郭 聰，陳 燕，王 瑩，談 峰，柯裴蓓，沙文鋒，李玉娟

（江蘇沿江地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，江蘇 南通 226541）

美國(guó)紅楓Acer rubrum，又叫紅花槭，槭樹(shù)科槭屬落葉喬木，主要分布于美國(guó)北部及加拿大大部分地區(qū)。因其秋季色彩奪目，樹(shù)冠整潔，既可以園林造景又可以做行道樹(shù)，是城市園林綠化的理想樹(shù)種之一，也是唯一可以用作行道樹(shù)的彩葉樹(shù)種。近年來(lái)，關(guān)于美國(guó)紅楓的報(bào)道主要集中在栽培管理[1-2]、生理生化[3-4]以及組織培養(yǎng)[5-6]等方面，而對(duì)美國(guó)紅楓種質(zhì)資源遺傳性評(píng)價(jià)和保護(hù)、分子育種等方面的研究較少。

簡(jiǎn)單重復(fù)序列（Simple sequence repeat,SSR）廣泛分布于真核生物基因組中，是由1～6 個(gè)堿基為重復(fù)單位組成的串聯(lián)重復(fù)DNA 序列，具有多態(tài)性高、重復(fù)性好、標(biāo)記數(shù)量多等特點(diǎn)，是林木遺傳育種研究中的一種輔助育種方法[7-9]。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，SSR 技術(shù)也被廣泛應(yīng)用于植物分子輔助育種、遺傳圖譜的繪制以及種質(zhì)資源遺傳多樣性等方面的研究。周宵等[10]基于木本油料植物光皮樹(shù)葉片轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，篩選出12 538 個(gè)SSR 位點(diǎn)，并根據(jù)正交實(shí)驗(yàn)研究出SSR-PCR 反應(yīng)體系最佳組合。張振等[11]從紅松轉(zhuǎn)錄組中41 476 條Unigene 中篩選出1 757 個(gè)SSR位點(diǎn)，并對(duì)SSR 序列的數(shù)量、分布特征進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析，印證了利用紅松轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)開(kāi)發(fā)SSR 標(biāo)記的可行性。蔡年輝等[12]基于SSR 分子標(biāo)記技術(shù)，對(duì)不同生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)等級(jí)云南松林木遺傳多樣性變異進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)林木生長(zhǎng)分化對(duì)遺傳多樣性的影響不明顯。程健弘[13]利用已開(kāi)發(fā)的95 對(duì)SSR多態(tài)性引物分析了杉木育種群體的連鎖不平衡程度、遺傳多樣性和群體結(jié)構(gòu)。李博[14]在構(gòu)建毛白楊和毛新楊轉(zhuǎn)錄組圖譜中，增加了若干SSRs 標(biāo)記的分析來(lái)進(jìn)行比較作圖的研究。目前，SSR 分子標(biāo)記技術(shù)已在很多園林植物中進(jìn)行了遺傳多樣性分析、群體構(gòu)建、遺傳圖譜的構(gòu)建等方面的研究和應(yīng)用，為品種保護(hù)、種群分布、系統(tǒng)進(jìn)化等方面的研究提供了重要的依據(jù)。但是美國(guó)紅楓與其他的園林植物相比，在遺傳多樣性、分子標(biāo)記輔助育種等方面仍存在很大的差距。并且目前并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)關(guān)于美國(guó)紅楓SSR 標(biāo)記的報(bào)道，這嚴(yán)重限制了美國(guó)紅楓微衛(wèi)星的開(kāi)發(fā)、遺傳多樣性的研究、品種選育等工作的開(kāi)展。

本研究中以美國(guó)紅楓轉(zhuǎn)色期的不同葉色的葉片為材料，通過(guò)Illumina HiSeq 高通量平臺(tái)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，從其獲得搜索到大量的SSR 位點(diǎn)，并對(duì)其進(jìn)行序列分布特征、堿基重復(fù)類型、引物設(shè)計(jì)等方面進(jìn)行分析。通過(guò)對(duì)美國(guó)紅楓SSR 位點(diǎn)的分析，豐富了美國(guó)紅楓SSR 位點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)，有助于開(kāi)發(fā)選育優(yōu)良美國(guó)紅楓品種的分子標(biāo)記，為今后美國(guó)紅楓品種選育、功能基因的開(kāi)發(fā)等研究提供基礎(chǔ)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

