盧義博，張小軍，嚴忠雍，倫麗麗，王瑞瑞,4

(1.浙江海洋大學水產學院，浙江舟山 316022；2.浙江海洋大學海洋與漁業(yè)研究所，浙江省海洋水產研究所，浙江舟山 316021；3.江蘇美正生物科技有限公司,江蘇無錫 214135；4.浙江海洋大學食品與藥學學院，浙江舟山 316022)

微囊藻毒素(microcystin，MC)是一類由藍藻產生的天然毒素，具有單環(huán)七肽結構。目前該藻類毒素能夠在水華過程中產生大量毒素，且毒性嚴重，具有遺傳毒性、致癌性和多器官毒性[1-4]。微囊藻毒素種類繁多，微囊藻毒素-LR(microcystin-LR，MC-LR)和微囊藻毒素-RR(microcystin-RR，MC-RR)是其中分布最為廣泛，危害最為嚴重的2 種同分異構體[5-8]。世界衛(wèi)生組織規(guī)定的飲用水中微囊藻毒素標準為1.0 μg·L-1，中華人民共和國衛(wèi)生部在《生活飲用水衛(wèi)生標準》中將MC-LR 的限量值定為0.001 mg·L-1。鑒于藍藻水華的發(fā)生日益頻繁，以及該類毒素對人體健康存在的潛在危害，有必要建立一種簡便、高效檢測微藻毒素的方法。

目前，微囊藻毒素的檢測方法有蛋白酶磷酸抑制法[9-11]、酶聯(lián)免疫法[12-13]、高效液相色譜法(HPLC)[14-16]及液相色譜串聯(lián)質譜法(LC-MS)[17-20]等。蛋白酶磷酸抑制法是最為經典的方法，此方法是用32P 標記來制備放射性底物，檢測后會帶來放射性污染物并且達不到要求的定量結果。酶聯(lián)免疫法簡便快捷、成本較低，但其準確性較差。高效液相色譜法具有重現(xiàn)性好，定量相對準確的優(yōu)點，但是由于塑料容器中易析出與目標物相似的色譜峰，易出現(xiàn)假陽性的情況[20]。液相色譜串聯(lián)質譜技術擁有優(yōu)異的分離能力與和高靈敏度定性和定量功能。但目前文獻大多采用固相萃取對樣品進行純化，基質干擾仍較嚴重，回收率較低。免疫親和柱(IAC)是利用抗原抗體特異性可逆結合特性的原理制作而成的SPE 柱，由于抗原抗體的高度選擇性，使得免疫親和柱具有良好的吸附凈化性能和高度的特異性。本實驗利用液相色譜串聯(lián)質譜的靈敏性和準確性，結合免疫親和柱的特異性和專一性，建立一套高效、快捷、靈敏度高的微囊藻毒素檢測方法。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

ACQUITY 超高效液相色譜-質譜儀Quattro Premier XE(美國Waters 公司)；MS2 漩渦混合器(德國IKA公司)；N-EVAP-112 氮吹儀(美國Organomation 公司)；Centrifuge5810 高速離心機(德國Eppendorf 公司)；12通道固相萃取裝置(美國Supelco 公司)。

MC 標準品(純度≥98.0%，德國Dr.Ehrenstorfer 公司)；MC 免疫親和柱(柱容量3 mL，江蘇美正生物科技有限公司)；Waters Oasis HLB 固相萃取柱(60 mg/3 mL)；Waters Oasis C18 固相萃取柱(60 mg/3 mL)；乙腈、甲醇(色譜純，德國Merck 公司)；乙酸銨、甲酸(美國Sigma 公司)；抗壞血酸、NaOH(分析純，上海國藥集團)；超純水。

1.2 溶液的配制

MC-LR 標準溶液(100 μg·mL-1)：稱取5.00 mg MC-LR 標準品，使用甲醇溶解定容至50 mL，-20 ℃避光保存，保存期限為6 個月。

MC-RR 標準溶液(100 μg·mL-1)：稱取5.00 mg MC-RR 標準品，使用甲醇溶解定容至50 mL，-20 ℃避光保存，保存期限為6 個月。

MC-LR、MC-RR 混合標準溶液(1 μg·mL-1)：準確移取適量的MC-LR 標準溶液和MC-RR 標準溶液，初始流動相稀釋定容至50 mL，4 ℃避光保存，保存期限為3 個月。

1.3 色譜及質譜條件

色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18 柱(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)；樣品室溫度10 ℃；柱溫40 ℃；進樣體積5 μL；流速0.3 mL·min-1；流動相A：0.1%甲酸水溶液（含5 mmol·L-1乙酸銨)，B：乙腈，梯度洗脫：0～1.5 min，80%～20% A;1.5～4.5 min,20%～80% A;4.5～5 min，A 保持80%不變；流速：0.3 mL·min-1。

