鹽脅迫下外源2,4-表油菜素內(nèi)酯對(duì)顛茄氮代謝及TAs代謝的影響

辛正琦 代歡歡 辛余鳳 何 瀟 謝海艷 吳能表,*

鹽脅迫下外源2,4-表油菜素內(nèi)酯對(duì)顛茄氮代謝及TAs代謝的影響

辛正琦1代歡歡2辛余鳳1何 瀟1謝海艷1吳能表1,*

1西南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/ 三峽庫(kù)區(qū)生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 重慶 400715;2甘肅慶陽(yáng)市第五中學(xué), 甘肅慶陽(yáng) 745000

以顛茄(L.)幼苗為材料, 采用盆栽試驗(yàn), 使用外源2,4-表油菜素內(nèi)酯(2,4-Epibrassinolide, EBR)處理幼苗, 研究在100 mmol L-1 NaCl脅迫下不同濃度(0.05、0.1、0.2、0.4 mg L-1)外源EBR在不同處理時(shí)間(5、10、15、20 d)內(nèi)對(duì)顛茄氮代謝、次生代謝產(chǎn)物含量以及托品烷類生物堿(tropane alkaloids, TAs)合成途徑中前體物質(zhì)含量、關(guān)鍵酶基因表達(dá)量的影響, 旨在明確外源EBR調(diào)控顛茄耐鹽性的生理機(jī)制。鹽脅迫下顛茄氮代謝受到抑制, 而施加外源EBR能夠有效增強(qiáng)顛茄的氮代謝能力, 硝態(tài)氮含量顯著升高, 銨態(tài)氮含量降低, 游離氨基酸、可溶性蛋白含量以及氮代謝關(guān)鍵酶活性均有不同程度的上升。鹽脅迫不利于生物堿的合成和積累, 顯著降低了TAs途徑中前體物質(zhì)的合成和關(guān)鍵酶基因的表達(dá)。外施0.1 mg L-1 EBR能夠有效提高鳥(niǎo)氨酸、精氨酸、多胺含量以及腐胺合成關(guān)鍵酶活性, 并通過(guò)上調(diào)TAs途徑中關(guān)鍵酶基因的表達(dá)量來(lái)提高莨菪堿和東莨菪堿的含量。表明適宜濃度的外源EBR能夠有效緩解鹽脅迫對(duì)顛茄生理代謝的破壞, 通過(guò)提高氮代謝能力、促進(jìn)TAs的產(chǎn)生和積累, 提高顛茄幼苗的耐鹽性。

顛茄; 鹽脅迫; 氮代謝; 次生代謝

顛茄(L.)也叫做“顛茄草”、“美女草”、“野山茄”, 屬于茄科顛茄屬的一種多年生草本植物, 其葉、草粉及根均可入藥[1]。2010年版《中國(guó)藥典》收錄并規(guī)定其為唯一的托品烷類生物堿(tropane alkaloids, 簡(jiǎn)稱TAs)的藥源植物, 在臨床上應(yīng)用廣泛。

土壤鹽漬化現(xiàn)象已成為一個(gè)世界性的資源和環(huán)境問(wèn)題, 對(duì)人類社會(huì)進(jìn)步和發(fā)展造成嚴(yán)重的影響, 在社會(huì)上受到越來(lái)越多的關(guān)注[2]。目前, 我國(guó)土地面積中約有1/4為鹽漬土, 并且由于灌溉不合理、氣候變化等因素, 導(dǎo)致鹽漬土面積仍在逐年增加[3]。土壤中鹽濃度過(guò)高會(huì)造成鹽脅迫, 鹽脅迫會(huì)對(duì)植物的生長(zhǎng)以及多種生理代謝過(guò)程造成不同程度的影響, 嚴(yán)重時(shí)甚至導(dǎo)致植株死亡[4], 嚴(yán)重抑制了植物生長(zhǎng)發(fā)育以及農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)。任文奇等[5]研究發(fā)現(xiàn), Ca(NO3)2脅迫使2種甜瓜幼苗體內(nèi)銨態(tài)氮含量升高, 氮代謝關(guān)鍵酶活性降低, 從而嚴(yán)重影響了甜瓜幼苗的氮代謝平衡, 且自身可以通過(guò)不同方式積累氨基酸來(lái)緩解脅迫。還有研究發(fā)現(xiàn), 短時(shí)間的NaCl處理可使甘草次生代謝產(chǎn)物含量的提高, 而長(zhǎng)時(shí)間高濃度的NaCl脅迫抑制其次生代謝, 甘草酸含量顯著下降[6]。