本試驗(yàn)所使用的美國(guó)紅楓葉片材料來(lái)自于江蘇沿江地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所休閑農(nóng)業(yè)研究室苗圃中。于2017年秋季（美國(guó)紅楓葉片轉(zhuǎn)色期間）選取葉色穩(wěn)定、長(zhǎng)勢(shì)健壯的美國(guó)紅楓，分別采集著生于植株上部、中部、下部的紅葉、花葉、青葉各約0.2 g，每組葉片分別取3 個(gè)重復(fù)，速凍液氮中備用。

將采集的美國(guó)紅楓葉片送至北京百邁客生物科技有限公司，利用Illumina HiSeq 進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。

1.2 序列的拼接

對(duì)原始數(shù)據(jù)（Raw data）進(jìn)行數(shù)據(jù)過(guò)濾，去除其中的接頭序列及低質(zhì)量的Reads 獲得高質(zhì)量的Clean data。使用Trinity 組裝軟件將Reads 打斷為較短的片段，然后將這些小片段延伸成較長(zhǎng)的片段（Contig），并利用這些片段之間的重疊，得到片段集合（Component），最后利用De bruijn 作圖方法和測(cè)序Read 信息，在各個(gè)片段集合中分別識(shí)別轉(zhuǎn)錄本序列（Unigene）。

1.3 SSR 位點(diǎn)搜索

使用MISA（MicroSatellite identification tool）軟件對(duì)美國(guó)紅楓1 kb 以上的Unigene 進(jìn)行SSR 位點(diǎn)搜索。搜索的標(biāo)準(zhǔn)為：?jiǎn)螇A基重復(fù)SSR 重復(fù)次數(shù)至少為10；雙堿基重復(fù)SSR 重復(fù)次數(shù)至少為6；四堿基重復(fù)SSR、五堿基重復(fù)SSR 和六堿基重復(fù)SSR 重復(fù)次數(shù)均至少為5；復(fù)合型重復(fù)SSR 包含至少2 個(gè)SSR，且之間距離小于100 bp。所篩選的序列使用Prime 3 軟件進(jìn)行引物的設(shè)計(jì)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2016 軟件對(duì)美國(guó)紅楓轉(zhuǎn)錄組中的SSR 分布和序列特征進(jìn)行分析，包括SSR 位點(diǎn)基元類型、出現(xiàn)頻率、SSR 分布的平均距離以基元組成等。其中，微衛(wèi)星總數(shù)與總Unigene 的長(zhǎng)度之比為SSR 位點(diǎn)的平均距離；微衛(wèi)星總數(shù)與Unigene的總序列數(shù)量之比為SSR 出現(xiàn)頻率[15]。

2 結(jié)果與分析

2.1 美國(guó)紅楓轉(zhuǎn)錄組SSR 位點(diǎn)的分布特征

利用Illumina Hi-Seq 對(duì)美國(guó)紅楓不同葉色的葉片進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，經(jīng)序列拼接，共獲得去冗余的Unigene 78 571 條，其中長(zhǎng)度≥1 kb 的Unigene 共23 278 條，總長(zhǎng)度為48 624 939 bp。通過(guò)MISA軟件進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)了12 974個(gè)SSR位點(diǎn)，出現(xiàn)頻率為55.75%，分布平均距離為3 747.88 bp（表1）。

表1 美國(guó)紅楓轉(zhuǎn)錄組各SSR 位點(diǎn)的分布特征Table 1 The distribution characteristics of various SSR loci in American red maple

美國(guó)紅楓轉(zhuǎn)錄組中的SSR 重復(fù)堿基類型共有7種，由表1可知，重復(fù)率最高的堿基類型為單堿基，占總數(shù)的54.12%，其次為雙堿基和三堿基，分別占20.64%和16.19%，其他的重復(fù)堿基類型較低。各重復(fù)堿基類型的SSR 出現(xiàn)頻率差別也較大，單堿基重復(fù)類型出現(xiàn)頻率最高，為30.17%，而六堿基重復(fù)類型出現(xiàn)頻率最低，為0.03%。從SSR 分布平均距離來(lái)看，六堿基重復(fù)類型的SSR 分布平均距離最高，為8 104 156.50 bp。

