郭曉晗，程顯隆，柳溫曦，李明華，魏鋒，馬雙成

中國(guó)食品藥品檢定研究院，北京 100050

《中華人民共和國(guó)藥典》(以下簡(jiǎn)稱《中國(guó)藥典》)2020年版一部規(guī)定鹿茸為鹿科動(dòng)物梅花鹿CervusnipponTemminck或馬鹿C.elaphusLinnaeus的雄鹿未骨化密生茸毛的幼角[1]，前者稱為花鹿茸，后者稱為馬鹿茸。此外，白唇鹿C.albirostrisPrzewalski和水鹿C.unicolorKerr茸在四川、甘肅地方標(biāo)準(zhǔn)中也可作為鹿茸藥用。據(jù)市場(chǎng)調(diào)研，目前市場(chǎng)上常以馴鹿RangifertarandusLinnaeus茸作為鹿茸銷售，偽品、劣品和混淆品的出現(xiàn)導(dǎo)致了鹿茸市場(chǎng)的混亂。作為傳統(tǒng)名貴中藥材，鹿茸質(zhì)量控制方法雖多，但并不完善，面對(duì)鹿茸摻偽造假及市場(chǎng)的混亂問題，建立一套準(zhǔn)確性好、靈敏度高、專屬性強(qiáng)的鹿茸真?zhèn)舞b別體系尤為重要。

近年來研究表明，鹿茸中蛋白質(zhì)的含量隨生長(zhǎng)周期呈較為規(guī)律的變化，即蛋白質(zhì)含量從鹿茸頂部到基部逐漸減少[2]，其含量及種類影響著鹿茸品質(zhì)的高低，有望成為鹿茸質(zhì)量評(píng)價(jià)體系中重要的指標(biāo)成分。目前以蛋白質(zhì)或氨基酸為分析對(duì)象的動(dòng)物藥檢測(cè)方法主要有薄層色譜法、凱氏定氮法和分光光度法等?；谀z原蛋白的同源性，不同動(dòng)物的膠原蛋白具有相似的化學(xué)性質(zhì)[3-4]，因此這些方法難以區(qū)分主要含有膠原蛋白大分子的鹿茸及其混偽品?；谏镞z傳學(xué)特點(diǎn)，雖然同科不同屬的鹿茸蛋白序列接近，但必然也存在氨基酸序列上的差異。液相色譜-質(zhì)譜法(LC-MS)可以針對(duì)蛋白質(zhì)序列進(jìn)行差異性分析，隨著LC-MS在中藥檢驗(yàn)中的應(yīng)用，測(cè)定動(dòng)物藥中蛋白質(zhì)成分的方法逐漸成熟[5-14]。因此，本研究采用蛋白質(zhì)酶切、LC-MS肽段檢測(cè)及數(shù)學(xué)統(tǒng)計(jì)等方法，找出不同品種鹿茸的特征肽段，建立可用于鹿茸及其混偽品的專屬性鑒別方法，為鹿茸及相關(guān)制劑的質(zhì)量控制提供參考。

1 材料

1.1 試藥

花鹿茸40批(編號(hào)為HLR-1～HLR-40)、馬鹿茸10批(編號(hào)為MLR-1～MLR-10)收集于吉林東豐藥業(yè)有限公司鹿茸養(yǎng)殖基地，馴鹿茸10批(XLR-1～XLR-10)收集于吉林西豐藥材市場(chǎng)。60批樣品均由遼寧省食品藥品檢驗(yàn)研究院中藥室王維寧主任藥師鑒定，分別為梅花鹿CervusnipponTemminck、馬鹿C.elaphusLinnaeus或馴鹿RangifertarandusLinnaeus的雄鹿未骨化密生茸毛的幼角。

胰蛋白酶、亮氨酸腦啡肽、甲酸(Sigma-Aldrich公司)；乙腈(Thermo Fisher Scientic公司)；碳酸氫銨(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；水為Milli-Q純水。

