李玉瑩 金莉莉 王秋雨

(遼寧大學生命科學院，沈陽，110036)

林蛙屬(Rana)物種是一類具有鼓膜和背側(cè)褶皺，腳趾有蹼，顳面黑色，非繁殖期在山林生活的棕色蛙類，在歐洲，林蛙因為其棕褐色的皮膚，也被叫作棕蛙(brown frog)[1-3]，是最廣為人知的兩棲動物之一。林蛙俗稱哈什蟆，隸屬兩棲綱(Amphibia)，無尾目(Anura)，蛙科(Ranidae)，林蛙屬[1]。1785年，林奈將歐洲蛙定名為Ranatemporaria，時至今日林蛙在全球命名已有40余種，我國有17個林蛙的獨立有效物種[2，4]。林蛙不僅在中國分布廣泛，在俄羅斯遠東、蒙古東部、朝鮮半島、日本北海道等地區(qū)均有分布[2]。其中，分布于北方的林蛙具有冬眠期。9月以后天氣轉(zhuǎn)涼，溫度降到10℃以下時，東北林蛙(R.dybowskii)陸續(xù)回到水下或者藏身在地下，進入冬眠期[5]。Voituron等[6]也發(fā)現(xiàn)相似的行為現(xiàn)象，觀察到在0℃以下的初冬，田野林蛙(R.arvalis)從池塘中出來并在上部土壤和枯枝落葉層中冬眠。這些林蛙具有耐凍性，為自身在零下溫度環(huán)境下的存活提供了保障。耐凍性是指在低溫條件下的生物能夠忍受細胞外和器官外空間結(jié)冰而不死亡的性質(zhì)[7-8]。生活在亞北極地區(qū)的林蛙如R.sylvatica能夠在低至-16℃的溫度，65%的身體水凍結(jié)的環(huán)境條件下存活[9]。除此之外，對林蛙屬的其他物種如黑龍江林蛙(R.amure-nsis)、豹蛙(R.pipiens)和歐洲綠蛙(R.ridibunda)等的耐凍性也均有報道[10-12]。筆者綜述了分布于北方的林蛙在低溫脅迫下冷凍保護系統(tǒng)的研究進展，旨在為從事相關研究的科學工作者提供參考。

1 北方林蛙的冷凍保護系統(tǒng)

隨著對林蛙耐凍性的不斷深入研究，學者們發(fā)現(xiàn)林蛙體內(nèi)存在一套冷凍保護劑系統(tǒng)，使其在冬季的冷凍中存活，葡萄糖和尿素是2種主要的冷凍保護劑[13]。二者都可以通過積極的作用來限制體內(nèi)冰的形成，且兩者都可以提供特殊的作用，包括調(diào)節(jié)代謝和抗氧化等，以保護生物膜和大分子免受離子滲透擾動[14]。

1.1 冷凍保護劑——葡萄糖

1.1.1 糖原的儲存與來源

葡萄糖在低溫下對林蛙有保護作用，升高的葡萄糖水平可以降低林蛙體內(nèi)冰的含量和體內(nèi)紅細胞的損傷，組織中葡萄糖水平是決定林蛙冷凍耐受能力的關鍵因素[15]。糖原是一種重要的冬季能量儲備方式，也是耐寒林蛙冷凍保護劑葡萄糖的主要來源。林蛙體內(nèi)的糖原在夏末和秋季積累，在冬季和春季消耗[16]。因此，肝臟中的糖原含量在冬季開始時最高，春季產(chǎn)卵后最小，林蛙的糖原貯存庫呈現(xiàn)出明顯的季節(jié)性模式[17]。

某些蛙類冬眠前脂肪體的脂解作用會增加，用來支持糖原的生成。在秋季糖原儲備階段，牛蛙(R.catesbeiana)的脂質(zhì)存儲降低，脂質(zhì)代謝使血糖被分流到糖原中[18]。Costanzo等[9]的研究也發(fā)現(xiàn)，林蛙在糖原沉積期間大大消耗了它們的脂肪。脂肪氧化代謝是耗氧過程，而林蛙冬眠期間處于缺氧狀態(tài)[19]，所以脂肪不能在缺氧的冷凍組織中被氧化。然而在冬眠準備期，林蛙將體內(nèi)脂肪分解代謝，產(chǎn)生大量的糖異生前體(如甘油三酸酯的甘油部分)，這有助于建立肝糖原貯備庫，對林蛙安全度過冬眠期具有重要意義[14]。