質譜條件：電噴霧離子源，正離子掃描(ESI+)；檢測方式：多反應監(jiān)測(MRM)；毛細管電壓：3.0 kV；離子源溫度：110 ℃；脫溶劑氣溫度：350 ℃；錐孔氣流量：50 L·h-1；脫溶劑氣流量：600 L·h-1；錐孔電壓、碰撞能量、分析物母離子及子離子等質譜多反應監(jiān)測實驗條件如表1 所示。

表1 分析物的質譜多反應監(jiān)測實驗條件Tab.1 Conditions of multiple reaction monitoring for analyte

1.4 樣品處理

1.4.1 樣品提取

準確量取已充分混勻水樣50 mL 于50 mL 具塞離心管中，加入0.5 mg 抗壞血酸，渦旋振蕩1 min，用0.1 mol·L-1氫氧化鈉溶液調節(jié)pH 至7～8，待凈化。

1.4.2 免疫親和柱凈化

取出免疫親和柱恢復至室溫，以勻速釋放出柱內保護液后，加入樣品溶液。待液體排干后，使用5 mL 50%甲醇水洗滌親和柱，擠干柱內殘留液，并棄去以上全部流出液，最后用4 mL 含有1%甲酸的甲醇溶液洗脫，收集的洗脫液于60 ℃氮氣下吹干，用1 mL 初始流動相定容溶解，經過0.22 μm 濾膜凈化后供液相色譜-質譜分析。

2 結果與討論

2.1 色譜條件優(yōu)化

本方法采用1.7 μm 粒徑的ACQUITY UPLC BEH C18 柱分析目標物，選擇正離子模式下加入一定量的有機酸調節(jié)流動相的pH 和加入乙酸銨促進MC 的電離，在保證有良好的分離效果的同時具有較為尖銳的峰形。本實驗研究比較了甲醇、乙腈作為有機相與0.1%甲酸水溶液（含5 mmol·L-1乙酸銨)水溶液組合成流動相的效果。甲醇作為流動相時，MC 的靈敏度略低于用乙腈作流動相，并且MC 出峰時間較晚，但乙腈作為流動相時能夠在6 min 內完成目標物分離和色譜柱平衡。綜合比較，選擇乙腈-0.1%甲酸水溶液（含5 mmol·L-1乙酸銨)作為流動相。

2.2 質譜條件優(yōu)化

MC 的極性較強，選擇正離子掃描模式，用蠕動泵使用100 ng·mL-1的MC 混合標準溶液進行流動注射分析以改善質譜條件。通過一級質譜全掃描分析，確定MC-LR、MC-RR 的分子離子，調試選擇最優(yōu)錐孔電壓和毛細管電壓，選用豐度最高離子m/z 135.0 作為MC-LR 定量離子和m/z 135.1 作為MC-RR 定量離子，如圖1 所示。調整碰撞能量等條件對MC 進行二次離子質譜分析，獲得碎片離子信息，選擇最強離子作為定量離子，次強離子定性離子，具體信息見表1。

圖1 (A)MC-LR 和(B)MC-RR 質譜多反應監(jiān)測（MRM）譜圖Fig.1 (A) MC-LR and (B) MC-RR mass spectrometry multiple reaction monitoring (MRM) spectra

2.3 免疫親和柱條件優(yōu)化

2.3.1 洗脫液的比較和洗脫體積的選擇

本實驗分析比對了不同性質的3 種洗脫溶劑和洗脫體積考察分析度實驗回收率的影響。即采用5 mL的甲醇、1%甲酸甲醇、1%氨水甲醇做為洗脫溶劑，在洗脫過程中將5 mL 的洗脫液均勻分為5 份洗脫液，即每份1 mL，多次淋洗，并且對每1 mL 的洗脫液分析檢測，確定其回收率，實驗結果如圖(A)MC-LR 和(B)MC-RR 所示。實驗結果表明，1%氨水甲醇的洗脫效果在3 種洗脫液中效果較差，回收率最低。對于MCLR 來說，洗脫溶劑采用甲醇或者1%甲酸甲醇對實驗的回收率影響不大；但是在MC-RR 的結果中顯示，1%甲酸甲醇作為洗脫溶劑時其回收率要大于甲醇作為洗脫溶劑時的回收率。綜合考慮，本實驗選擇1%甲酸甲醇作為洗脫溶劑。從兩種物質的回收率上來看，當選擇1%甲酸甲醇作為洗脫液時，洗脫體積在4 mL的情況下回收率已經接近為零，但是為了保證能夠充分洗滌目標物，所以采用了5 mL 的洗脫體積。最終本實驗選取5 mL 1%甲酸甲醇作為最終的洗脫條件。

