姜黃素對(duì)H2O2誘導(dǎo)血小板凋亡的抑制作用及分子機(jī)制

牙甫禮，XIN Yu，張春梅，陳彬林，李瑋琪，馬永潔

（1.大理大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，預(yù)防醫(yī)學(xué)研究所，云南 大理 671000；2.大理大學(xué)代謝性疾病轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究院，云南 大理 671000；3.大理大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南 大理 671000；4.河口海關(guān)，云南 河口 661300；5.廣西壯族自治區(qū)婦幼保健院營(yíng)養(yǎng)科，廣西 南寧 530000）

心血管疾?。╟ardiovascular diseases，CVDs）的發(fā)病率和死亡率逐年上升，嚴(yán)重威脅人民的健康，動(dòng)脈粥樣硬化和血栓形成是CVDs致死的主要原因[1-2]。動(dòng)脈粥樣硬化和血栓形成的機(jī)制錯(cuò)綜復(fù)雜，近年來大量報(bào)道證明了血小板凋亡在其中發(fā)揮著極為關(guān)鍵的作用[3-4]。在某些CVDs患者的外周血中，機(jī)體高水平的氧化應(yīng)激（如活性氧（reactive oxygen species，ROS）和超氧化物水平）等因素可促使血小板發(fā)生線粒體凋亡[5-6]。在血小板發(fā)生線粒體凋亡的過程中，Bcl-2家族的抗凋亡蛋白（Bcl-2和Bcl-xL等）和促凋亡蛋白（Bax和Bak等）在線粒體和細(xì)胞質(zhì)中重新分布，能夠引起血小板線粒體膜電位（ΔΨm）發(fā)生去極化和線粒體通透轉(zhuǎn)換孔的形成，繼而導(dǎo)致細(xì)胞色素c釋放增多，并激活Caspase-9和Caspase-3，引起細(xì)胞表面磷脂酰絲氨酸（phosphatidylserine，PS）暴露，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[7]。鑒于血小板凋亡在CVDs中的重要作用，抑制血小板凋亡極有可能成為防治CVDs的重要途徑之一。

營(yíng)養(yǎng)膳食干預(yù)在CVDs的早期防治中一直起著重要的作用[8-9]。姜黃素（curcumin，Cur）是存在于姜科植物根莖中的一種多酚類化合物，也是香料姜黃中最重要的組成成分[10-11]。研究表明，Cur具有多種生物學(xué)活性，如在CVDs防治方面，Cur可改善糖脂代謝紊亂、抑制動(dòng)脈斑塊和血栓形成等[12-13]。體外實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，Cur可抑制激動(dòng)劑誘導(dǎo)的血小板聚集和活化[14]。對(duì)于Cur調(diào)控細(xì)胞凋亡方面，大部分的研究主要集中在探討其對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡的影響[15-16]，但是Cur對(duì)H2O2誘導(dǎo)的血小板凋亡是否起調(diào)控作用尚鮮見報(bào)道。因此，鑒于血小板凋亡在CVDs發(fā)生發(fā)展中的重要作用，本研究主要通過體外實(shí)驗(yàn)來探討Cur對(duì)H2O2誘導(dǎo)的健康人血小板凋亡的影響及其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

ROS檢測(cè)試劑盒、超氧化物檢測(cè)試劑盒 英國(guó)Abcam公司；Cur粉末、H2O2美國(guó)Sigma-Aldrich公司；一抗Bax、Bak、細(xì)胞色素c、β-actin以及相應(yīng)的二抗 美國(guó)CST公司；5,5’,6,6’-四氯-1,1’,3,3’-四乙基苯并咪唑羰花青碘化物（JC-1） 美國(guó)Enzo Life Sciences公司；Caspase-3和Caspase-9活力檢測(cè)試劑盒、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒上海碧云天生物技術(shù)有限公司；PE-Annexin V檢測(cè)試劑盒 美國(guó)eBioscience公司。

