5 min，在上述溶液中加入100 μL酶提取液?jiǎn)?dòng)反應(yīng)，以蒸餾水作為參比空白調(diào)零，測(cè)定反應(yīng)體系在240 nm波長(zhǎng)處吸光度。CAT活力以每克鮮樣每分鐘在240 nm波長(zhǎng)處吸光度變化0.01為一個(gè)酶活力單位，結(jié)果表示為U/g。

抗壞血酸過氧化物酶（ascorbic acid peroxidase，APX）活力的測(cè)定參照Z(yǔ)hang Zi[15]和曹建康[16]等的方法并作適當(dāng)修改。稱取5 g發(fā)芽大豆鮮樣，置于研缽中，加入15 mL 0.1 mol/L磷酸鈉緩沖液（pH 7.5，內(nèi)含0.1 mmol/L乙二胺四乙酸二鈉和1 mmol/L抗壞血酸和質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%PVP），在冰浴條件下研磨成勻漿。將勻漿液全部轉(zhuǎn)入至離心管中，在4 ℃條件下10 000 r/min離心20 min，上清液即為酶提取液。取2.6 mL 50 mmol/L磷酸鈉緩沖溶液（pH 7.5，內(nèi)含0.1 mmol/L乙二胺四乙酸二鈉和0.5 mmol/L抗壞血酸）和0.1 mL酶提取液，在25 ℃預(yù)保溫平衡5 min，在上述溶液中加入0.3 mL 2 mmol/L H2O2啟動(dòng)反應(yīng)，以蒸餾水作為參比空白調(diào)零，測(cè)定反應(yīng)體系在290 nm波長(zhǎng)處吸光度。APX活力以每克鮮樣每分鐘在290 nm波長(zhǎng)處吸光度變化0.01為一個(gè)酶活力單位，結(jié)果表示為U/g。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)3 次生物學(xué)重復(fù)，數(shù)據(jù)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用SAS 8.1軟件中Duncan’s多重比較法進(jìn)行方差分析，顯著水平為P＜0.05。采用Origin 8.5軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源GABA對(duì)發(fā)芽大豆生長(zhǎng)指標(biāo)的影響

從圖1A可以看出，外源GABA能顯著促進(jìn)發(fā)芽大豆的生長(zhǎng)（P＜0.05），且隨著GABA濃度的增加促進(jìn)作用越顯著，圖1B表明2.5、5 mmol/L外源GABA能顯著增加發(fā)芽大豆的鮮質(zhì)量（P＜0.05），5 mmol/L的GABA促進(jìn)作用最強(qiáng)，比對(duì)照提高了8.33%。相應(yīng)地，隨著外源GABA濃度的增加，發(fā)芽大豆的干質(zhì)量則顯著降低（圖1C）。上述結(jié)果表明GABA可以調(diào)控植物的生長(zhǎng)。

圖1 GABA對(duì)發(fā)芽大豆芽長(zhǎng)（A）、鮮質(zhì)量（B）和干質(zhì)量（C）的影響Fig. 1 Effect of GABA on sprout length (A), fresh mass (B) and dry mass (C) of germinated soybean

2.2 外源GABA對(duì)發(fā)芽大豆總酚含量的影響

在籽粒發(fā)芽過程中，植物細(xì)胞壁周圍的很多成分降解，使游離態(tài)和結(jié)合態(tài)的酚類化合物得以釋放，進(jìn)而使總酚含量明顯增加，且芽苗生長(zhǎng)過程中結(jié)合態(tài)酚類物質(zhì)會(huì)逐漸轉(zhuǎn)化為游離態(tài)。從圖2可看出，外源GABA能顯著提高總酚含量（P＜0.05），且隨著GABA濃度的增加總酚含量顯著增加，20 mmol/L GABA濃度下游離酚及結(jié)合酚含量分別較對(duì)照提高32.07%和26.73%，總酚含量為對(duì)照組的1.39 倍。這與GABA處理促進(jìn)芽苗生長(zhǎng)呈正相關(guān)關(guān)系。

圖2 GABA對(duì)發(fā)芽大豆總酚含量的影響Fig. 2 Effect of GABA on the content of total phenolics in germinated soybean

2.3 外源GABA對(duì)發(fā)芽大豆酚酸含量的影響

由圖3可看出，發(fā)芽大豆中游離酚酸主要是對(duì)香豆酸和香草酸，結(jié)合酚酸含量較多的是對(duì)香豆酸和丁香酸，其次是阿魏酸、香草酸和芥子酸。外源GABA能顯著提高游離酚酸及結(jié)合酚酸含量（P＜0.05）。由圖3A可知，GABA濃度越高，游離酚酸含量越高，20 mmol/L濃度下對(duì)香豆酸由2.86 μg/g增加到13.94 μg/g，香草酸則從無(wú)到8.85 μg/g。由圖3B可看出，GABA濃度為2.5 mmol/L時(shí)結(jié)合酚酸含量最高，其中對(duì)香豆酸和阿魏酸分別比對(duì)照增加了96.3%和114.9%。