圖2 不同洗脫液和洗脫體積對(A)MC-LR 和(B)MC-RR 的洗脫影響Fig.2 Elution effect of different elution solutions and elution volumes on the Elution of (A) MC-LR and (B) MC-RR

2.3.2 不同固相萃取柱凈化效果比較

在實驗中通常選用固相萃取柱HLB 和C18 柱用于凈化降低水質中的雜質。因此實驗選擇免疫親和柱、HLB、C18 柱進行實驗分析，按照回收率高低和質譜圖響應值的大小及干擾程度，比較了經3 種柱子凈化后MC 的凈化效果。結果表明IAC 和HLB 柱的回收率明顯高于C18 柱，HLB 柱的凈化效果不如IAC柱，目標峰出峰前有信號比較強的雜質峰。譜圖上顯示免疫親和柱的凈化效果最好，目標峰附近無明顯雜質峰,表明免疫親和柱具有高特異性的特點。

圖3 2.0 μg·L-1 陰性水質加標樣品經(A)C18 柱(B)HLB 柱和(C)IAC 柱凈化后的MRFig.3 MRM chromatograms of 2.0 μg·L-1 water quality sample cleaned up by(A) C18,(B) HLB and (C) IAC column

2.3.3 基質效應評價

本實驗參考MATUSZEWSKI,et al[21]建立的方法來分析基質效應的影響，選擇湖水、海水、池塘水、河水作為代表性水體，每種水體做3 個平行樣，分別測定MC-LR、MC-RR 標準品溶液的色譜峰面積(S1)和空白水體基質濃縮復溶形成的溶液添加標準品溶液后的色譜峰面積(S2)，以S2/S1(%)的比值作為絕對基質效應評價的標準。實驗結果顯示湖水中的基質效應是95.28%～102.87%；海水的基質效應是97.23%～105.67%；池塘水的基質效應是96.45%～112.43%；河水的基質效應是95.17%～110.55%?？傮w的基質效應在95.17%～112.43%之間，在可接受的±12%范圍以內波動的。結果表明免疫親和柱可以降低基質干擾，能夠達到良好的凈化效果。

2.4 線性范圍和定量限

使用MC 混合標準品，準備濃度為0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 和20.0 ng·mL-1標準工作溶液，在已優(yōu)化的實驗條件下，以濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標來繪制標準曲線，結果表明2 種分析物在0.5～20 ng·mL-1濃度范圍內線性相關系數(shù)均大于0.999 5，滿足儀器分析的需要；在3 倍信噪比和10 倍信噪比下分別計算該方法的理論檢測限(LOD)和定量限(LOQ)，得出2 種分析物的檢出限和定量限均為0.3 ng·mL-1和0.5 ng·mL-1。本方法檢出限低，靈敏度高，適用于水環(huán)境中MC 的檢測。

2.5 回收率和精密度

分別準確量取不含MC 的湖泊水、海水、池塘水、河水50 mL，加入3 種不同濃度的MC 混合標準溶液以使3 種添加樣品的MC 含量分別為2.00，5.00 和10.00 ng·mL-1，對每個濃度重復測定6 次，按照本方法進行加標回收率實驗，計算回收率和相對標準偏差。結果見表2。MC-LR 在2.00、5.00 和10.00 ng·mL-13個添加水平下的平均回收率在88.52%～94.83%之間，相對標準偏差為0.54%～2.27%之間；MC-RR 在2.00、5.00 和10.00 ng·mL-13 個添加水平下的平均回收率在84.71%～91.59%之間，相對標準偏差為0.39%～5.94%之間。

表2 MC 的加標回收率和精密度實驗Tab.2 Limits of quantity,recoveries and RSDs of MC

2.6 實際樣品分析

根據《SL 219-1998 水環(huán)境監(jiān)測規(guī)范》對無錫市的太湖水，新安區(qū)河水，東南大學池塘水，舟山市的河水，水庫及海水采樣，共計45 份樣品。采用本方法進行檢測分析，發(fā)現(xiàn)新安區(qū)河水中檢出MC-LR 和MCRR，濃度分別在0.30～2.73 ng·mL-1、0.56～2.67 ng·mL-1，其余樣本未檢測出微囊藻毒素。結果分析表明，本方法能過滿足檢測分析要求，能夠為開展相關的風險監(jiān)測工作提供依據。

3 結論

本方法采用免疫親和柱專一特異性及優(yōu)秀的凈化能力等優(yōu)點，通過研究免疫親和柱的自身條件的優(yōu)化以及結合液相色譜-串聯(lián)質譜的流動相選擇和組成，成功地建立了免疫親和柱凈化-UPLC-MS/MS 檢測湖泊水環(huán)境中微囊藻毒素的方法。本方法實驗過程操作簡便、綠色環(huán)保、基質干擾小，精密度和回收率高，滿足檢測分析的要求。