1.2 儀器與設(shè)備

CytoFlex流式細(xì)胞儀 美國(guó)Beckman Coulter公司；BCD-4.8.5低溫冰箱 中國(guó)青島海爾有限公司；POLARstar OPTIMA多功能酶標(biāo)儀 德國(guó)BMG Labtech公司；低溫高速離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 研究對(duì)象篩選

從大理大學(xué)校內(nèi)招募到15 名符合條件的健康志愿者（25～40 歲）。在志愿者篩選的過程中，志愿者出現(xiàn)以下至少一種情況將給予排除：現(xiàn)在或曾經(jīng)患有CVDs、免疫缺陷、惡性腫瘤等疾病；酗酒、吸煙、濫用藥物半年以上；在至少兩周內(nèi)未服用任何抗血小板的藥物，且近半年內(nèi)未服用維生素等膳食營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑[17]。

1.3.2 健康人血樣及純化血小板的制備

本研究完全按照《赫爾辛基宣言》人體醫(yī)學(xué)研究的倫理準(zhǔn)則進(jìn)行，在實(shí)施前，每個(gè)志愿者均已簽署知情同意書，且該研究已通過大理大學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。在清晨空腹?fàn)顟B(tài)下，抽取健康志愿者靜脈血15 mL，注入含枸櫞酸鈉的真空抗凝管中，然后在22 ℃、300×g離心7 min，小心吸取上清液，可得到富血小板血漿，并將其保存在37 ℃恒溫孵育箱中備用。純化血小板的制備過程采用本實(shí)驗(yàn)室成熟的分離方法，具體方法參照文獻(xiàn)[17-18]。

1.3.3 Cur對(duì)血小板細(xì)胞毒性的影響

采用LDH細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒進(jìn)行Cur對(duì)血小板細(xì)胞毒性影響的測(cè)定。用不同濃度（1、5、10、20、40、80、100、120、150、200 μmol/L）的Cur、溶劑對(duì)照（體積分?jǐn)?shù)為0.05%的DMSO，即對(duì)照組）、質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulphate，SDS）分別與健康人純化血小板共同孵育30 min，然后22 ℃、12 000×g離心5 min，利用酶標(biāo)儀于490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定上清液的吸光度，并以吸光度表征LDH的含量。實(shí)驗(yàn)過程中，將質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的SDS作為陽性組，用來刺激血小板釋放全部LDH（即血小板LDH總量）。血小板LDH漏出率按下式計(jì)算[17]。

1.3.4 實(shí)驗(yàn)分組

血小板功能調(diào)控實(shí)驗(yàn)分組包括靜息組：不經(jīng)任何處理（既不經(jīng)H2O2激活，也不經(jīng)DMSO處理）的血小板懸液；對(duì)照組：即溶劑對(duì)照組，因?yàn)樵诒緦?shí)驗(yàn)中，Cur粉末用DMSO溶解，所以對(duì)照組血小板中僅加入體積分?jǐn)?shù)0.05%的DMSO；Cur組：分為3 個(gè)濃度梯度，分別為Cur（1 μmol/L）、Cur（10 μmol/L）和Cur（100 μmol/L）；其中對(duì)照組和Cur組均經(jīng)H2O2（100 μmol/L）刺激。

1.3.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)血小板線粒體膜電位

用不同濃度（1、10、100 μmol/L）的Cur與純化血小板在體外共同孵育30 min后，12 000×g離心5 min，棄上清液，重懸血小板，加入H2O2（100 μmol/L）繼續(xù)孵育60 min，孵育完成后，將純化血小板懸液（1×106個(gè)/mL）加入流式上樣管中，并加入終質(zhì)量濃度為1 μg/mL的JC-1工作液，并迅速?gòu)梽?，在室溫下避光孵?0 min后加入磷酸鹽緩沖液，立即使用CytoFLEX流式細(xì)胞儀檢測(cè)血小板ΔΨm水平[18]。用JC-1單體相對(duì)含量來表示血小板ΔΨm去極化水平，以此衡量細(xì)胞凋亡程度。