油菜素內(nèi)酯(brassionolide, BR), 也稱蕓薹素, 是1970年首次在油菜花粉中發(fā)現(xiàn)第六大類植物激素。油菜素內(nèi)酯在植物界中廣泛存在, 具有協(xié)調(diào)植物體內(nèi)多種內(nèi)源激素的相對(duì)水平, 促進(jìn)生長(zhǎng)發(fā)育、次生代謝及提高植物抗逆性多種生理功能[7], 因此被廣泛使用于農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)。張華等[8]在滇紫草細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系中加入適宜濃度的BR, 可顯著促進(jìn)紫草素的形成。并顯著增強(qiáng)了植物次生代謝途徑中關(guān)鍵酶之一苯丙氨酸裂解酶的活性。池劍亭等[9]研究發(fā)現(xiàn), 外施BR處理青蒿, 能使青蒿素生物合成相關(guān)的關(guān)鍵酶基因、和的表達(dá)上調(diào), 進(jìn)而顯著提高了青蒿素的含量。迄今為止, 研究者已從植物中分離鑒定出70多種類似于BR的化合物, 統(tǒng)稱為油菜素內(nèi)酯。但植物體內(nèi)含有的油菜素內(nèi)酯的非常少, 因此科研人員一般采用人工合成的BRs來(lái)進(jìn)行科學(xué)研究, 其中2,4-表油菜素內(nèi)酯(EBR)就是人工合成的高活性油菜素內(nèi)酯類似物。

本試驗(yàn)以顛茄幼苗為材料, 采用室內(nèi)模擬鹽脅迫環(huán)境, 通過(guò)噴施不同濃度EBR研究鹽脅迫下外源EBR對(duì)顛茄氮代謝及次生代謝的影響, 并對(duì)其調(diào)控機(jī)理進(jìn)行初步探究, 以期緩解鹽脅迫對(duì)顛茄生長(zhǎng)造成的脅迫傷害, 提高顛茄的抗逆性。為實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中解決鹽害問(wèn)題提供一定的理論依據(jù), 同時(shí)為提高顛茄次生代謝產(chǎn)物含量提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料及處理

顛茄(L.)種子, 由西南大學(xué)三峽庫(kù)區(qū)生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。挑選健康的顛茄種子, 用50 mg L-1赤霉素溶液浸泡2 d后, 取出用清水清洗干凈, 然后均勻地鋪在濕潤(rùn)的濾紙上, 25℃條件下進(jìn)行萌發(fā), 每隔24 h澆1次水。種子萌發(fā)出苗后, 移栽至直徑12 cm, 高10 cm的營(yíng)養(yǎng)缽中, 基質(zhì)配比為泥炭土∶珍珠∶巖蛭石=3∶1∶1, 每缽3株, 共300缽, 每7 d澆灌1次稀釋10倍的MS營(yíng)養(yǎng)液, 光照周期為12 h, 光照強(qiáng)度為5000mmol m-2s-1; 培養(yǎng)溫度為25℃/20℃ (晝/夜); 相對(duì)濕度為60%~70%。生長(zhǎng)45 d后, 挑選300缽長(zhǎng)勢(shì)基本一致的顛茄苗進(jìn)行NaCl脅迫試驗(yàn)。

將NaCl溶于稀釋10倍的MS營(yíng)養(yǎng)液中, 配制成100 mmol L-1 NaCl溶液澆灌顛茄植株來(lái)提供鹽脅迫環(huán)境。共設(shè)4個(gè)不同濃度梯度的EBR溶液, 于每天上午定時(shí)對(duì)葉片噴施對(duì)應(yīng)濃度的EBR溶液至液體欲滴, 具體方式見(jiàn)表1。于NaCl脅迫的第5、10、15和20天時(shí)進(jìn)行采樣, 將采集的顛茄葉片一部分低溫保存在-80℃冰箱中, 用于后續(xù)各項(xiàng)指標(biāo)的測(cè)定。另一部分顛茄葉片放置于烘箱中烘干, 磨成細(xì)粉存放在干燥處, 用于生物堿和多胺含量的測(cè)定。另采集20 d時(shí)顛茄葉片、根組織材料, 放入液氮冷凍后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱中, 用于相對(duì)基因表達(dá)量的測(cè)定。

1.2 測(cè)定方法

1.2.1 氮代謝相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定 參照李合生[10]方法測(cè)定硝態(tài)氮、游離氨基酸(free amino acids, FAA)和可溶性蛋白(soluble proteins, SP)含量; 參照湯紹虎和羅充[11]的方法測(cè)定谷氨酰胺合成酶(glutamine synthase, GS)活性; 采用上海優(yōu)選生物科技有限公司的測(cè)試盒測(cè)定銨態(tài)氮、硝酸還原酶(nitrate reductase, NR)和谷氨酸脫氫酶(glutamate dehydrogenase, GDH)活性。

