寧夏賀蘭山東麓赤霞珠葡萄籽提取物抑菌活性的研究*

陳 彬 劉永衡 王學(xué)英

（寧夏工商職業(yè)技術(shù)學(xué)院能源化工學(xué)院，寧夏銀川 750021）

近年來，寧夏葡萄產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，寧夏賀蘭山東麓成為業(yè)界公認(rèn)的世界上最適合種植釀酒葡萄和生產(chǎn)高端葡萄酒的黃金地帶之一。2021 年1 月，寧夏九大重點(diǎn)產(chǎn)業(yè)之一葡萄酒產(chǎn)業(yè)的高質(zhì)量發(fā)展實(shí)施方案出臺(tái)，其總體任務(wù)是力爭(zhēng)用5—10 年時(shí)間，釀酒葡萄基地規(guī)模達(dá)到666 7 萬公頃，年產(chǎn)優(yōu)質(zhì)葡萄酒3 億瓶以上，努力實(shí)現(xiàn)葡萄酒產(chǎn)業(yè)綜合產(chǎn)值1 000億元、賀蘭山東麓葡萄酒品牌價(jià)值翻番的目標(biāo)。隨著葡萄種植、加工產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，產(chǎn)生了大量的葡萄皮渣據(jù)估計(jì)，目前每年產(chǎn)生約占葡萄加工量25%左右的皮渣。張瑩等研究表明，釀酒后的葡萄皮渣中含有大量花色苷、白藜蘆醇、膳食纖維等功能性成分，具有良好的醫(yī)療、保健作用。然而只有少量的皮渣被回收利用，絕大部分被用做肥料、飼料甚至當(dāng)垃圾處理掉，造成了資源的極大浪費(fèi)。同時(shí)，隨著人們對(duì)食品安全問題愈加重視，使得從草藥、香料等植物中提取天然抗菌化合物的研究也愈加迫切。本試驗(yàn)選用寧夏賀蘭山東麓產(chǎn)區(qū)赤霞珠葡萄籽為材料，對(duì)不同溶劑提取物的抑菌效果進(jìn)行了對(duì)比研究，旨在為深入研究葡萄籽的抑菌活性機(jī)理及其在食品保鮮中的應(yīng)用提供一定的理論基礎(chǔ)，也為提升葡萄酒釀造產(chǎn)品附加值提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 試驗(yàn)材料

釀酒葡萄：赤霞珠由寧夏西夏王葡萄酒業(yè)（集團(tuán)）有限公司提供。

菌株：供試菌種金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大腸桿菌（Escherichia coli）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），均購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心（CICC），試驗(yàn)室低溫保存。

1.1.2 試劑

營養(yǎng)瓊脂、牛肉膏、蛋白胨（購自北京奧海星生物技術(shù)有限公司）、氯化鈉、95%乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇（購自廣東省化學(xué)試劑工程技術(shù)研究開發(fā)中心），均為國產(chǎn)AR 級(jí)別試劑。

1.1.3 儀器

R-3 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，瑞士BUCHI 公司；SPX-150B-Z 型生化培養(yǎng)箱，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；立式壓力蒸汽滅菌器，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；SW-CJ-2FD 型無菌操作臺(tái)，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；PHSJ-4F 型試驗(yàn)室pH 計(jì)，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；梅特勒ME3002E 型分析天平，梅特勒-托利多國際股份有限公司；T6 紫外可見分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)樣品制備

采用傳統(tǒng)工藝釀造葡萄酒后收集皮渣，于烘箱中60 ℃～70 ℃烘干，分離葡萄籽和葡萄皮。將葡萄籽研磨至粉末狀，浸漬于95%乙醇，避光密閉保存1 個(gè)月，備用。取葡萄籽95%乙醇浸漬液減壓蒸餾除去溶劑后得265.3 g 粗浸膏（即95%乙醇總提取物樣品），將粗浸膏溶于1 L 溫水中（60 ℃），再用石油醚（60 ℃～90 ℃）、乙酸乙酯和正丁醇依次萃取，萃取溶劑均為1 L。石油醚萃取層減壓濃縮得18.5 g 浸膏（即95%乙醇總提取物石油醚萃取樣品），乙酸乙酯萃取層減壓濃縮得10.2 g 浸膏，正丁醇萃取層減壓濃縮得26.3 g 浸膏。各提取浸膏用二甲基亞砜DMSO 溶解，制備成5 g/mL 的原始溶液，保藏備用。