1.2 儀器

Synapt G2-S型Q-TOF MS液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，XevoTM TQ-S MS型液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國(guó)Waters公司)；FED-115型熱循環(huán)干燥箱(德國(guó)Binder公司)；DH-101-2BS型恒溫恒濕培養(yǎng)箱(天津市中環(huán)實(shí)驗(yàn)電爐有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 馴鹿茸專屬性特征肽段的研究

2.1.1色譜條件 色譜柱為Waters ACQUITYTM UPLC BEH C18(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；柱溫為40 ℃；進(jìn)樣量為5 μL；流動(dòng)相為0.1%甲酸水溶液(A)-乙腈(B)，梯度洗脫(0～25 min，95%～80%A；25～40 min，80%～50%A)；流速為0.3 mL·min-1。

2.1.2質(zhì)譜條件 選用電噴霧離子源，正離子模式；離子源溫度為120 ℃；毛細(xì)管電壓為3 kV，錐孔電壓為20 V；去溶劑溫度為450 ℃，去溶劑氣體流速為600 L·h-1；全信息串聯(lián)質(zhì)譜(MSE)連續(xù)方式采集數(shù)據(jù)，掃描質(zhì)量數(shù)m/z50～1200，掃描時(shí)間為0.2 s；低碰撞能量為8 V，梯度碰撞能量為10～40 V；碰撞氣體為高純氬氣。

2.1.3溶液制備 胰蛋白酶溶液：取適量胰蛋白酶，加1%碳酸氫銨溶液溶解，制成質(zhì)量濃度為1 mg·mL-1的溶液。

空白溶液：取1%碳酸氫銨溶液，濾過，取續(xù)濾液100 μL，置微量進(jìn)樣瓶中，加胰蛋白酶溶液20 μL，充分混勻，于恒溫恒濕箱中酶解12 h，即得。

供試品溶液：取供試品粉末約0.3 g于安瓿瓶中，加水10 mL，熔封，于烘箱中120 ℃加熱12 h，取出，趁熱濾過，蒸干，用1%碳酸氫銨溶液溶解并定容至10 mL，用微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液100 μL，置微量進(jìn)樣瓶中，加胰蛋白酶溶液20 μL，充分混勻，于恒溫恒濕箱中酶解12 h，即得。

2.1.4數(shù)據(jù)采集 利用UPLC-Q-TOF MS系統(tǒng)，在2.1.1～2.1.2項(xiàng)下色譜和質(zhì)譜條件下，分別對(duì)空白和供試品溶液進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，得到3種鹿茸樣品的總離子流圖，見圖1。以馴鹿茸樣品(XLR-1)為例，選擇提取在整個(gè)數(shù)據(jù)采集過程中保留時(shí)間均勻分布的8個(gè)共有色譜峰進(jìn)行方法學(xué)考察，分別為m/z739.839 6、m/z583.813 5、m/z790.885 7、m/z575.820 3、m/z793.885 0、m/z780.907 8、m/z931.788 9、m/z711.374 6。相應(yīng)的提取離子色譜圖見圖2。

注：A.花鹿茸(HLR-1)；B.馬鹿茸(MLR-1)；C.馴鹿茸(XLR-1)。圖1 花鹿茸、馬鹿茸、馴鹿茸酶解肽的總離子流圖

圖2 馴鹿茸樣品(XLR-1)8個(gè)色譜峰的提取離子流色譜圖

2.1.5精密度試驗(yàn) 取供試品溶液，按照2.1.1～2.1.2項(xiàng)下色譜和質(zhì)譜條件，重復(fù)進(jìn)樣6次，選取上述8個(gè)單一色譜峰進(jìn)行提取，測(cè)得8個(gè)色譜峰保留時(shí)間和精確質(zhì)量數(shù)的RSD均小于1%。

2.1.6重復(fù)性試驗(yàn) 取同一份樣品6次，每次約0.3 g，精密稱定，制備供試品溶液6份，按照2.1.1～2.1.2項(xiàng)下色譜和質(zhì)譜條件分別進(jìn)樣，選取上述8個(gè)單一色譜峰進(jìn)行提取，測(cè)得8個(gè)色譜峰保留時(shí)間和精確質(zhì)量數(shù)的RSD均小于1%，結(jié)果表明，重復(fù)性較好。

