符青云 何凱寧 陳文雅 劉興國(guó)

胃癌(gastric cancer)是人類常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤,具有較高的發(fā)病率和死亡率,是世界上第二大癌癥相關(guān)死亡的原因［1］,2018年有超過(guò)100 萬(wàn)人被新診斷出患有胃癌,約有783000 人死亡。胃癌的發(fā)病率和流行率在地理上各不相同,在東亞、中亞、東歐和拉丁美洲最高,有87%的新病例發(fā)生。在非洲和北美觀察到的比率要低得多［2］。我國(guó)胃癌發(fā)病數(shù)約 67.9 萬(wàn),死亡總數(shù)約49.8 萬(wàn),僅次于肺癌［3］。手術(shù)、圍手術(shù)期或輔助化療、放療等是治療胃癌的主要手段,但即使在根治性切除后,胃癌的復(fù)發(fā)率和死亡率仍然很高,腫瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致復(fù)發(fā)和死亡的主要原因。E-cadherin 是一種典型的鈣粘蛋白,是上皮細(xì)胞粘附連接的關(guān)鍵功能成分,在維持細(xì)胞極性和分化、接觸抑制細(xì)胞生長(zhǎng)、抑制腫瘤侵襲等方面發(fā)揮著重要作用［4］。β-catenin 是一種細(xì)胞質(zhì)可溶性蛋白質(zhì),是細(xì)胞間粘附分子,可參與Wnt 信號(hào)通路和轉(zhuǎn)錄激 活［5,6］。E-cadherin 能與β-catenin 結(jié)合成復(fù)合體參與錨固機(jī)制,其表達(dá)異常與多種惡性腫瘤的浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)。研究表明,浸潤(rùn)性癌和原位癌顯示出β-catenin 和E-cadherin 表達(dá)水平異常［7］,因此,本研究對(duì)胃癌組織中β-catenin 和E-cadherin 的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè),探索β-catenin、E-cadherin 與胃癌發(fā)生和轉(zhuǎn)移的相關(guān)性,為胃癌的診斷、治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源 選取2016年1月～2020年12月本院手術(shù)切除的胃癌組織病理標(biāo)本96例,其中,男66例,女30例；年齡30～80 歲,平均年齡(53.3±8.9)歲；分化程度：高中分化胃癌54例,低分化胃癌 42例；浸潤(rùn)深度：未浸及漿膜層45例,浸及漿膜層51例；有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移：無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移49例,有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 47例；根據(jù)國(guó)際抗癌聯(lián)盟(UICC)中關(guān)于胃癌TNM 的分期標(biāo)準(zhǔn)：Ⅰ期23例,Ⅱ期25例,Ⅲ期24例,Ⅳ期24例；所有病例均為首次手術(shù)治療,術(shù)前未接受放、化療及免疫治療。另選取同期96例胃鏡檢查正常者(取其黏膜活檢正常組織的病理標(biāo)本)作為對(duì)照。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 鼠抗人單克隆抗體(E-cadherin)、鼠抗人單克隆抗體(β-catenin)及免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒均購(gòu)自于上?；蛏镉邢薰尽?/p>

1.3 研究方法 制備石蠟組織切片,將石蠟包埋的組織塊切片,切片厚度為4 μm,隨后進(jìn)行烤片防止脫片,依次將切片放入二甲苯和酒精中進(jìn)行脫蠟和水化,再將切片浸入EDTA 緩沖液中進(jìn)行抗原修復(fù),經(jīng)內(nèi)源性過(guò)氧化物酶淬滅處理后進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn),嚴(yán)格按照E-cadherin 及β-catenin 試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行免疫組化SP 法染色,DAB 顯色,蘇木素復(fù)染,顯微鏡觀察結(jié)果,拍照、記錄。陰性對(duì)照為PBS,過(guò)程同上。

1.4 觀察指標(biāo)及判定標(biāo)準(zhǔn) 比較E-cadherin、β-catenin 在胃癌組織和正常組織中的表達(dá)情況,不同胃癌臨床病理參數(shù)的E-cadherin、β-catenin 表達(dá)情況,分析胃癌組織中E-cadherin 與β-catenin 表達(dá)的相關(guān)性。E-cadherin 與β-catenin 染色后會(huì)在細(xì)胞膜上出現(xiàn)棕黃色顆粒(續(xù)線狀、斑點(diǎn)狀)沉積即為陽(yáng)性染色。使用半定量積分方法判斷陽(yáng)性結(jié)果。染色強(qiáng)度評(píng)分：無(wú)染色0 分,淺黃色1 分,棕黃色2 分,棕褐色3 分；高倍鏡(×200)下每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野,并且在每個(gè)視野中計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞,并計(jì)算相同細(xì)胞中陽(yáng)性細(xì)胞的百分比；細(xì)胞陽(yáng)性率分別為 0、＜25%、25%～50%、50%～75%、＞75%,分別計(jì)為0、1、2、3、4 分。兩者乘積結(jié)果0 分為“-”,1～4 分“+”,5～8 分為“++”,9～12 分為“+++”,將“-”及“+”定義為陰性表達(dá),“++”及“+++”定義為陽(yáng)性表達(dá)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS26.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料以率(%)表示,采用χ2檢驗(yàn)；相關(guān)性檢驗(yàn)采用Spearman 相關(guān)分析。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 E-cadherin、β-catenin在胃癌組織和正常組織中的表達(dá)情況比較 胃癌組織中E-cadherin、β-catenin 的陽(yáng)性表達(dá)率分別為48.96%、47.92%,均低于對(duì)照組的94.79%、92.71%,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05)。見(jiàn)表1。