表1 顛茄幼苗的不同處理組合

1.2.2 生物堿含量測(cè)定 參照Z(yǔ)árate等[12]提取方法提取生物堿, 略改動(dòng)。采用HPLC測(cè)定莨菪堿、東莨菪堿含量。色譜儀: 日本島津(Shimadzu) LC-60A高效液相色譜儀(泵: LC-20AD、柱溫箱: CTO-10AS vp、控制器: SPD-20A); 色譜柱: Xtimate-C18液相色譜柱(5 μm, 4.6 mm × 250.0 mm); 流動(dòng)相: 甲醇-醋酸緩沖液(20 mmol L-1醋酸銨, 0.1%甲酸, pH 4.0, 體積比1∶4); 進(jìn)樣量: 10 μL; 檢測(cè)波長(zhǎng): 226 nm; 流速: 1.0 mL min-1; 柱溫: 40℃。

1.2.3 多胺合成相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定 參照黃愛(ài)清等[13]方法測(cè)定鳥(niǎo)氨酸含量, 參照胡桂娟等[14]方法測(cè)定精氨酸含量, 均略有改動(dòng); 稱取處理至20 d的顛茄葉片0.1 g, 參照趙福庚和劉友良[15]方法測(cè)定鳥(niǎo)氨酸脫羧酶(ornithine decarboxylase, ODC)和精氨酸脫羧酶(arginine decarboxylase, ADC)活性, 略有改動(dòng); 參照康朵蘭[16]方法提取并甲?；~片中的游離多胺, 樣品液過(guò)0.45 μm濾膜后采用HPLC測(cè)定多胺含量。色譜儀、色譜柱同上; 流動(dòng)相為: 甲醇∶水= 64∶36; 流速: 0.7 mL min-1; 檢測(cè)波長(zhǎng): 230 nm; 柱溫: 30℃; 進(jìn)樣量: 10 μL。

1.2.4 生物堿合成途徑中關(guān)鍵酶基因表達(dá)量的檢測(cè) 按照Biospin多糖多酚植物總RNA提取試劑盒使用說(shuō)明提取總RNA。按照Hifair II 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR (gDNA digester plus)說(shuō)明書(shū)操作步驟進(jìn)行顛茄根、葉RNA的逆轉(zhuǎn)錄, 合成用于熒光定量所需的cDNA模板。根據(jù)NCBI上公布的序列及參照強(qiáng)瑋等[17-18]的引物序列設(shè)計(jì)和基因引物, 參照邱飛等[19]的引物序列設(shè)計(jì)基因引物, 由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成(表2)。以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA作為模板, 使用Promega GoqPCR Master Mix (A6001)試劑盒進(jìn)行熒光定量PCR。以為內(nèi)參基因[20], 樣本和內(nèi)參基因分別設(shè)3個(gè)重復(fù)和1個(gè)陰性對(duì)照, 基因表達(dá)量均以內(nèi)參基因作為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行相對(duì)定量, 采用2-ΔΔCt法計(jì)算。

表2 熒光定量PCR檢測(cè)所用引物

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽脅迫下外源EBR處理后顛茄幼苗的生長(zhǎng)情況

由圖1可知, 與CK組相比, T0組顛茄的生長(zhǎng)受到了明顯的抑制, 出現(xiàn)葉面積減小、植株矮小等顯著癥狀。添加不同濃度的外源EBR后, 顛茄的生長(zhǎng)均有不同程度的恢復(fù), 其中B2、B3組長(zhǎng)勢(shì)較好。表明外源EBR能夠緩解鹽脅迫處理對(duì)顛茄葉形成和發(fā)育的抑制作用。