1.3.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)血小板表面PS暴露水平

將經(jīng)不同濃度的Cur（1、10、100 μmol/L）和H2O2（100 μmol/L）干預(yù)的血小板懸液（1×106個(gè)/mL）以每管50 μL的體積加入流式上樣管中，同時(shí)避光加入終質(zhì)量濃度為1 mmol/L的CaCl2溶液以及2.5 μL的Annexin V抗體，混勻后避光孵育15 min，加入終止液，在30 min內(nèi)用CytoFLEX流式細(xì)胞儀檢測(cè)血小板表面PS的暴露水平，并使用CytExpert 2.0軟件分析結(jié)果[18]。

1.3.7 血小板Caspase-3和Caspase-9活化水平的測(cè)定

血小板Caspase-3和Caspase-9的活化水平按照試劑盒說明書進(jìn)行測(cè)定。將不同濃度的Cur或溶劑對(duì)照與健康成人純化血小板在體外共同孵育30 min后，12 000×g離心5 min，棄上清液，重懸血小板，加入H2O2（100 μmol/L）繼續(xù)孵育60 min，孵育完成后，加入相應(yīng)的底物，室溫下避光孵育30 min后，在激發(fā)波長(zhǎng)為485 nm和發(fā)射波長(zhǎng)為515 nm的條件下讀取熒光值，用來反映細(xì)胞內(nèi)Caspase-3的活化水平。檢測(cè)Caspase-9的活化水平時(shí)，將處理好的純化血小板在4 ℃、12 000×g下離心5 min，對(duì)血小板沉淀進(jìn)行冰浴裂解15 min后，收取上清液，測(cè)定蛋白濃度后加入Ac-LEHD-pNA，并于37 ℃孵育60 min，然后在405 nm波長(zhǎng)處進(jìn)行吸光度的測(cè)定，用來反映Caspase-9的活化水平。

1.3.8 血小板總ROS和超氧化物生成水平的測(cè)定

將不同濃度的Cur或溶劑對(duì)照與健康人純化血小板（1×106個(gè)/mL）共同孵育30 min，12 000×g離心5 min，棄上清液后，重懸血小板，加入H2O2（100 μmol/L）繼續(xù)孵育60 min，各個(gè)組吸取80 μL的血小板懸液至新的離心管中，然后加入10 μL的氧化應(yīng)激檢測(cè)液（20 μmol/L）和10 μL的超氧化物檢測(cè)試劑液（20 μmol/L），避光孵育，然后在4 ℃、12 000×g離心5 min，棄上清后重懸血小板，再次在4 ℃、12 000×g離心5 min，然后用磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）潤(rùn)洗血小板3 次，最后在激發(fā)波長(zhǎng)490 nm和發(fā)射波長(zhǎng)525 nm條件下讀取熒光強(qiáng)度，以反映胞內(nèi)總ROS水平，在激發(fā)波長(zhǎng)550 nm和發(fā)射波長(zhǎng)620 nm條件下讀取熒光強(qiáng)度，以反映超氧化物水平[17]。

1.3.9 Western blot蛋白免疫印跡分析

經(jīng)Cur和H2O2處理后，將純化血小板懸液4 ℃、10 000×g離心15 min，收集血小板沉淀，冰上裂解30 min，再次4 ℃、10 000×g離心15 min后收集上清得到血小板蛋白，并進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜并分別加入一抗（Bax、Bak、細(xì)胞色素c和β-actin）和相應(yīng)的二抗后，對(duì)條帶進(jìn)行曝光，其灰度則用Quantity One分析軟件進(jìn)行計(jì)算分析[17-19]。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示。采用GraphPad Prism 5.0軟件作圖。采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行多組間兩兩比較，采用單因素方差分析，雙側(cè)P＜0.05代表差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 Cur對(duì)血小板細(xì)胞毒性的影響