林蛙體內(nèi)的糖原儲存，還依賴蛋白質(zhì)的分解代謝。在冬季適應過程中林蛙腓腸肌尺寸減小27%，蛋白質(zhì)的凈流失加速導致肌肉萎縮[9]。大鼠腓腸肌萎縮實驗證實，肌肉萎縮由一組名為“atrogenes”的基因誘導調(diào)控，在全身消瘦狀態(tài)(禁食，癌癥惡病質(zhì)，腎衰竭，糖尿病)期間，atrogenes基因的表達在肌肉中被協(xié)同誘導或抑制，其中泛素連接酶atrogin-1、MuRF1和萎縮誘導轉(zhuǎn)錄因子FoxO1對于產(chǎn)生和維持“萎縮”狀態(tài)至關重要[20]。冬季林蛙血漿內(nèi)的游離氨基酸比夏末時期多130%—150%，而蘇氨酸、丙氨酸、絲氨酸等多種糖原性氨基酸的增加，可能會增加冬眠前糖原的合成，甚至可能維持冬眠期間主要的代謝，因此Costanzo等[13]認為蛋白質(zhì)分解代謝對林蛙冬眠的準備起著重要和尚未被清晰認知的作用。

1.1.2 葡萄糖動員

冬眠的林蛙能夠應對冷凍而產(chǎn)生強烈的葡萄糖反應。-2.5℃下冷凍48 h的林蛙R.sylvatica體內(nèi)葡萄糖的質(zhì)量摩爾濃度比未冷凍的高54—80倍，且葡萄糖水平因器官而異，在肝臟中最高，在骨骼肌中最低，然而這些葡萄糖僅僅是糖原儲存的39%[9]。林蛙遇到更低的溫度，或是溫度升高和降低的循環(huán)時，葡萄糖反應更為劇烈。實驗條件下直接冷凍至-8或-16℃時，林蛙的糖原質(zhì)量摩爾濃度降低了2/3，循環(huán)冷凍/解凍處理的林蛙糖原質(zhì)量摩爾濃度降低近95%[13]。

林蛙在冬季可以忍受長時間的全身冷凍，得益于廣泛的糖原水解和高輸出的葡萄糖質(zhì)量摩爾濃度在血液和所有組織中的分布。遭遇低溫后，林蛙體內(nèi)迅速進行葡萄糖動員：①通過活化體內(nèi)肝臟糖原磷酸化酶(GP)，并抑制糖酵解過程的關鍵酶6-磷酸果糖激酶(PFK)，從而保證了所需的高度糖原分解速率[21]；②林蛙通過增加GP活性和蛋白激酶A(PKA)活性，增強了葡萄糖動員期的糖原分解作用[22]；③林蛙凍結(jié)時可激活糖原合成酶激酶3(GSK-3)，并將其下游底物磷酸化，阻止糖原合成。GSK-3的動力學特性對溫度變化結(jié)果顯示，冷凍林蛙中的GSK-3比未凍結(jié)的林蛙更容易將下游目標磷酸化[23]。冷凍保護劑葡萄糖動員完成后，林蛙通過降低GP的活性來調(diào)節(jié)其糖原分解反應，從而保留了肝糖原儲備[22]。

葡萄糖冷凍保護劑系統(tǒng)的功效不僅取決于糖原分解的速率，還取決于肝細胞輸出游離葡萄糖的速度。葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白是一種特殊的載體蛋白，在葡萄糖跨細胞膜的轉(zhuǎn)運中發(fā)揮作用。在所有脊椎動物中，葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白對葡萄糖穩(wěn)態(tài)的維持起著重要作用，特別是在生理應激時期。比如，低氧時葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白的變化有利于葡萄糖的利用，葡萄糖作為代謝能量的來源，保護細胞免受缺氧損傷[24]。Rosendale等[25]發(fā)現(xiàn)在冷凍條件下，林蛙肝臟葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白2(GLUT2)的蛋白豐度和mRNA表達增加，說明GLUT2在林蛙冷凍存活中起著重要作用。

1.2 冷凍保護劑——尿素

尿素轉(zhuǎn)運蛋白(UTs)存在于哺乳動物、魚類、爬行動物和兩棲動物等生物體中。哺乳動物體內(nèi)UTs參與了多種生理過程，如：腎臟的尿液濃度調(diào)節(jié)、腸道中的氮循環(huán)回收[28]。目前，UTs在耐寒林蛙越冬中的生理作用知之甚少。Rosendale等[25]的研究發(fā)現(xiàn)林蛙體內(nèi)UTs數(shù)量隨季節(jié)變化，免疫印跡技術(shù)表明秋季和冬季的UTs豐度較低，春季則較高。體內(nèi)UTs的升高可能是由精氨酸血管收縮素(AVT)水平升高引起[29]。

冷凍過程中肝臟中尿素的產(chǎn)生對于林蛙冬季成功存活至關重要。氨基甲酸酯磷酸合成酶1(CPS1)是尿素合成的限速酶。CPS1的動力學參數(shù)表明，林蛙冷凍期間肝臟中的CPS1被翻譯后修飾，以增加CPS1活性[30]。Hawkins等[31]對林蛙的磷酸化蛋白質(zhì)組學分析表明，CPS1、精氨琥珀酸裂解酶(ASL)和精氨酸酶1(ARG1)3種尿素循環(huán)酶在冷凍、缺氧或脫水暴露時被差異磷酸化。這3種尿素循環(huán)酶受到應激反應發(fā)生可逆翻譯后調(diào)控。谷氨酸脫氫酶(GDH)是尿素生成的一種關鍵酶，GDH分解谷氨酸和NAD+生成馬-酮戊二酸(a-KG)、NADH和銨，可代謝形成尿素。冷凍的林蛙GDH受到翻譯后修飾的調(diào)節(jié)，以滿足尿素生成的需要[32]。