2.2 外源EBR對(duì)鹽脅迫下顛茄葉片中含氮化合物含量的影響

硝態(tài)氮(NO3--N)和銨態(tài)氮(NH4+-N)是2種主要的無(wú)機(jī)氮源, 能夠轉(zhuǎn)化形成游離氨基酸、可溶性蛋白等有機(jī)含氮化合物, 供植物利用[21], 含氮化合物的含量可以反映氮代謝的水平。由表3可知, 鹽脅迫下顛茄葉片中硝態(tài)氮含量較對(duì)照顯著下降, 且隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng), 下降程度增加。銨態(tài)氮含量在脅迫初期(5 d)時(shí), 較對(duì)照組CK有所下降。而在脅迫的第10、15和20天時(shí), T0組的銨態(tài)氮含量顯著提高, 分別較CK組提高19.240%、56.082%和75.282%。噴施不同濃度EBR后顯著提高了顛茄葉片中硝態(tài)氮的含量, 降低了銨態(tài)氮的含量。第20天時(shí), 0.1 mg L-1的EBR處理效果最顯著, 較T0組硝態(tài)氮顯著提高51.577%, 而銨態(tài)氮顯著降低33.691%。鹽脅迫下, 顛茄葉片中游離氨基酸和可溶性蛋白較對(duì)照組均顯著下降。20 d時(shí), 二者含量降到最低, 較CK組分別降低22.788%和33.346%。經(jīng)不同濃度EBR處理后, 二者含量較CK2組顯著提高,總體來(lái)看, 0.1 mg L-1、0.2 mg L-1 EBR的處理效果最為顯著。表明外源EBR能夠緩解鹽脅迫對(duì)顛茄葉片NO3--N同化的抑制作用, 加速NH4+-N的代謝速度, 提高游離氨基酸和可溶性蛋白含量, 改善了鹽脅迫下顛茄氮代謝的進(jìn)程。

處理同表1。標(biāo)尺為10 cm。

Treatments are the same as those given in Table 1. Bar: 10 cm.

表3 不同濃度外源EBR對(duì)鹽脅迫下顛茄葉片含氮化合物含量的影響

同列數(shù)據(jù)不同小寫字母表示同一指標(biāo)不同處理間在0.05水平差異顯著。處理同表1。

Values within a column followed by different lowercase letters represent significantly different at the 0.05 probability level in the same indicator among the treatments. Treatments are the same as those given in Table 1.

2.3 外源EBR對(duì)鹽脅迫下顛茄氮代謝關(guān)鍵酶活性的影響

硝酸還原酶(NR)、谷氨酰胺合成酶(GS)和谷氨酸脫氫酶(GDH)在植物氮代謝途徑中起著關(guān)鍵作用。由表4可知, 與對(duì)照相比, 鹽脅迫下顛茄葉片中NR、GS和GDH的活性均受到顯著抑制, 除GDH活性在5 d時(shí)較CK略有升高, 隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng), 3種酶活性受到的抑制程度也越大。20 d時(shí), T0組NR、GS和GDH活性較CK組分別降低45.416%、32.104%和34.982%。添加不同濃度EBR后, 3種酶的活性均有不同程度的升高, 且在各個(gè)處理時(shí)間內(nèi),隨著EBR濃度的升高酶活性呈先上升后下降的趨勢(shì)。整體來(lái)看, 0.1 mg L-1 EBR對(duì)于提高NR和GS活性效果最顯著, 而對(duì)于GDH, 則是0.2 mg L-1 EBR的處理效果最好。表明, 短期鹽脅迫可提高GDH活性, 但總體來(lái)看, 鹽脅迫下NR、GS和GDH的活性均被抑制, 嚴(yán)重影響了氮代謝的進(jìn)行。一定濃度的外源EBR可使NR、GS和GDH的活性增強(qiáng), 提高了顛茄氮代謝速率, 從而緩解鹽脅迫對(duì)顛茄氮代謝關(guān)鍵酶活性的抑制作用。

表4 不同濃度外源EBR對(duì)鹽脅迫下顛茄葉片硝酸還原酶, 谷氨酰胺合成酶和谷氨酸脫氫酶活性的影響

同列數(shù)據(jù)不同小寫字母表示同一指標(biāo)不同處理間在0.05水平差異顯著。處理同表1。

Values within a column followed by different lowercase letters represent significantly different at 0.05 probability level in the same indicator among treatments. NR: nitrate reductase; GS: glutamine synthase; GDH: glutamate dehydrogenase. Treatments are the same as those given in Table 1.

2.4 外源EBR對(duì)鹽脅迫下顛茄葉片TAs含量的影響

顛茄中主要的次生代謝產(chǎn)物莨菪堿和東莨菪堿具有較高的藥用價(jià)值。由圖2可知, 處理5 d時(shí), 鹽脅迫下莨菪堿含量較CK組略有升高, 隨著天數(shù)增加, 莨菪堿含量逐漸降低。而東莨菪堿在整個(gè)處理期內(nèi)均顯著低于CK組。添加不同濃度EBR處理后, 在同一處理時(shí)間下, 各處理組莨菪堿和東莨菪堿含量較T0組均有不同程度的回升, 且隨著EBR濃度的升高表現(xiàn)出先增后降的趨勢(shì)。20 d時(shí), 0.1 mg L-1 EBR處理后莨菪堿和東莨菪堿含量最高, 分別是T0組的0.247倍和0.688倍。表明短期的鹽脅迫處理可以促進(jìn)莨菪堿的積累, 但隨著鹽脅迫時(shí)間的增加, 對(duì)顛茄生物堿的合成產(chǎn)生了顯著的抑制作用。外施適宜濃度的EBR能夠促進(jìn)生物堿的積累, 表現(xiàn)在當(dāng)EBR濃度為0.1 mg L-1時(shí)效果最佳。