圖3 GABA對(duì)發(fā)芽大豆酚酸含量的影響Fig. 3 Effect of GABA on the content of phenolic acid in germinated soybean

2.4 外源GABA對(duì)發(fā)芽大豆PAL活力的影響

圖4顯示了不同濃度GABA培養(yǎng)下發(fā)芽大豆PAL活力的變化。隨著GABA濃度的升高，發(fā)芽大豆中PAL活力呈先升高后下降趨勢(shì)。當(dāng)GABA培養(yǎng)液濃度為10 mmol/L時(shí)，PAL活力達(dá)到最大值。PAL是植物體苯丙烷類物質(zhì)代謝和木質(zhì)素合成的關(guān)鍵酶，在一定程度下能夠降低苯丙烷物質(zhì)代謝的速率。

圖4 GABA對(duì)發(fā)芽大豆PAL活力的影響Fig. 4 Effect of GABA on PAL activity of germinated soybean

2.5 外源GABA對(duì)發(fā)芽大豆抗氧化能力的影響

由圖5可看出，外源GABA對(duì)發(fā)芽大豆的抗氧化能力影響顯著。隨著GABA濃度的增加，無(wú)論游離酚酸還是結(jié)合酚的DPPH自由基清除能力和ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力均顯著提高，通過與總酚含量變化結(jié)果進(jìn)行對(duì)照分析，游離酚和結(jié)合酚的DPPH自由基清除能力和ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力均與總酚含量呈正相關(guān)。說(shuō)明外源GABA可以通過調(diào)節(jié)總酚來(lái)影響芽苗的抗氧化能力。

圖5 GABA對(duì)發(fā)芽大豆抗氧化能力的影響Fig. 5 Effect of GABA on antioxidant capacity of germinated soybean

2.6 外源GABA對(duì)發(fā)芽大豆抗氧化酶活性的影響

圖6顯示不同濃度的GABA對(duì)發(fā)芽大豆中POD、CAT和APX活力的影響顯著。隨著GABA濃度的升高，3 種抗氧化酶活力均呈先升高后下降的趨勢(shì)。當(dāng)GABA培養(yǎng)液濃度為10 mmol/L時(shí)，POD、CAT、APX活力達(dá)到最大值。表明當(dāng)GABA濃度過高時(shí)，不利于抗氧化酶活力的持續(xù)增加。

圖6 GABA對(duì)發(fā)芽大豆抗氧化酶活力的影響Fig. 6 Effect of GABA on antioxidant enzyme activity of germinated soybean

3 討 論

GABA在植物體內(nèi)具有多重生理作用，如抵御逆境、臨時(shí)供氮、刺激激素生成、調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育、傳遞信號(hào)等[17]。近年來(lái)，GABA在植物體中的生理作用已成研究熱點(diǎn)，尤其在GABA調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育、參與抵御逆境反應(yīng)方面的研究較多[18]。正常條件下，植物體中GABA含量低（約為0.03～2.00 μmol/gmf），但在逆境條件（如缺氧、冷害、酸化、干旱、機(jī)械刺激）等多種因素脅迫下GABA含量迅速升高[19]。眾多研究表明，GABA能緩解逆境脅迫對(duì)植物的傷害，外源GABA能夠提高鹽脅迫下番茄種子的發(fā)芽率[7]，能夠緩解鹽脅迫對(duì)玉米種子胚芽鞘伸長(zhǎng)的抑制作用[20]及低氧脅迫對(duì)甜瓜根系伸長(zhǎng)的抑制作用[21]，增強(qiáng)植物的抗氧化系統(tǒng)。在本研究中，隨著外源GABA濃度的增加，發(fā)芽大豆的芽長(zhǎng)呈增加趨勢(shì)，但是鮮質(zhì)量先升高后降低，干質(zhì)量則呈下降趨勢(shì)（圖1）。說(shuō)明外源GABA處理顯著促進(jìn)了發(fā)芽大豆生長(zhǎng)，增加了干物質(zhì)消耗，其中，5 mmol/L的GABA處理時(shí)發(fā)芽大豆吸水率高，發(fā)芽大豆鮮質(zhì)量最高。