2.2 美國(guó)紅楓轉(zhuǎn)錄組SSR 重復(fù)基元分析

美國(guó)紅楓轉(zhuǎn)錄組中的SSR 重復(fù)基元的序列特征列于表2?？紤]到SSR 存在堿基互補(bǔ)作用，單堿基到六堿基重復(fù)出現(xiàn)的基元種類數(shù)分別為2、5、30、41、13、6 種。單堿基到四堿基重復(fù)基元的數(shù)量呈不均衡的分布。其中，單堿基、雙堿基、三堿基重復(fù)基元數(shù)量最多的類型分別為A（3 553 個(gè)，占總SSR 27.39%）、AT（564 個(gè)，占總SSR 4.35%）、GAA（131 個(gè)，占總SSR 1.01%）。四堿基中有3種類型的重復(fù)基元數(shù)量最多，分別為AAAT（5 個(gè)，占總SSR 0.04%）、TTCT（5 個(gè)，占總SSR 0.04%）、TTTA（5 個(gè)，占總SSR 0.04%）。而五堿基和六堿基的重復(fù)基元的數(shù)量分布均勻，所有的基元均只有1 個(gè)。

表2 美國(guó)紅楓轉(zhuǎn)錄組的SSR 重復(fù)基元序列特征Table 2 Characteristics of SSR repeat motif sequence in American red maple

由于五堿基重復(fù)基元和六堿基重復(fù)基元數(shù)量均較低，均在總SSR 的0.01%以下，因此，僅把單堿基、雙堿基、三堿基和四堿基的基序分布頻率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。如圖1所示，單堿基的主要重復(fù)基序?yàn)锳/T，占總SSR 的53.95%（共7 000 個(gè)）；雙堿基的主要重復(fù)基序?yàn)锳T/TA，占總SSR 的8.00%（共1 039 個(gè)），最低的雙堿基重復(fù)基序是CA/TG，占總SSR 的0.89%（共116 個(gè)）；三堿基的主要重復(fù)基序?yàn)镚AA/TTC，占總SSR的1.65%（共214 個(gè)），最低的為T(mén)AG/CTA，僅占總SSR的0.06%（共8 個(gè)）；四堿基的重復(fù)基序均較低，均在0.05%以下。

圖1 美國(guó)紅楓轉(zhuǎn)錄組中不同的SSR 基序類型比例Fig.1 Different SSR motif proportions in American red maple

2.3 美國(guó)紅楓轉(zhuǎn)錄組各個(gè)基元重復(fù)次數(shù)分析

SSR 重復(fù)次數(shù)決定著重復(fù)堿基序列的長(zhǎng)度，從而影響SSR 多態(tài)性[16]。美國(guó)紅楓轉(zhuǎn)錄組SSR 中單堿基到六堿基各基元重復(fù)次數(shù)在5～22 次之間均具有較大的分布。由圖2可知，單堿基重復(fù)SSR 重復(fù)次數(shù)在≥10 次上都具有較大的分布，共4 927 個(gè)，占總SSR 的37.98%；而雙堿基到六堿基重復(fù)SSR 主要分布在5～10 次之間，且雙堿基到六堿基重復(fù)SSR 隨著重復(fù)次數(shù)的增加，SSR 數(shù)量呈下降的趨勢(shì)。

圖2 美國(guó)紅楓轉(zhuǎn)錄組SSR 不同重復(fù)類型的重復(fù)次數(shù)Fig.2 SSR repeat types with different number of repeats in American red maple

2.4 美國(guó)紅楓轉(zhuǎn)錄組SSR 重復(fù)片段長(zhǎng)度分析

美國(guó)紅楓轉(zhuǎn)錄組中單堿基到六堿基重復(fù)SSR 序列長(zhǎng)度分布差異顯著，總體長(zhǎng)度的變化在10～48 bp 之間，平均長(zhǎng)度為18.43 bp。單堿基重復(fù)至六堿基重復(fù)的平均序列長(zhǎng)度分別為11.80、14.45、16.21、20.44、25.38、37.00 bp（表1），其中六堿基重復(fù)SSR 序列長(zhǎng)度變化幅度最大，最小的為30 bp，最長(zhǎng)達(dá)48 bp。其次是單堿基（10～23 bp）、雙堿基（12～24 bp）、四堿基（20～32 bp）、三堿基（15～24 bp），最后五堿基的變化幅度最小，最小的為25 bp，最長(zhǎng)的為30 bp。另外，總體長(zhǎng)度分布中可以看出，美國(guó)紅楓單堿基到六堿基的SSR 位點(diǎn)中長(zhǎng)度為10 bp 最多，共2 805 個(gè)，占總SSR 的21.62%，并且隨著片段長(zhǎng)度的增加，其對(duì)應(yīng)的SSR數(shù)量呈下降的趨勢(shì)（圖3）。