2.5 外源EBR對(duì)鹽脅迫下顛茄葉片鳥(niǎo)氨酸和精氨酸含量的影響

精氨酸和鳥(niǎo)氨酸既是氮代謝的產(chǎn)物, 也是TAs合成途徑中的底物氨基酸, 為TAs的合成提供了前體物質(zhì)。由圖3可知, 鹽脅迫下鳥(niǎo)氨酸和精氨酸含量均有所降低, 較對(duì)照組CK分別下降43.935%和26.569%。說(shuō)明顛茄受到了鹽脅迫的影響, 體內(nèi)鳥(niǎo)氨酸和精氨酸的合成受到了抑制。添加不同濃度EBR處理后, 兩者含量較單純鹽脅迫組有所增加, 隨著EBR濃度的升高, 0.1 mg L-1 EBR處理時(shí)兩者含量達(dá)到最高, 分別較T0組增加57.229%和25.219%, 隨后含量又下降。說(shuō)明適宜濃度的EBR可有效提高鹽脅迫下顛茄葉片中精氨酸和鳥(niǎo)氨酸的含量。

不同小寫字母表示處理間在0.05水平差異顯著。處理同表1。

Different lowercase letters represent significantly different at the 0.05 probability level among the treatments. Treatments are the same as those given in Table 1.

不同小寫字母表示處理間在0.05水平差異顯著。處理同表1。

Different lowercase letters represent significantly different at the 0.05 probability level among treatments. Treatments are the same as those given in Table 1.

2.6 外源EBR對(duì)鹽脅迫下顛茄葉片多胺含量的影響

多胺(polyamines, PAs)是一類普遍存在于生物體代謝過(guò)程中具有生物活性的低分子量脂肪族含氮堿[22]。主要由腐胺(putrescine, Put)、精胺(spermine, Spm)和亞精胺(spermidine, Spd) 3種形式組成。圖4-A為處理20 d時(shí)顛茄葉片中多胺含量的變化情況, 表明各處理組中Put含量最高, 鹽脅迫顯著降低了Put和Spd的含量, 而Spm較對(duì)照組CK有略微升高。不同濃度EBR處理下, 相較于T0組, 各處理組中3種多胺含量均有顯著升高, T3處理組中Put和Spd含量升高最多, 而B(niǎo)2組中Spm含量增長(zhǎng)幅度最多; B2組和B3相比, Put含量更低, Spd含量雖然略低于B3組但并不顯著。圖4-B為多胺總量的變化情況, 可以看出, 鹽脅迫使多胺總量顯著降低, 噴施EBR后有所緩解, 其中以0.1 mg L-1、0.2 mg L-1 EBR處理效果較好, 兩組之間差異性不顯著。說(shuō)明, 長(zhǎng)時(shí)間鹽脅迫處理不利于顛茄葉片中多胺的積累, Put、Spd及多胺總量較CK均顯著下降, 0.1 mg L-1、0.2 mg L-1 EBR能使多胺含量及多胺總量均維持在較高水平。

2.7 外源EBR對(duì)鹽脅迫下顛茄葉片ODC和ADC酶活性的影響

為明確EBR對(duì)鹽脅迫下Put的影響機(jī)制, 測(cè)定了鹽脅迫處理20 d時(shí)顛茄葉片中ODC和ADC的活性。由圖5可知, 鹽脅迫降低了顛茄葉片中ODC和ADC的活性, 分別較CK組下降20.697% 和30.855%。噴施不同濃度EBR后酶活性均有一定程度的增加, 且2種酶的變化趨勢(shì)相似, 同時(shí)在0.1 mg L-1、0.2 mg L-1 EBR處理下活性最高, 2組之間無(wú)顯著性差異。根據(jù)各組Put含量的變化情況來(lái)看, B3組中Put含量最高且顯著高于B2組, 而B(niǎo)2與B3組中ODC與ADC活性卻相差不大, 再結(jié)合B2處理組下生物堿含量增加, 推測(cè)Put的積累較少是由于生成的Put迅速進(jìn)入次生代謝途徑中用于TAs的合成造成的。

不同小寫字母表示處理間在0.05水平差異顯著。處理同表1。

Different lowercase letters represent significantly different at the 0.05 probability level among treatments. Treatments are the same as those given in Table 1.

不同小寫字母表示處理間在0.05水平差異顯著。處理同表1。

Different lowercase letters represent significantly different at the 0.05 probability level among treatments. Treatments are the same as those given in Table 1.