2.1.7穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品溶液，按照2.1.1～2.1.2項(xiàng)下色譜和質(zhì)譜條件，分別在0、2、4、6、8、10 h測(cè)定。選取上述8個(gè)單一色譜峰進(jìn)行提取，測(cè)得8個(gè)色譜峰的保留時(shí)間和精確質(zhì)量數(shù)基本保持一致，RSD均小于1%，說明樣品在10 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.8數(shù)據(jù)分析 利用Waters統(tǒng)計(jì)分析軟件，設(shè)定保留時(shí)間為1～40 min，質(zhì)譜允許偏差為0.05 amu，保留時(shí)間偏差設(shè)為0.2 min，設(shè)定適宜的噪音消除水平和強(qiáng)度閾值。先將60批樣品的液質(zhì)圖譜數(shù)據(jù)降維，轉(zhuǎn)換成數(shù)據(jù)對(duì)(精確質(zhì)量-保留時(shí)間，EMRT)；并進(jìn)行主成分分析，結(jié)果見圖3。結(jié)果顯示，馴鹿茸可與花鹿茸、馬鹿茸進(jìn)行良好的區(qū)分。將花鹿茸和馬鹿茸合并為一組，結(jié)合正交偏最小二乘法-判別分析對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整合分析，得到馴鹿茸與正品鹿茸的數(shù)據(jù)分析結(jié)果散點(diǎn)圖，見圖4。在輪廓呈S形的散點(diǎn)圖(S-plot)中，曲線兩端的EMRT數(shù)據(jù)對(duì)代表了來自2個(gè)樣品組的可信度高的特征離子。

注：HLR.花鹿茸；MLR.馬鹿茸；XLR.馴鹿茸。圖3 馴鹿茸與花鹿茸、馬鹿茸的主成分分析

圖4 馴鹿茸與花鹿茸、馬鹿茸比較的S-plot散點(diǎn)圖

經(jīng)過數(shù)據(jù)分析軟件對(duì)質(zhì)譜數(shù)據(jù)的分析、挖掘與篩選，并在總離子流圖中初步驗(yàn)證的情況下，最終尋找到2個(gè)馴鹿茸專屬性較好的離子，分別為m/z575.820 3(9.48 min，雙電荷)、m/z583.813 5(8.05 min，雙電荷)。這2個(gè)特征離子在馴鹿茸與花鹿茸、馬鹿茸中的相對(duì)離子強(qiáng)度分布見圖5。為確認(rèn)這2個(gè)離子的靈敏度及準(zhǔn)確性，利用超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜(UPLC-QQQ/MS)，分別選擇m/z575.8和m/z583.8為母離子，優(yōu)化其傳輸電壓和碰撞能量，結(jié)合選擇離子模式和子離子模式，分別確定了2個(gè)子離子，從而形成4組離子對(duì)，分別是8.38 min：m/z583.8→m/z455.9、m/z583.8→m/z910.7；9.80 min：m/z575.8→m/z447.9、m/z575.8→m/z894.8。

注：A.m/z 575.820 3；B.m/z 583.813 5。圖5 2個(gè)特征離子m/z 575.820 3、m/z 583.813 5在3種鹿茸樣品中的相對(duì)強(qiáng)度分布

2.1.9馴鹿茸專屬性特征肽段的驗(yàn)證 在優(yōu)化好的傳輸電壓和碰撞能量下，基原準(zhǔn)確的花鹿茸、馬鹿茸、馴鹿茸樣品溶液及空白溶液在多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式下測(cè)試，結(jié)果顯示，這4組特征離子對(duì)均只在馴鹿茸樣品中檢測(cè)到，說明這4組特征離子對(duì)具有專屬性，可用于正品鹿茸(梅花鹿、馬鹿)樣品中混有偽品鹿茸(馴鹿)的專屬性鑒別。