1.2.2 供試菌株的活化及平板涂布培養(yǎng)

制備牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，在121 ℃、0.1 Mpa～0.15 Mpa 條件下高壓滅菌30 min，一部分制備試管斜面培養(yǎng)基，接種供試菌種后置于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)37 ℃培養(yǎng)24 h。另一部分制備平板培養(yǎng)基，挑取斜面培養(yǎng)菌落于EP 管中，接種于250 mL 三角瓶中，置于恒溫振蕩培養(yǎng)箱中37 ℃振蕩培養(yǎng)12 h 后，將菌液取出，無菌水稀釋成濃度為每毫升106 個(gè)細(xì)胞的菌液，即OD 值0.5～0.6 的菌液。取5 mL 稀釋菌液分散涂布于直徑100 mm 培養(yǎng)皿上，恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)37 ℃培養(yǎng)12 h。

1.2.3 抑菌圈及抑菌效果的評(píng)價(jià)方法

抑菌試驗(yàn)采用濾紙片擴(kuò)散法，將1.2.1 中DMSO溶解試驗(yàn)樣品溶液分別配成質(zhì)量濃度為1.0 g/mL、0.50 g/mL、0.25 g/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液。用打孔器制作直徑5 mm 濾紙圓片，高壓滅菌后將濾紙片放入各濃度試驗(yàn)樣品溶液中浸泡30 min，以浸泡過DMSO 溶液的濾紙片作為空白對(duì)照（CK），干燥備用。無菌條件下，將供試樣品浸泡干燥濾紙片用無菌鑷子放置在含菌平板上，每個(gè)平皿放置4 片，且間隔一定的距離，然后將培養(yǎng)皿置于恒溫生化箱37 ℃培養(yǎng)24 h，最后觀察菌落生長情況，并用精密測(cè)量尺測(cè)定抑菌圈直徑。

抑菌活性大小依據(jù)抑菌圈試驗(yàn)判定標(biāo)準(zhǔn)：即抑菌圈直徑大于20 mm，為極度敏感；抑菌圈直徑介于15 mm～20 mm 之間，為高度敏感；抑菌圈直徑介于10 mm～14 mm 之間，為中度敏感；抑菌圈直徑介于7 mm～9 mm 之間，為低度敏感；小于7 mm為不敏感；直徑越大抗菌活性越強(qiáng)。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

所有試驗(yàn)重復(fù)3 次，利用Excel2007、IBM SPSS Statistics 19 進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 石油醚萃取物抑菌效果

赤霞珠葡萄籽95%乙醇總提取物石油醚萃取物在質(zhì)量濃度為0.20 g/mL、0.10 g/mL、0.05 g/mL3 個(gè)水平下對(duì)3 種典型細(xì)菌的生長有一定的影響，結(jié)果如下頁表1 所示。

從表1 中可以看出，石油醚萃取物質(zhì)量濃度為0.20 g/mL、0.10 g/mL 時(shí)對(duì)金黃色葡萄球菌有較好的抑菌效果，達(dá)到了中等抑菌效果，而當(dāng)質(zhì)量濃度為0.05 g/mL 時(shí)抑菌作用不明顯。石油醚萃取物對(duì)大腸桿菌抑菌作用不明顯，在0.20 g/mL、0.10 g/mL 濃度下，雖然表現(xiàn)出一定的抑菌作用，但抑菌圈直徑均小于7 mm，說明大腸桿菌對(duì)這2 個(gè)濃度的萃取物不敏感。同樣，枯草芽孢桿菌對(duì)3 個(gè)濃度梯度的樣品液均不敏感。

表1 赤霞珠葡萄籽95%乙醇總提取物石油醚萃取物的抑菌活性

2.2 乙酸乙酯萃取物抑菌效果

從表2 中可以看出，乙酸乙酯萃取物對(duì)大腸桿菌沒有抑菌作用，對(duì)金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌在樣品質(zhì)量濃度為0.20 g/mL 時(shí)表現(xiàn)出較弱的抑制作用，低于0.20 g/mL 時(shí)無抑菌效果。