目前，研究人員對(duì)GABA在植物生長(zhǎng)發(fā)育中的作用機(jī)理了解甚少，原因在于尚未克隆出植物中的GABA受體基因。已有研究發(fā)現(xiàn)，GABA可能是通過與植物體中已知的谷氨酸受體結(jié)合發(fā)揮作用，而這個(gè)谷氨酸受體的調(diào)節(jié)區(qū)域與動(dòng)物體中的GABAB受體結(jié)構(gòu)相似[22]，因而GABA可能作為一種信號(hào)分子在細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞間發(fā)揮作用。Shi Shengqing等[10]研究發(fā)現(xiàn)，在鹽脅迫下添加外源GABA處理錦雞兒根部能夠激活其體內(nèi)多重應(yīng)答機(jī)制，主要包括信號(hào)傳遞、蛋白質(zhì)降解調(diào)控、激素合成、活性氧的形成等其他代謝機(jī)制。Palanivelu等[23]研究發(fā)現(xiàn)，不同濃度梯度的GABA可能作為信號(hào)分子引導(dǎo)花粉管的伸長(zhǎng)。GABA與植物的內(nèi)源激素存在互作，可通過調(diào)節(jié)內(nèi)源激素水平來(lái)調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)。亦有研究表明，逆境脅迫誘導(dǎo)GABA合成，同時(shí)也促使乙烯的產(chǎn)生，并且GABA的產(chǎn)生要先于乙烯。用外源GABA處理離體向日葵12 h即誘導(dǎo)乙烯含量增加14 倍，同時(shí)促進(jìn)了乙烯合成的關(guān)鍵酶1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸合成酶和1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸氧化酶的基因表達(dá)水平明顯增加，但可以確定GABA不是乙烯合成的前體，推測(cè)GABA是作為一種信號(hào)分子影響相關(guān)酶的基因表達(dá)[24]。Kramer等[25]通過咖啡豆干燥工藝研究發(fā)現(xiàn)，GABA積累與干旱脅迫相關(guān)脫水素的編碼基因表達(dá)有關(guān)。馬兆武[26]用GABA和CoCl2、AgNO3（乙烯合成途徑和信號(hào)途徑的抑制劑）處理煙草幼苗，發(fā)現(xiàn)GABA分別參與了CoCl2和AgNO3對(duì)煙草ACO1基因和EIL3/4基因的表達(dá)，在6 h時(shí)能夠緩解其抑制作用，并能增強(qiáng)EIL3/4基因的表達(dá)，其分子機(jī)制尚不清楚，GABA可能作為某些途徑的信號(hào)分子參與煙草乙烯信號(hào)反應(yīng)途徑?？梢?，GABA促進(jìn)植物生長(zhǎng)和增強(qiáng)抵抗逆境的能力與其作為信號(hào)分子調(diào)控活性氧代謝、調(diào)節(jié)激素合成有關(guān)。

隨著外源GABA濃度的提高，總酚含量持續(xù)增加（圖2），游離酚酸含量的變化趨勢(shì)與總酚含量變化趨勢(shì)一致，結(jié)合酚酸含量先升高后下降，但均高于對(duì)照（圖3）。說(shuō)明GABA促進(jìn)了總酚含量的提高，同時(shí)誘導(dǎo)結(jié)合酚酸向游離酚酸的轉(zhuǎn)化。當(dāng)2.5 mmol/L的GABA處理時(shí)效果最佳。作為酚類物質(zhì)合成關(guān)鍵酶，大豆經(jīng)GABA處理后PAL活力升高，這是酚類物質(zhì)含量升高的重要因素，但是其變化趨勢(shì)與總酚含量不一致，說(shuō)明GABA對(duì)PAL的作用具有時(shí)空性[12]。此外，GABA處理還促進(jìn)了抗氧化酶活性的升高，從而增強(qiáng)了抗氧化系統(tǒng)（圖5、6）。推測(cè)其機(jī)理也與GABA調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育、傳遞信號(hào)有關(guān)，也可能與GABA刺激乙烯產(chǎn)生有關(guān)[24]，而乙烯可誘導(dǎo)植物PAL基因的表達(dá)[27]，進(jìn)而引起酚類物質(zhì)的富集。因此，GABA促進(jìn)發(fā)芽大豆生長(zhǎng)代謝的同時(shí)，增強(qiáng)了苯丙烷代謝途徑，促進(jìn)了酚類物質(zhì)的合成和結(jié)合酚酸的釋放及其向游離酚酸的轉(zhuǎn)化，并提高了抗氧化酶活力以增強(qiáng)其活性氧清除能力。

外源GABA能顯著提高發(fā)芽大豆的芽長(zhǎng)、鮮質(zhì)量，促進(jìn)發(fā)芽大豆的生長(zhǎng)。隨著GABA濃度升高，發(fā)芽大豆的總酚和游離酚酸含量逐漸增加。隨著GABA濃度的升高，結(jié)合酚酸逐漸釋放，并向游離形態(tài)轉(zhuǎn)化。GABA處理提高了DPPH自由基、ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力和POD、CAT、APX等抗氧化酶活力。可見，外源GABA顯著促進(jìn)苯丙烷代謝途徑誘導(dǎo)酚類物質(zhì)累積，且增強(qiáng)抗氧化能力與其促進(jìn)發(fā)芽大豆生長(zhǎng)有關(guān)。