圖3 美國(guó)紅楓轉(zhuǎn)錄組中SSR 長(zhǎng)度分布Fig.3 SSR length distribution in American red maple

2.5 美國(guó)紅楓轉(zhuǎn)錄組SSR 位點(diǎn)的引物設(shè)計(jì)

為了篩選出可應(yīng)用于試驗(yàn)中的美國(guó)紅楓SSR，根據(jù)美國(guó)紅楓SSR 位點(diǎn)兩端的互補(bǔ)序列設(shè)計(jì)引物，以為后續(xù)試驗(yàn)打下基礎(chǔ)。本研究中根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序所獲得的基因序列，按照引物的設(shè)計(jì)原則，利用Primer 3 軟件對(duì)12 974 個(gè)美國(guó)紅楓SSR 進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，每個(gè)SSR 最多設(shè)計(jì)3 對(duì)引物（表3～4）。結(jié)果表明，共有10 751 個(gè)SSR 符合引物設(shè)計(jì)要求，共設(shè)計(jì)出32 253 對(duì)引物，占總SSR 的82.87%，包括單堿基重復(fù)SSR 5 931 個(gè)，雙堿基重復(fù)SSR 2 076 個(gè)，三堿基重復(fù)SSR 1 828個(gè)，四堿基重復(fù)SSR 72 個(gè)，五堿基重復(fù)SSR 11 個(gè)，六堿基重復(fù)SSR 6 個(gè)，以及復(fù)合型重復(fù)SSR830 個(gè)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，符合引物設(shè)計(jì)要求且長(zhǎng)度在20 bp 以上的共1 081 個(gè)SSR 位點(diǎn)，但這些特異性引物是否具有多態(tài)性，還需進(jìn)一步驗(yàn)證。

表3 美國(guó)紅楓轉(zhuǎn)錄組的SSR 引物信息Table 3 SSR Primer Information in American red maple

表4 部分SSR 重復(fù)類型及引物序列Table 4 Partial SSR repeat types and primer sequences

續(xù)表4Continuation of table 4

3 結(jié)論與討論

3.1 討 論

對(duì)美國(guó)紅楓不同葉色進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，共獲得Unigene 78 571 條。對(duì)1 kb 以上的Unigene 序列（23 278）進(jìn)行SSR 位點(diǎn)的搜索，發(fā)現(xiàn)12 974 個(gè)SSR 位點(diǎn)，出現(xiàn)的頻率為55.75%，高于馬尾松[17]（3.45%）、云南松[18]（3.07%）、南方紅豆杉[19]（2.07%）、藍(lán)靛果忍冬[20]（32.51%）、短絲木犀[21]（4.64%）、杜仲[15]（2.90%）等木本植物；美國(guó)紅楓轉(zhuǎn)錄組SSR 分布平均距離為3.75kb，低于馬尾松[17]（15.97 kb）、云南松[18]（29.00 kb）、南方紅豆杉[19]（18.01 kb）、短絲木犀[21]（15.02 kb）、杜仲[15]（26.31 kb）等木本植物，高于藍(lán)靛果忍冬[20]（2.58 kb）。而形成這種差異的原因可能與不同物種間SSR 基因表達(dá)差異、轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)量、篩選標(biāo)準(zhǔn)等相關(guān)[22]。總體來(lái)說(shuō)，美國(guó)紅楓轉(zhuǎn)錄組SSR含量較為豐富，為今后分子育種等試驗(yàn)提供了基礎(chǔ)資料。

已有研究表明，物種中存在大量簡(jiǎn)單重復(fù)基元表明具有較高的進(jìn)化水平，相反則表明進(jìn)化時(shí)間較短或者該物種變異頻率低[23-24]。在本次研究中，美國(guó)紅楓轉(zhuǎn)錄組中SSR 以單堿基、雙堿基以及三堿基重復(fù)類型為主，分別占總SSR 的54.12%、20.64%以及16.19%，其它類型占比較少，這一特征與紅松[11]、泡核桃[25]、黑枸杞[26]等植物是一致的，說(shuō)明美國(guó)紅楓存在較高的進(jìn)化水平或者具有較高的變異頻率。另外，在美國(guó)紅楓轉(zhuǎn)錄組SSR 位點(diǎn)還發(fā)現(xiàn)了31 個(gè)在雙子葉植物中不常見(jiàn)的CCG/CGG 重復(fù)基序，表明美國(guó)紅楓中的SSR位點(diǎn)具有一些特定的抗逆性、信號(hào)傳導(dǎo)與代謝調(diào)控等生理功能[26]。