2.2 鹿茸特征圖譜的研究

根據(jù)對(duì)正品鹿茸的酶解肽段的數(shù)據(jù)分析，以總離子流色譜圖中兩者共有、保留時(shí)間合適、響應(yīng)高為原則，經(jīng)過比較，確定4個(gè)離子為候選母離子，見表1。結(jié)合UPLC-QQQ/MS，采用ESI+模式，在適宜的質(zhì)譜參數(shù)條件下，優(yōu)化4個(gè)離子的傳輸電壓和碰撞能量，分別篩選響應(yīng)較高的2個(gè)離子為子離子，形成8組特征離子對(duì)，相應(yīng)信息見表1。從而在MRM下，對(duì)40批花鹿茸、10批馬鹿茸進(jìn)行測(cè)定，以特征肽段為分析指標(biāo)，建立了鹿茸藥材的特征圖譜，見圖6。

表1 鹿茸特征肽段離子的相關(guān)信息

注：A.花鹿茸；B.馬鹿茸；1.m/z 730.5(雙電荷)→594.1，1 090.4；2.m/z 634.4(雙電荷)→549.2，731.2；3.m/z 793.9(雙電荷)→733.3，1 215.4；4.m/z 780.9(雙電荷)→608.7，991.5。圖6 鹿茸的特征圖譜

3 總結(jié)與討論

動(dòng)物藥材是中藥的重要組成部分，被認(rèn)為具有活性強(qiáng)、潛力大和應(yīng)用廣等優(yōu)勢(shì)。但是，與植物類中藥相比，動(dòng)物藥材在鑒別和質(zhì)量評(píng)價(jià)方面的研究發(fā)展緩慢、體系薄弱，特別是缺乏專屬的鑒定指標(biāo)與質(zhì)量評(píng)價(jià)手段。

目前鹿茸的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)相對(duì)簡(jiǎn)單，只有鑒別項(xiàng)，且檢測(cè)指標(biāo)氨基酸成分缺乏專屬性，無法對(duì)摻假的鹿茸品種進(jìn)行鑒別；另外，多種成藥使用鹿茸為原料，如“人參鹿茸丸”“鹿茸口服液”“鹿茸精注射液”等，由于質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中無專屬性控制項(xiàng)目，導(dǎo)致含鹿茸原料的成藥質(zhì)量更加難以控制。

本研究將蛋白質(zhì)酶切技術(shù)、液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)及生物信息統(tǒng)計(jì)模型結(jié)合統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法應(yīng)用于鹿茸特征多肽的分析，成功找到偽品鹿茸(馴鹿)的2個(gè)特征肽段，可用于正品鹿茸(梅花鹿、馬鹿)中混有偽品鹿茸(馴鹿)樣品的智能鑒別，該方法專屬性好，很大程度上改善了目前鹿茸的質(zhì)量評(píng)價(jià)方法。此法不僅可用于鹿茸藥材的真?zhèn)舞b別，對(duì)于含鹿茸的成藥或者動(dòng)物藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)方法的開發(fā)也具有借鑒意義。梅花鹿與馬鹿同為鹿科鹿屬，兩者物種親緣關(guān)系較近，均為《中國(guó)藥典》2020年版規(guī)定的“鹿茸”的基原。主成分分析結(jié)果表明，花鹿茸與馬鹿茸不能進(jìn)行有效區(qū)分。本研究雖未找到花鹿茸和馬鹿茸的專屬性特征肽段，但是基于特征肽段建立的特征圖譜也具有一定的專屬性，可用于鹿茸的定性鑒別，此外，特征肽段氨基酸序列的解析和確證是后期建立可用于定量測(cè)定的LC-MS/MS的基礎(chǔ)，從而將偽品鹿茸的專屬性特征肽段、鹿茸的特征圖譜、以特征肽段為含量測(cè)定指標(biāo)的LC-MS/MS統(tǒng)一形成鹿茸特征肽智能識(shí)別信息庫，為鹿茸藥材及相關(guān)制劑的質(zhì)量控制和評(píng)價(jià)提供參考。