大豆胰蛋白酶抑制劑對工蜂上顎腺脂肪酸分泌能力的影響

陳亞南 吳雨祺 鄭火青 胡福良

（浙江大學動物科學學院，杭州 310058）

1 引言

充足的營養(yǎng)是蜂群繁殖和發(fā)展的基礎，蜜蜂在不同發(fā)育階段所需的營養(yǎng)存在差異[1-3]，這為滿足不同發(fā)育階段蜜蜂的營養(yǎng)需要增加了復雜性。為了能夠更好地滿足蜂群營養(yǎng)需求，也為了降低蜂群飼養(yǎng)成本，市場上出現(xiàn)了花粉替代物。大豆粉是最常用的花粉代替物的主要成分。大豆胰蛋白酶抑制劑是大豆粉中重要的成分之一，能調(diào)節(jié)大豆蛋白質(zhì)的合成和分解，并具有抗蟲作用[4]，對動物和昆蟲的營養(yǎng)吸收具有消極影響[5,6]。研究發(fā)現(xiàn)，大豆蛋白酶抑制劑顯著性地降低蜜蜂的生存率和咽下腺的發(fā)育，但對食物的消耗沒有顯著影響[7,8]。

上顎腺是位于蜜蜂頭部的一對大型囊狀外分泌腺體。工蜂上顎腺主要負責蜂王漿中脂肪酸的合成，包括10-羥基-2-癸烯酸（10-HDA）及其前體物質(zhì)10-羥基-癸酸（10-HDAA），這些物質(zhì)在幼蟲的發(fā)育過程及蜂王漿的理化特性中起著重要作用[9,10]。雖然花粉代替物已廣泛使用，但對蜜蜂上顎腺的分泌能力方面的研究甚少。本研究通過不同濃度大豆胰蛋白酶抑制劑飼喂籠養(yǎng)工蜂，探究大豆胰蛋白酶抑制劑對蜜蜂上顎腺脂肪酸分泌能力的影響。

2 材料與方法

2.1 實驗蜂群的飼養(yǎng)

實驗蜂群為意大利蜜蜂（Apis mellifera ligustica），飼養(yǎng)于浙江大學蠶蜂研究所。為了獲得特定日齡的工蜂，從實驗蜂群中抽取即將出房的封蓋子脾，放置于34.5℃±1℃和70%±5%（RH）的恒溫恒濕箱內(nèi)過夜以獲取新出房的0日齡工蜂[11]。第二天，將新出房的蜜蜂隨機分為5 組，每一組中1 只成熟的蜂王維持正常蜂群的信息素環(huán)境[12]。每籠內(nèi)約有50 只蜜蜂，放置于30.5℃±1℃。每24h 更換新的飼料，以保持蜜蜂飼料的新鮮。本實驗進行了3 個蜂群的生物學重復。

2.2 大豆胰蛋白酶抑制劑的飼喂

大豆胰蛋白酶抑制劑溶解于40%（W/W）糖漿中通過注射器飼喂籠養(yǎng)蜜蜂（表1）。

表1 實驗室籠養(yǎng)蜜蜂日糧組成

2.3 蜜蜂生存率的測定

實驗過程中每24h 記錄每組蜜蜂的死亡個數(shù)并繪制蜜蜂生存曲線。

2.4 工蜂頭部10-HDAA和10-HDA含量的測定

為了評定蜜蜂不同階段脂肪酸的合成能力，在6、9 和12日齡時，收集每個處理組的10 只蜜蜂，將工蜂的頭部分離放置于1.5ml 離心管中，加入1ml 無水乙醇和200μl 的對羥基苯甲酸甲酯乙醇溶液作為內(nèi)標液，超聲15min。然后將乙醇溶劑透過0.22μm 的有機濾膜過濾到2ml 的樣品瓶中，放置于75℃烘箱內(nèi)揮發(fā)干乙醇，然后加入1ml 乙醚，充分溶解后再次過0.22μm 的有機濾膜過濾到1ml 的GC 樣品瓶，放置于50℃烘箱內(nèi)揮發(fā)。乙醚揮發(fā)后，添加400μl 吡啶和50μl BSTFA 后密封（Sigma，Kawasaki，Japan），65℃水浴鍋中進行衍生化反應，最后使用GC-FID 測定工蜂頭部的脂肪酸含量。

2.5 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 22.0 軟件進行統(tǒng)計學分析。工蜂頭部10-HDA 和10-HDAA 含量的比較以及飼養(yǎng)期間工蜂生存率和食物的消耗量，采用單因素方差分析計算差異，P 值＜0.05 認為有統(tǒng)計學意義。所有圖形均由GraphPad Prism 7 生成。

3 結(jié)果

3.1 生存率

大豆胰蛋白酶抑制劑處理12d 后，與對照組相比，4 個處理組工蜂的死亡率都出現(xiàn)了下降的現(xiàn)象（圖1），高濃度處理組的工蜂在飼養(yǎng)前幾天顯著降低了蜜蜂生存率，其他3 個處理組在6日齡后呈現(xiàn)下降的趨勢。

圖1 飼喂不同濃度的大豆胰蛋白酶抑制劑工蜂的生存率

3.2 工蜂頭部10-HDAA和10-HDA含量

與對照組相比，不同水平的大豆胰蛋白酶抑制劑對籠養(yǎng)工蜂脂肪酸合成能力沒有顯著性影響。但發(fā)現(xiàn)在6日齡時，大豆胰蛋白酶抑制劑處理組提高了工蜂頭部的10-HDAA 含量。但是隨著飼養(yǎng)時間的增加，處理組對工蜂頭部10-HDAA 和10-HDA 含量的影響減弱（圖2、圖3）。

圖2 不同水平大豆胰蛋白酶抑制劑條件下籠養(yǎng)工蜂頭部10-HDAA含量

圖3 不同水平大豆胰蛋白酶抑制劑條件下籠養(yǎng)工蜂頭部10-HDA含量

4 討論

大豆粉是代用花粉中最常用的原料。前人研究表明，以大豆粉為基礎的花粉代用品降低了工蜂壽命和食物消耗量[13]。在腺體發(fā)育中代用花粉處理組降低了工蜂咽下腺腺泡，同時不同代用花粉的腺泡大小有一定的差異，但是通過改變營養(yǎng)的組成能夠進一步提高代用花粉的營養(yǎng)效果[14]。

在我們的研究中，發(fā)現(xiàn)高濃度的大豆胰蛋白酶抑制處理組對籠養(yǎng)工蜂的生存率有降低的作用，這與前人的研究結(jié)果相類似[8,9]。代用花粉的使用對蜂王漿生產(chǎn)中重要的咽下腺的發(fā)育有顯著性影響[7]，同時在蜜蜂的嗅覺方面也有一定的消極影響[15]，這可能是由蜜蜂食物獲取的敏感性降低所致。本研究結(jié)果顯示，不同水平的大豆胰蛋白酶抑制劑對籠養(yǎng)工蜂脂肪酸合成能力沒有顯著性的影響，但是發(fā)現(xiàn)在6日齡時提高了工蜂頭部的10-HDAA 含量；隨著飼養(yǎng)時間的增加，處理組對飼養(yǎng)工蜂頭部10-HDAA 和10-HDA 含量的影響減弱。表明大豆胰蛋白酶抑制劑對工蜂上顎腺分泌能力的影響隨著飼養(yǎng)時間的增加而減弱，這個過程具體是如何產(chǎn)生影響的，還需要進一步的研究。