如圖1所示，用不同濃度的Cur干預(yù)血小板后，與對(duì)照組（體積分?jǐn)?shù)0.05% DMSO）相比，Cur濃度在1～120 μmol/L范圍內(nèi)，各組LDH漏出率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），但均顯著低于10% SDS組（P＜0.05）；而Cur濃度為150、200 μmol/L時(shí)，其LDH漏出率顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），因此可以認(rèn)為在1～120 μmol/L的濃度范圍內(nèi)，Cur對(duì)健康人純化血小板無明顯的細(xì)胞毒性作用。另外，結(jié)合其他文獻(xiàn)報(bào)道中所用的Cur濃度[20]，本實(shí)驗(yàn)最終選擇1、10 μmol/L和100 μmol/L進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 Cur對(duì)血小板細(xì)胞毒性的影響Fig. 1 Cytotoxic effect of Cur on platelets

2.2 Cur對(duì)H2O2誘導(dǎo)的血小板ΔΨm去極化和PS暴露水平的影響

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明，H2O2刺激后，與靜息組血小板相比，血小板JC-1單體相對(duì)含量明顯提高，如圖2A所示。說明H2O2可促進(jìn)血小板ΔΨm去極化，血小板發(fā)生凋亡。而經(jīng)不同濃度的Cur干預(yù)后，Cur組與對(duì)照組相比，JC-1單體相對(duì)含量顯著降低（P＜0.05），但是不同濃度Cur組之間相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），說明Cur可顯著抑制H2O2誘導(dǎo)的血小板ΔΨm去極化；同時(shí)，如圖2B所示，10 μmol/L和100 μmol/L的Cur可顯著降低H2O2誘導(dǎo)的血小板表面PS暴露水平（P＜0.05），相對(duì)于1 μmol/L的Cur，100 μmol/L組對(duì)PS暴露的降低作用更顯著（P＜0.05）。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，一定濃度的Cur可顯著抑制H2O2誘導(dǎo)的血小板凋亡。

圖2 Cur對(duì)H2O2誘導(dǎo)的血小板ΔΨm去極化（A）和PS暴露水平（B）的影響Fig. 2 Effect of Cur on H2O2-induced platelet ΔΨm depolarization (A)and PS exposure (B)

2.3 Cur對(duì)H2O2誘導(dǎo)的血小板Caspase-9和Caspase-3活化的影響

如圖3所示，與對(duì)照組相比，10 μmol/L和100 μmol/L的Cur均可顯著抑制H2O2誘導(dǎo)的血小板Caspase-9和Caspase-3活化（P＜0.05），但是低濃度（1 μmol/L）的Cur并不能顯著抑制H2O2誘導(dǎo)的血小板Caspase-9和Caspase-3活化（P＞0.05）；此外，100 μmol/L的Cur相對(duì)于1 μmol/L的Cur，對(duì)血小板Caspase-9和Caspase-3活化的抑制作用更為顯著（P＜0.05）。

圖3 Cur對(duì)H2O2誘導(dǎo)的血小板Caspase-9（A）和Caspase-3（B）活化水平的影響Fig. 3 Effect of Cur on H2O2-induced platelet caspase-9 (A) and caspase-3 (B) activation level