已有研究認(rèn)為，SSR 基元重復(fù)次數(shù)和由堿基數(shù)量不同形成的不同序列長(zhǎng)度與SSR 多態(tài)性息息相關(guān)，其中SSR 的長(zhǎng)度是影響多態(tài)性的主要因素[27-29]。當(dāng)SSR 序列長(zhǎng)度＜12 bp 時(shí)多態(tài)性表現(xiàn)極低，序列長(zhǎng)度位于12～20 bp 之間的時(shí)多態(tài)性表現(xiàn)中等，序列長(zhǎng)度≥20 bp 時(shí)多態(tài)性較高，并且高級(jí)序列SSR 的多態(tài)性普遍低于低級(jí)序列[16]。本次研究對(duì)美國(guó)紅楓轉(zhuǎn)錄組中單堿基到六堿基重復(fù)SSR 序列長(zhǎng)度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)度＜12 bp 的SSR 共有4 117 個(gè)，占總SSR 的31.73%；長(zhǎng)度在12～20 bp 之間的SSR 共7 394 個(gè)，占總SSR 的56.99%；長(zhǎng)度≥20 bp 的SSR 共1 462 個(gè)，占總SSR 的11.27%，其中，經(jīng)過(guò)對(duì)長(zhǎng)度≥12 bp 的SSR進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)單堿基重復(fù)SSR（2 904 個(gè)）的個(gè)數(shù)＞雙堿基（2 679 個(gè)）＞三堿基（2 100 個(gè)）＞四堿基（90 個(gè)）＞五堿基（13 個(gè)）＞六堿基（6 個(gè)），表明美國(guó)紅楓轉(zhuǎn)錄組中的SSR 位點(diǎn)大多數(shù)可能具有潛在的多態(tài)性，具有較高的利用價(jià)值。

綜上所述，本研究中美國(guó)紅楓轉(zhuǎn)錄組中SSR位點(diǎn)分布平均距離較短，出現(xiàn)頻率較高，堿基重復(fù)類型以單堿基、雙堿基和三堿基為主，分布較豐富，且68.27%的SSR 位點(diǎn)長(zhǎng)度≥12 bp，說(shuō)明具有較高的多態(tài)性和利用價(jià)值。但是，該研究?jī)H僅是對(duì)序列特征進(jìn)行了分析，并沒(méi)有通過(guò)其他手段對(duì)其多態(tài)性等方面進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證，這是今后需要進(jìn)一步開(kāi)展的工作。另外，根據(jù)本研究的SSR 位點(diǎn)信息，篩選美國(guó)紅楓不同品種特有的分子標(biāo)記，用于品種區(qū)分和新品種選育也將是后續(xù)進(jìn)一步研究的方向。

3.2 結(jié) 論

本研究從美國(guó)紅楓轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)中共獲得78 571 條Unigene，通過(guò)對(duì)長(zhǎng)度≥1 kb 的Unigene進(jìn)行SSR 位點(diǎn)分析，共獲得SSR 位點(diǎn)12 974 個(gè)，出現(xiàn)頻率為55.75%，平均分布距離為3 747.88 bp；美國(guó)紅楓SSR 重復(fù)堿基類型以單堿基、雙堿基和三堿基為主，其優(yōu)勢(shì)重復(fù)基元分別為A/T、AT/TA與GAA/TTC；單堿基到六堿基各基元重復(fù)次數(shù)主要集中在5～22 次之間，序列長(zhǎng)度在10～48 bp之間，平均長(zhǎng)度為18.43 bp；通過(guò)Prime 3 軟件對(duì)美國(guó)紅楓SSR 進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，共發(fā)現(xiàn)有10 751 個(gè)SSR 位點(diǎn)符合引物設(shè)計(jì)要求，其中長(zhǎng)度在20 bp 以上的共1 081 個(gè)SSR 位點(diǎn)。這些研究結(jié)果為今后美國(guó)紅楓品種鑒定、遺傳圖譜繪制、遺傳多樣性分析以及培育新品種等方面提供了基礎(chǔ)資料。