2.8 外源EBR對(duì)鹽脅迫下顛茄根、葉中TAs合成關(guān)鍵酶基因表達(dá)量的影響

托品酮還原酶I (tropinone reductase I, TR I)、甲基-腐胺-轉(zhuǎn)移酶(putrescine n-methyltransferase, PMT)、莨菪堿6β-羥基化酶(hyoscyamine 6β-hydroxylase, H6H)和苯丙酮酸還原酶(phenylpyruvate reductase, PPAR)是從顛茄中已經(jīng)鑒定出的TAs合成途徑中的關(guān)鍵酶, 其相應(yīng)編碼基因的表達(dá)量直接決定合成途徑的中間產(chǎn)物流向及生物堿的產(chǎn)量。表明, 顛茄中、和的表達(dá)具有組織特異性, 只在根中表達(dá), 因此本試驗(yàn)僅在葉片中檢測(cè)到明顯表達(dá)。由圖6可知, 鹽脅迫20 d時(shí), 顛茄葉片中T0組的表達(dá)量較CK組有所上升。經(jīng)0.1 mg L-1 EBR處理后, B2組中的表達(dá)量與T0組相比得到了顯著提高, 且根和葉中的表達(dá)情況基本相同。是TAs合成途徑中的中間分支點(diǎn)基因, 其高效表達(dá)可促進(jìn)托品烷類生物堿直接前提物質(zhì)托品的生成。鹽脅迫20 d時(shí)顛茄根中T0組、和的相對(duì)表達(dá)量較CK組均有所降低, 其中的表達(dá)量降低幅度較大。在鹽脅迫下噴施0.1 mg L-1 EBR處理后, 顯著提高了的相對(duì)表達(dá)量,是下游的重要基因, 高水平的表達(dá)可促進(jìn)莨菪堿轉(zhuǎn)化為東莨菪堿。說(shuō)明, 鹽脅迫抑制了根中、和的表達(dá)水平, 但可使根和葉中的相對(duì)表達(dá)量上調(diào); 而外施0.1 mg L-1 EBR對(duì)、、和的表達(dá)量均有一定的提高, 其中對(duì)和表達(dá)量上調(diào)的誘導(dǎo)效果更為顯著, 有效緩解了鹽脅迫對(duì)2個(gè)基因表達(dá)量的抑制作用。

3 討論

氮代謝作為植物初生代謝的一種重要途徑, 對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育和新陳代謝有重要影響。本研究中, NaCl脅迫對(duì)植株幼苗體內(nèi)的氮代謝造成明顯的抑制作用。Yuan等[23]研究表明, 外源EBR能夠通過(guò)提高植物氮代謝能力緩解鹽脅迫對(duì)自身造成的傷害, 從而增強(qiáng)其在非生物逆境環(huán)境下的抗性。馬月花等[24]的研究表明, EBR可以通過(guò)增強(qiáng)黃瓜根系NR活性及葉片NAD+-GDH活性, 增強(qiáng)硝酸還原, 加強(qiáng)氮代謝, 從而緩解逆境對(duì)植株的傷害?？芙瓭齕25]研究發(fā)現(xiàn), 鹽脅迫下噴施外源EBR能夠顯著增強(qiáng)苜蓿幼苗體內(nèi)NR、GS和GOGAT活性, 提高植物氮代謝能力。本試驗(yàn)也得到了類似的結(jié)果, 0.1 mg L-1和0.2 mg L-1EBE能夠促進(jìn)游離氨基酸和可溶性蛋白的積累, 顯著提高了顛茄氮代謝關(guān)鍵酶的活性, 有利于硝態(tài)氮的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn), 以及銨態(tài)氮更多地向Glu轉(zhuǎn)化, 銨態(tài)氮大量積累易產(chǎn)生氨毒, 抑制幼苗正常生長(zhǎng)[26]。推測(cè)EBR通過(guò)提高顛茄氮代謝能力來(lái)增強(qiáng)自身的抗鹽性(圖7)。

不同小寫字母表示處理間在0.05水平差異顯著。處理同表1。

Different lowercase letters represent significantly different at the 0.05 probability level among treatments. Treatments are the same as those given in Table 1.