2.4 Cur對(duì)H2O2誘導(dǎo)的血小板凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

如圖4A、B所示，H2O2可明顯上調(diào)血小板Bax和Bak的相對(duì)表達(dá)量，10 μmol/L和100 μmol/L的Cur可顯著抑制H2O2誘導(dǎo)的Bax相對(duì)表達(dá)量提升（P＜0.05），各Cur組間相比，100 μmol/L相對(duì)于1 μmol/L的Cur對(duì)Bax表達(dá)的抑制作用更為顯著（P＜0.05）。只有100 μmol/L的Cur可顯著抑制Bak的相對(duì)表達(dá)量（P＜0.05）；10 μmol/L和100 μmol/L兩組間相比，對(duì)Bak表達(dá)的抑制作用也存在顯著差異（P＜0.05）。如圖4C所示，Western blot分析結(jié)果表明，H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞色素c蛋白相對(duì)表達(dá)量可被10 μmol/L和100 μmol/L的Cur顯著下調(diào)（P＜0.05），各Cur組間的比較結(jié)果與Bak比較結(jié)果一致。

圖4 Cur對(duì)H2O2誘導(dǎo)的血小板Bax（A）、Bak（B）和細(xì)胞色素c（C）表達(dá)的影響Fig. 4 Effect of Cur on the expression of Bax (A), Bak (B) and cytochrome c (C) in H2O2-induced platelets

2.5 Cur對(duì)H2O2誘導(dǎo)的血小板氧化應(yīng)激水平的影響

如圖5A、B所示，H2O2刺激血小板后，胞內(nèi)總ROS水平和超氧化物水平較靜息組血小板明顯升高，經(jīng)不同濃度的Cur干預(yù)后，10 μmol/L和100 μmol/L的Cur可顯著抑制H2O2誘導(dǎo)的血小板內(nèi)ROS水平和超氧化物生成（P＜0.05），通過對(duì)各Cur組間進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)各組間無顯著劑量依賴關(guān)系。以上結(jié)果說明，Cur可顯著降低H2O2誘導(dǎo)的血小板氧化應(yīng)激水平。

圖5 Cur對(duì)H2O2誘導(dǎo)的血小板總ROS水平（A）和超氧化物生成水平（B）的影響Fig. 5 Effect of Cur on total ROS (A) and superoxide generation (B) in H2O2-induced platelets

3 討 論

大量的研究表明，血小板凋亡參與多種CVDs的發(fā)生和發(fā)展過程，例如在高脂血癥、糖尿病、心肌梗死等疾病中，高水平的氧化應(yīng)激可誘導(dǎo)血小板發(fā)生凋亡，進(jìn)而加速血栓的形成[5]。血小板凋亡后可釋放大量的血小板微粒（platelet-derived microparticles，PMPs），近年來大量的研究已經(jīng)證實(shí)了循環(huán)中的PMPs是促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化以及血栓形成進(jìn)而加速CVDs發(fā)生發(fā)展最重要的因素之一[21-23]。主要原因是PMPs表面的PS具有很強(qiáng)的促凝血功能，通過增加促凝活性，進(jìn)而促進(jìn)凝血酶的生成與釋放，從而加速血栓的形成和發(fā)展[22,24]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Cur可顯著抑制H2O2誘導(dǎo)的血小板凋亡，更重要的是，可抑制血小板表面PS的暴露水平，這很有可能是Cur防治CVDs中血栓形成和發(fā)展的一個(gè)重要機(jī)制。然而，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，膳食補(bǔ)充Cur對(duì)血小板凋亡以及PMPs產(chǎn)生是否有影響則需要進(jìn)一步證實(shí)。另外，大量的研究表明，血小板內(nèi)源性凋亡通路對(duì)于介導(dǎo)CVDs中血小板凋亡起主要作用[7]。本研究發(fā)現(xiàn)，Cur能夠抑制內(nèi)源性凋亡通路，例如抑制H2O2誘導(dǎo)的血小板Bax、Bak和細(xì)胞色素c的表達(dá)，并抑制ΔΨm發(fā)生去極化，進(jìn)而抑制Caspase-9和Caspase-3的活化，最終抑制血小板凋亡。但是Cur是否作用于血小板外源性凋亡通路及其具體機(jī)制仍需進(jìn)一步探討。此外，研究表明，凋亡的血小板在形態(tài)上表現(xiàn)為質(zhì)膜起泡、偽足延伸以及細(xì)胞體積收縮等[7]，而Cur對(duì)血小板凋亡過程中形態(tài)學(xué)的影響需要更深一步的研究和探討。