2.2 不同胃癌臨床病理參數(shù)的E-cadherin、β-catenin表達(dá)情況比較 高中分化、未浸及漿膜層、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Ⅰ～Ⅱ期患者的E-cadherin、β-catenin 的陽(yáng)性表達(dá)率均高于低分化、浸及漿膜層、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Ⅲ～Ⅳ期患者,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05)。不同年齡、性別、腫瘤直徑患者的E-cadherin、β-catenin 的陽(yáng)性表達(dá)率比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見(jiàn)表2。

表2 不同胃癌臨床病理參數(shù)的E-cadherin、β-catenin 表達(dá)情況比較(n)

2.3 胃癌組織中E-cadherin 與β-catenin 表達(dá)的相關(guān)性分析 在96 胃癌組織中,均為陽(yáng)性者30例,均為陰性者33例,經(jīng)Spearman 相關(guān)分析顯示,E-cadherin 與β-catenin 表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.457,P＜0.05)。見(jiàn)表3。

表3 胃癌組織中E-cadherin 與β-catenin 表達(dá)的 相關(guān)性分析

3 討論

胃癌是最常見(jiàn)的威脅人類健康的惡性腫瘤之一,死亡率高,盡管各種檢驗(yàn)、檢查技術(shù)不斷普及,放大胃鏡、染色內(nèi)鏡、共聚焦內(nèi)鏡逐步推廣,早期胃癌的檢出率得到提高,但與日本及歐美等國(guó)家相比仍有較大差距。胃癌確診時(shí)大都處于中晚期,預(yù)后差,目前尚缺乏有效的防控手段［8］。

造成胃癌死亡的主要原因是腫瘤發(fā)生了侵襲和轉(zhuǎn)移,胃癌的發(fā)生與多種癌基因及抑癌基因的異常有。E-cadherin 是一種重要的細(xì)胞間粘附分子,通過(guò)β-catenin 途徑、TGF-β-/Samds 及PI3K/Akt 通路等途徑抑制細(xì)胞生長(zhǎng)維持完整的組織結(jié)構(gòu)。β-catenin是一系列與鈣粘蛋白相關(guān)聯(lián)的胞漿蛋白,能增加同型細(xì)胞間粘附功能,是重要的細(xì)胞粘附分子和細(xì)胞骨架成分。E-cadherin 和β-catenin 在維持正常上皮組織結(jié)構(gòu)中都具有重要作用［9］。對(duì)許多上皮源性惡性腫瘤細(xì)胞來(lái)說(shuō),某些原因作用下的E-cadherin、β-catenin功能障礙都可能會(huì)造成腫瘤細(xì)胞間的粘附功能破壞進(jìn)而癌細(xì)胞脫離原發(fā)灶導(dǎo)致轉(zhuǎn)移發(fā)生。腫瘤的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移機(jī)制是一個(gè)多步驟、多因素、多基因參與的連續(xù)的復(fù)雜過(guò)程,但是E-cadherin 和β-catenin 表達(dá)異常使細(xì)胞間的粘附減弱,癌細(xì)胞易于脫落,這是癌轉(zhuǎn)移的首要環(huán)節(jié)。因此,E-cadherin 和β-catenin 功能喪失是細(xì)胞獲得低分化和侵襲性的關(guān)鍵,可作為一個(gè)潛在的預(yù)后判斷指標(biāo)。

本研究結(jié)果顯示,E-cadherin 和β-catenin 在正常胃黏膜組織中呈正常表達(dá),表達(dá)率為94.79%和92.71%,而在胃癌組織中E-cadherin 和β-catenin 的表達(dá)率僅為48.96%和47.92%,其表達(dá)率顯著降低,這些結(jié)果提示E-cadherin 和β-catenin 參與腫瘤的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移,其表達(dá)量降低使腫瘤細(xì)胞具有了高侵襲性并獲得轉(zhuǎn)移潛能,促進(jìn)了腫瘤的發(fā)生發(fā)展。此外,隨著胃癌分化程度的降低、浸潤(rùn)深度的增加及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,E-cadherin 和β-catenin 表達(dá)率均出現(xiàn)異常。不同年齡、性別、腫瘤直徑患者的E-cadherin、β-catenin 的陽(yáng)性表達(dá)率比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。表明E-cadherin 和β-catenin 的表達(dá)與胃癌患者的年齡、性別及腫瘤大小無(wú)相關(guān)性。但高中分化、未浸及漿膜層、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Ⅰ～Ⅱ期患者的E-cadherin、β-catenin的陽(yáng)性表達(dá)率均高于低分化、浸及漿膜層、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Ⅲ～Ⅳ期患者,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05)。說(shuō)明E-cadherin 和β-catenin 表達(dá)與胃癌患者的胃癌分化程度、浸潤(rùn)深度、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及TNM 分期相關(guān)。提示E-cadherin 和β-catenin 在胃癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。Spearman 相關(guān)分析顯示,E-cadherin與β-catenin 表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.457,P＜0.05)。這可能與E-cadherin和β-catenin構(gòu)成 E-cadherin/ β-catenin復(fù)合體共同發(fā)揮調(diào)控作用相關(guān),E-cadherin/β-catenin 復(fù)合體任一成分的缺乏均會(huì)破壞復(fù)合體的正常結(jié)構(gòu),加速腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移。

綜上所述,E-cadherin 和β-catenin 在胃癌組織中存在顯著的異常表達(dá),在胃癌的發(fā)展過(guò)程中二者可能具有協(xié)同作用,聯(lián)合檢測(cè)β-catenin 和 E-cadherin 對(duì)臨床早期診斷和評(píng)估胃癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移有重要意義。