氮代謝與次生代謝產(chǎn)物的合成機(jī)制密切相關(guān), 氮同化可以直接為生物堿的合成提供合成原料氨基酸精氨酸或者鳥(niǎo)氨酸, 進(jìn)而影響生物堿合成。鳥(niǎo)氨酸在鳥(niǎo)氨酸脫羧酶(ODC)的催化作用下可直接催化脫羧形成TAs合成前體物質(zhì)腐胺[27]; 精氨酸在精氨酸脫羧酶(ADC)的催化作用下生成精胺, 然后經(jīng)過(guò)一系列酶促反應(yīng)生成腐胺[28]。腐胺的繼續(xù)轉(zhuǎn)化有2個(gè)方向, 一是進(jìn)入多胺生物合成途徑, 可逆形成亞精胺(Spd)后, 亞精胺又可逆形成多胺生物合成的末端物質(zhì)精胺(Spm); 二是在PMT催化下形成 N-甲基-腐胺, 直接進(jìn)入到TAs合成途徑。本試驗(yàn)結(jié)果顯示, 鹽脅迫下, 鳥(niǎo)氨酸和精氨酸含量均下降, 外源EBR處理后二者含量均顯著增加, 從而為腐胺的合成提供更多的底物。有研究表明, ODC在顛茄TAs生物合成中起重要作用, 過(guò)量表達(dá)能夠顯著提高顛茄中腐胺, 莨菪堿的含量[29]。本研究中外源EBR能夠有效增強(qiáng)ODC、ADC的活性, 減弱鹽脅迫對(duì)ODC和ADC活性的降低。且EBR處理能夠提高多胺含量, 緩解鹽脅迫對(duì)多胺積累的抑制作用。研究表明, 多胺能夠穩(wěn)定膜的結(jié)構(gòu)和功能, 提高活性氧清除酶(SOD、CAT和APX)的活性來(lái)降低活性氧的水平, 對(duì)植物環(huán)境脅迫過(guò)程中的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及生理代謝有重要作用[30]。推測(cè)EBR通過(guò)提高多胺含量來(lái)增強(qiáng)顛茄的抗鹽性。本研究中, Put含量的增加更多, 而Spm含量的增加相對(duì)較少, 推測(cè)EBR能夠使腐胺向亞精胺方向轉(zhuǎn)化減少, 更多的進(jìn)入TAs合成途徑。結(jié)合表達(dá)水平上調(diào)的結(jié)果也可以驗(yàn)證此結(jié)論。在聯(lián)系多胺合成和TAs合成中起著樞紐作用。

東莨菪堿和莨菪堿作為顛茄中重要的2種次生代謝產(chǎn)物, 具有很高的藥用價(jià)值。已有研究表明, 油菜素內(nèi)酯作為一種新型激素, 不僅可以提高植物的抗逆性也對(duì)植物次生代謝產(chǎn)物的積累有著促進(jìn)作用。喬晶等[31]研究發(fā)現(xiàn), BR處理可顯著升高甘草的株高地莖, 并提高甘草酸、甘草苷等次生代謝產(chǎn)物的含量。本研究發(fā)現(xiàn), 100 mmol L-1NaCl處理下, 東莨菪堿含量持續(xù)降低, 而莨菪堿含量?jī)H在脅迫初期有所上高, 隨后降低。說(shuō)明較長(zhǎng)時(shí)間的鹽脅迫處理不利于顛茄葉片莨菪堿和東莨菪堿的積累, 這與楊怡[32]的研究結(jié)果相一致。外施不同濃度油菜素內(nèi)酯能夠有效緩解鹽脅迫對(duì)顛茄生物堿合成的阻礙, 當(dāng)EBR濃度為0.1 mg L-1時(shí)效果最好。為進(jìn)一步研究外源EBR對(duì)鹽脅迫下顛茄生物堿代謝的調(diào)控機(jī)制, 對(duì)20 d時(shí)3個(gè)處理組基因的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn), 鹽脅迫降低了根中和的表達(dá)水平, 顯著上調(diào)了根和葉中的表達(dá)量, 且表達(dá)量相較于其他關(guān)鍵酶基因處于較高水平, 說(shuō)明根和葉中對(duì)于環(huán)境刺激更加敏感。的高效表達(dá)能夠促進(jìn)TAs的直接前體物質(zhì)托品的合成; H6H是拓品烷類生物堿合成途徑最末端的限速酶, 其高效表達(dá)能促進(jìn)莨菪堿向東莨菪堿轉(zhuǎn)化, 從而增加生物堿積累。本試驗(yàn)中, 外源EBR添加后能夠有效促進(jìn)和的高效表達(dá), 而和的表達(dá)量雖有變化, 但仍低于和。推測(cè)EBR主要通過(guò)調(diào)節(jié)和表達(dá)水平提高生物堿的含量。有研究表明, 次生代謝物質(zhì)在植物抵御和適應(yīng)各種生物和非生物脅迫而獲得生存的過(guò)程中起到重要作用[33], 推測(cè)鹽脅迫下, EBR可能通過(guò)增強(qiáng)次生代謝途徑, 使顛茄產(chǎn)生更多的次生代謝產(chǎn)物來(lái)增強(qiáng)自身的抗逆性(圖7)。但是關(guān)于EBR下游是否存在信號(hào)分子直接調(diào)控TAs途徑仍有待進(jìn)一步研究。

紅色代表顯著上升; 綠色代表顯著降低; 白色代表無(wú)明顯變化; FAA: 游離氨基酸; SP: 可溶性蛋白; Orn: 鳥(niǎo)氨酸; Arg: 精氨酸; Hyo: 莨菪堿; Sco: 東莨菪堿。

Red represents a significant increase; green represents a significant decrease; white represents no obvious change; FAA: free amino acids; SP: soluble protein; Orn: ornithine; Arg: arginine; Hyo: hyoscyamine; Sco: scopolamine.