在CVDs中，盡管調(diào)控血小板凋亡的機(jī)制是錯(cuò)綜復(fù)雜的，但是大多數(shù)研究認(rèn)為氧化應(yīng)激對(duì)于調(diào)控血小板凋亡起關(guān)鍵作用[5,25]。例如在糖尿病患者中，血小板凋亡水平提高，與其細(xì)胞內(nèi)過量的ROS密切相關(guān)[26]；體外實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，H2O2可直接促進(jìn)血小板凋亡[27]。本研究發(fā)現(xiàn)，Cur可顯著抑制H2O2誘導(dǎo)的血小板內(nèi)總ROS水平和超氧化物生成，這可能是Cur抑制H2O2誘導(dǎo)血小板凋亡的一個(gè)重要機(jī)制。大量的研究也證實(shí)，Cur具有較強(qiáng)的抗氧化能力，這也是Cur發(fā)揮防治CVDs的重要機(jī)制之一[28-29]。然而，在本研究中，Cur經(jīng)抑制氧化應(yīng)激調(diào)控血小板凋亡的機(jī)制尚不清楚，仍需要進(jìn)一步探討。另外，研究表明，在某些CVDs狀態(tài)下，機(jī)體外周血中可檢測(cè)到的H2O2濃度范圍為5～200 μmol/L，因此本研究選擇的H2O2濃度為100 μmol/L，與其他文獻(xiàn)報(bào)道的用于刺激血小板的H2O2濃度相一致[27]。

中藥材姜黃中的有效成分很多，其中Cur、去甲氧基姜黃素和二去甲氧基姜黃素對(duì)血小板凋亡的作用是不一樣的，例如Cur和去甲氧基姜黃素不影響靜息的血小板凋亡，而二去甲氧基姜黃素可顯著促進(jìn)靜息的血小板凋亡[30]。說明Cur類化合物的生物活性可能具有多樣性，而且其中各成分的藥理作用可能不盡相同。Cur作為膳食補(bǔ)充劑在CVDs中發(fā)揮重要作用[31-33]，咖喱中富含Cur，日常生活中經(jīng)常食用咖喱的人群，Cur日攝入量可達(dá)260 mg，并且膳食補(bǔ)充Cur的安全劑量也是相對(duì)較高的，研究表明，健康成人每日攝入10 g的Cur也未觀察到毒副作用[34]。本研究所用的Cur濃度范圍為1～100 μmol/L，與其他報(bào)道的體外研究中所使用的Cur濃度相近[20]。值得注意的是，盡管有研究表明Cur具有防治多種慢性病的作用，但是通過膳食補(bǔ)充Cur，其生物利用度很低，這是Cur在臨床上使用受限的最主要因素。大量研究表明，膳食攝入Cur后，發(fā)揮對(duì)健康有益作用的物質(zhì)極有可能是其腸道代謝物[10]。有研究表明，代謝物四氫姜黃素具有吸收性好、活性強(qiáng)等特點(diǎn)，因此在有些疾病的防治中可能比Cur具有更大的使用價(jià)值[34]。目前學(xué)者們也不斷研發(fā)出新的技術(shù)以提高Cur的生物利用度和穩(wěn)定性，如采用納米粒子或者脂質(zhì)體與Cur結(jié)合可大大提高Cur的生物利用度和生物活性[10]。本研究通過體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)了Cur具有抑制H2O2誘導(dǎo)血小板凋亡的作用，但是膳食補(bǔ)充Cur對(duì)血小板凋亡的調(diào)控作用仍需體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步深入探討。綜上，本研究從營(yíng)養(yǎng)膳食或從功能食品途徑為Cur防治CVDs提供了一定的理論依據(jù)和應(yīng)用價(jià)值。