表2 葡萄籽95%乙醇總提取物乙酸乙酯萃取物的抑菌活性

2.3 正丁醇萃取物抑菌效果

從表3 中可以看出，正丁醇萃取物對(duì)金黃色葡萄球菌表現(xiàn)出明顯的抑菌效果，樣品質(zhì)量濃度為0.20 g/mL 時(shí)，抑菌圈的直徑到達(dá)21.3 mm 以上，表現(xiàn)出極強(qiáng)的抑菌效果，樣品質(zhì)量濃度為0.05 g/mL時(shí)，抑菌圈直徑在15 mm～20 mm 之間，說明對(duì)菌體高度敏感。質(zhì)量濃度為0.20 g/mL、0.10 g/mL 正丁醇萃取物對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果與對(duì)大腸桿菌的抑菌效果無顯著差異，但對(duì)枯草芽孢桿菌的抑菌效果具有顯著差異；質(zhì)量濃度為0.05 g/mL 的樣品對(duì)3 種菌種的抑菌效果均具有顯著性差異。金黃色葡萄球菌和大腸桿菌對(duì)正丁醇萃取物的敏感性明顯強(qiáng)于枯草芽孢桿菌。

表3 葡萄籽95%乙醇總提取物正丁醇萃取物的抑菌活性

2.4 赤霞珠葡萄籽各溶劑萃取物的抑菌活性分析

赤霞珠葡萄籽各極性萃取物在質(zhì)量濃度為0.20 g/mL 時(shí)對(duì)3 種典型的腐敗菌（大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌）的抑菌活性結(jié)果如下頁圖1 所示。

由圖1 可知，赤霞珠葡萄籽各極性萃取物對(duì)三種典型腐敗菌的抑菌能力由強(qiáng)到弱為：正丁醇萃取物>石油醚萃取物>乙酸乙酯萃取物，結(jié)果表明，發(fā)揮主要抑菌能力的活性成分主要集中在高極性的正丁醇萃取物中，因此，在后續(xù)分析、分離及應(yīng)用研究中，可將正丁醇萃取物作為重點(diǎn)研究對(duì)象。

圖1 赤霞珠葡萄籽各溶劑萃取物的抑菌活性

3 討論

植物提取物對(duì)不同微生物有不同程度的抑制效果，同一種植物提取的活性物質(zhì)對(duì)不同細(xì)菌的抑制程度不一樣，同一細(xì)菌對(duì)不同提取物的敏感性亦有差異。Subramanian M 等研究表明，葡萄籽中含有的白藜蘆醇等酚類化合物具有抑菌活性；此外，葡萄籽中含有的原花青素也屬于多酚類化合物，也具有一定的抑菌活性。本試驗(yàn)研究了赤霞珠葡萄籽不同溶劑提取物對(duì)3 種典型細(xì)菌的抑菌效果，結(jié)果表明，葡萄籽95%乙醇總提取物石油醚萃取物對(duì)革蘭氏陽性菌（特別是金黃色葡萄球）抑菌活性強(qiáng)，對(duì)革蘭氏陰性菌抑菌效果較弱；葡萄籽95%乙醇總提取物正丁醇萃取物對(duì)3 種典型菌表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗菌活性，這可能是由于正丁醇萃取物含有大量生物堿、多酚之類的大極性化合物，對(duì)細(xì)菌有較明顯的廣譜抑菌作用；與正丁醇、石油醚萃取樣品相比，乙酸乙酯萃取物對(duì)3 種細(xì)菌的抑菌效果最差。各極性萃取物的抑菌能力由強(qiáng)到弱為：正丁醇萃取物>石油醚萃取物>乙酸乙酯萃取物。枯草芽孢桿菌對(duì)所有樣品溶液的敏感性均弱于大腸桿菌和金黃色葡萄球菌，這可能是因?yàn)檠挎邔?duì)外界不良環(huán)境抵抗能力較強(qiáng)的緣故。

赤霞珠品種在寧夏賀蘭山東麓地區(qū)的種植面積占到紅色品種的70%以上，本試驗(yàn)對(duì)赤霞珠葡萄籽提取物的抑菌活性進(jìn)行了初步研究，為葡萄籽的開發(fā)利用及其作為抑菌劑在食品保鮮加工中的應(yīng)用提供一定的理論基礎(chǔ)。