4 結(jié)論

0.1 mg L-1外源EBR處理可顯著提高鹽脅迫下含氮化合物的含量, 并誘導(dǎo)NR、GS和GDH活性升高, 使被吸收的無(wú)機(jī)氮源加速進(jìn)行同化, 為TAs的合成提供物質(zhì)基礎(chǔ); 同時(shí)降低銨態(tài)氮積累, 避免氨積累可能造成的對(duì)呼吸過(guò)程中電子傳遞系統(tǒng)的抑制。鹽脅迫顯著抑制了生物堿的合成和積累, 外源EBR能夠顯著增加TAs合成途徑中前體物質(zhì)多胺Put的含量、多胺合成關(guān)鍵酶活性, 并通過(guò)調(diào)控TAs途徑上下游關(guān)鍵酶基因和的表達(dá), 促進(jìn)下游產(chǎn)物莨菪堿的合成以及莨菪堿向東莨菪堿轉(zhuǎn)化。綜上所述, 外源EBR可以通過(guò)調(diào)控鹽脅迫下顛茄體內(nèi)氮代謝和TAs代謝途徑來(lái)提高顛茄的耐鹽性。在實(shí)際生產(chǎn)中, 可考慮通過(guò)噴施適宜濃度的EBR來(lái)應(yīng)對(duì)顛茄培育過(guò)程中可能遇到的鹽害問(wèn)題, 提高其抗逆性以及獲得更多的藥用成分。

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Effects of exogenous 2,4-Epibrassinolide on nitrogen metabolism and TAs metabolism ofL. under NaCl stress

XIN Zheng-Qi1, DAI Huan-Huan2, XIN Yu-Feng1, HE Xiao1, XIE Hai-Yan1, and WU Neng-Biao1,*

1School of Life Science, Southwest University / Key Laboratory of Eco-environments in Three Gorges Region, Ministry of Education, Chongqing 400715, China;2The Fifth Middle School of Qingyang, Qingyang 745000, Gansu, China

To explore the physiological mechanism of exogenous 2,4-Epibrassinolide (EBR) regulating NaCl tolerance of,pottedseedlings was used as the experimental materials, and exogenous EBR was applied toseedlings with the different concentrations (0.05, 0.1, 0.2, and 0.4 mg L–1) of exogenous EBR and different treatment times (5, 10, 15, and 20 days) on the nitrogen metabolism, the contents of the secondary metabolites and precursor substances in the synthesis pathway of TAs, and the relative expression levels of key enzyme genes. NaCl stress caused inhibitory effect on nitrogen metabolism in, however the content of nitrate nitrogen increased significantly, the content of ammonium nitrogen decreased, the content of free amino acids, soluble protein, and the activity of key enzymes of nitrogen metabolism increased to some extent under exogenous EBR treatment, which indicating the exogenous EBR could effectively enhance the nitrogen metabolism capacity. NaCl stress was not conducive to the synthesis and accumulation of alkaloids. The synthesis of precursor substances and the relative expression levels of key enzyme genes in TAs pathway significantly were reduced under NaCl stress. The contents of ornithine, arginine, polyamine, and the activities of key enzymes in putrescine synthesis were increased with the exogenous EBR of 0.1 mgL–1. Moreover, exogenous EBR could effectively enhance the contents of hyoscyamine and scopolamine by increasing the relative expression levels of key enzyme genesandin TAs pathway. In conclusion, the appropriate concentration of exogenous EBR could effectively relieve the damage of NaCl stress to the physiological metabolism in, andthe exogenous EBR could improve NaCl tolerance ofseedlings by increasing nitrogen metabolism and promoting the production and accumulation of TAs.

L.; NaCl stress; nitrogen metabolism; secondary metabolism

10.3724/SP.J.1006.2021.04238

本研究由國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30500041)資助。

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (30500041).

吳能表, E-mail: wunb@swu.edu.cn

E-mail: 490992699@qq.com

2020-11-01;

2021-01-13;

2021-02-25.

URL: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20210225.1312.008.html