2 總結(jié)與展望

2.1 總結(jié)

分布于北方的林蛙在長期的低溫環(huán)境下，進化出一系列生理生化機制來應對低溫帶來的損傷，其中研究最為廣泛的是林蛙體內(nèi)的冷凍保護系統(tǒng)，由尿素和葡萄糖組成。二者都可以限制冰的形成，且兩者都可以提供特殊的作用，包括調(diào)節(jié)代謝和抗氧化，以保護生物膜和大分子免受離子滲透擾動[14]。在秋季，林蛙體內(nèi)糖原含量增加，脂質(zhì)代謝和蛋白質(zhì)分解以便糖原貯存。當林蛙遭遇低溫時，通過促進糖酵解并抑制糖異生，在體內(nèi)迅速產(chǎn)生大量的冷凍保護劑——葡萄糖。葡萄糖動員完成后抑制糖原合成，以保證體內(nèi)足夠的葡萄糖水平(圖1)。

2005年，Costanzo等[26]首次發(fā)現(xiàn)尿素在林蛙的耐凍性中起著重要的作用。除了能夠限制冰的形成，還能防止葡萄糖無法阻止的凍融損傷發(fā)生[26-27]。低溫條件下，尿素轉(zhuǎn)運蛋白及尿素生成的相關酶受到調(diào)節(jié)，以滿足林蛙冬季生存需要(圖2)。

2.2 展望

林蛙在冬季經(jīng)歷多種生理應激，如冷凍、脫水和低氧等，實驗證實低氧可能是造成冷凍引起的GLUT2豐度變化的原因之一[25]。但是葡萄糖動員期間糖酵解和糖異生相關酶等的調(diào)節(jié)具體響應什么生理應激而變化，還需要繼續(xù)探究。尿素調(diào)節(jié)相關的多種酶受到翻譯后修飾，如：CPS1、ARG1和ASL。但是這種翻譯后修飾在控制冰凍，缺氧或脫水暴露而在肝臟中起到的作用尚不清楚，還需要繼續(xù)探究[31]。

近些年，microRNA成為國內(nèi)外科學家們的研究熱點，有研究發(fā)現(xiàn)林蛙microRNA組織特異性表達：解凍過程中心臟中的21種microRNA表達減少，這些microRNA的減少有利于心臟功能的快速恢復；冷凍的骨骼肌有16種microRNA表達增加，這些microRNA增加有利于抑制代謝節(jié)省能量，差異表達的microRNA在林蛙冷凍存活中起著重要作用[33]。然而對耐寒林蛙葡萄糖動員、尿素積累和動員過程相關的microRNA調(diào)控機制還未見報道。對耐寒蛙冷凍期間microRNA的相關研究，將有助于了解林蛙冷凍期間發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控。

自然環(huán)境下冬眠的林蛙經(jīng)常因為氣溫變化導致自身經(jīng)歷連續(xù)冷凍和解凍過程，從而積累更多的葡萄糖[34]，且解凍后仍保持高血糖質(zhì)量摩爾濃度[9]。有研究表明，耐凍林蛙的胰島素結(jié)構(gòu)與其他不耐凍的蛙類不同，美國牛蛙不耐凍，歐洲綠蛙具有耐凍性，胰島素分子結(jié)構(gòu)的選擇性改變可能削弱了與胰島素受體的結(jié)合，并導致葡萄糖濃度的異常升高[35]。這些現(xiàn)象與二型糖尿病的發(fā)病機制和生理特點契合[36]，所以對冬眠林蛙在高濃度葡萄糖水平條件下生存的機制研究，或許對解決糖尿病問題具有一定的指導意義。

近年來，有學者發(fā)現(xiàn)與來自南方地區(qū)的林蛙相比，生活在亞北極圈的林蛙具有更強的耐凍性，能夠在更長的低溫時間和更低的溫度下生存[14]。早些年就有學者提出林蛙的種群隨著緯度不同而表現(xiàn)出不同的耐凍性和適應能力[37]。通過對耐凍林蛙越冬生存機理的研究，可以提高人們對林蛙地理分布和演化過程的理解?，F(xiàn)代分子生物學技術(shù)的快速發(fā)展為研究林蛙越冬的生理生化機制提供了有利條件，利用高通量測序技術(shù)分析南北地區(qū)林蛙基因序列的差異性，可以更好地理解林蛙的地理分布和演化過程。