孫禮芹，李光霞，王 瑞，李醫(yī)明，錢 菲，賈 琦*

1.上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，上海 201203

2.上海中醫(yī)藥大學(xué)交叉科學(xué)研究院，上海 201203

炎性反應(yīng)是機(jī)體應(yīng)對(duì)病原體、感染或組織損傷的保護(hù)性反應(yīng)，但失控的炎性反應(yīng)會(huì)對(duì)機(jī)體造成損傷[1]，因此控制體內(nèi)炎性反應(yīng)的動(dòng)態(tài)平衡至關(guān)重要。巨噬細(xì)胞及其釋放的炎性介質(zhì)在炎性反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中扮演著重要的角色[2]。除具有吞噬功能外，巨噬細(xì)胞還可以在脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）等刺激物的誘導(dǎo)下被激活，從而誘導(dǎo)合成并釋放大量腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor，TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、一氧化氮（nitric oxide，NO）等炎性介質(zhì)，進(jìn)而引起炎性反應(yīng)[3-5]。因此，抑制巨噬細(xì)胞的過(guò)度活化對(duì)抑制炎性反應(yīng)具有重要意義。溪黃草Rabdosia serra(Maxim.) Hara 為唇形科香茶菜屬植物，別名熊膽草、風(fēng)血草、黃汁草等，具有清熱利濕、退黃、涼血散瘀的功效[6-7]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，溪黃草具有抗炎、抗腫瘤、抑菌、增強(qiáng)免疫及保肝利膽等作用。溪黃草甲素是溪黃草中重要的二萜類成分之一，目前僅發(fā)現(xiàn)其對(duì)人宮頸癌細(xì)胞HeLa 的增殖具有顯著的抑制作用[8]，但對(duì)其抗炎作用方面的研究鮮有報(bào)道。本研究采用LPS 誘導(dǎo)小鼠建立急性炎性反應(yīng)模型，并誘導(dǎo)小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7 細(xì)胞建立體外炎性細(xì)胞模型，探究溪黃草甲素的抗炎作用及機(jī)制，為臨床抗炎藥物的開(kāi)發(fā)提供依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物

SPF 級(jí)雄性BALB/c 小鼠45 只，6 周齡，體質(zhì)量20～22 g，購(gòu)自浙江維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（浙）2020-0002。動(dòng)物飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)樓，溫度20～26 ℃、相對(duì)濕度40%～60%，光照明暗交替各12 h，自由進(jìn)食飲水。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)PZSHUTCM200904008）。

1.2 細(xì)胞

RAW264.7 細(xì)胞為本課題組保存。

1.3 藥品與試劑

溪黃草甲素（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）為本課題組自制；DMEM 高糖培養(yǎng)基（批號(hào)8120449）購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司；胎牛血清（批號(hào)17M483）、LPS（批號(hào) 078M4039V）、二甲基亞砜（DMSO，批號(hào)RNBH5492）購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司；XTT 試劑盒（批號(hào)32141000）購(gòu)自德國(guó)Roche 公司；TNF-α ELISA試劑盒（批號(hào)227846-005）、IL-6 ELISA 試劑盒（批號(hào)234277-003）購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；蛋白酶抑制劑（批號(hào)410064）、磷酸酶抑制劑（批號(hào)510033）購(gòu)自美國(guó)Selleck 公司；RIPA 裂解液、蛋白酶抑制劑PMSF、細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞質(zhì)蛋白抽提試劑（批號(hào)020617170522）、BCA 蛋白定量試劑盒（批號(hào)080919190917）購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）抗體、c-Jun 氨基端激酶（c-JunN-terminal kinase，JNK）抗體、磷酸化JNK（p-JNK）抗體、細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶 1/2（extracellular regulated protein kinase 1/2，ERK1/2）抗體、p-ERK1/2 抗體、p38 抗體、p-p38 抗體、p65抗體、Janus 酪氨酸蛋白激酶2（Janus kinase 2，JAK2）抗體、p-JAK2 抗體、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子與轉(zhuǎn)錄激活子蛋白 3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）抗體、p-STAT3 抗體、核因子-κB 抑制蛋白α（inhibitor nuclear factor-κB α，IκBα）抗體、p-IκBα 抗體購(gòu)自美國(guó)CST 公司；小鼠源重組IL-6 、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體（批號(hào)DJ18）、Histone H3 抗體（批號(hào)A25J）、HRP 標(biāo)記的山羊抗兔IgE 抗體（批號(hào)AS007）、HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgE 抗體（批號(hào)AS006）購(gòu)自愛(ài)必信生物科技有限公司；ECL 發(fā)光液（批號(hào)1916102）購(gòu)自美國(guó)Millpore 公司。

1.4 儀器

2 方法

2.1 造模、分組與給藥

BALB/c 小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組及溪黃草甲素低、高劑量（50、100 mg/kg）[9-10]組和地塞米松（5 mg/kg）組，每組9 只。以0.5%羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）作為助溶劑并進(jìn)行研磨，將溪黃草甲素配制成質(zhì)量濃度為2.5、5.0 mg/mL 的混懸液，將地塞米松配制成質(zhì)量濃度為0.25 mg/mL 的混懸液。各給藥組ig 相應(yīng)藥物（20 mL/kg），對(duì)照組和模型組ig 0.5% CMC-Na，1 次/d，連續(xù)2 d。LPS溶于0.9%氯化鈉溶液配制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的溶液，末次給藥1 h 后，模型組和各給藥組ip LPS（10 mL/kg）刺激6 h 建立急性炎性小鼠模型，對(duì)照組ip 等體積0.9%氯化鈉溶液。

2.2 溪黃草甲素對(duì)LPS 誘導(dǎo)的急性炎性小鼠模型血清中TNF-α 和IL-6 水平的影響

各組小鼠眼眶取血后，ip 戊巴比妥鈉處死，分離并得到血清，按ELISA 試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定血清中TNF-α 和IL-6 水平。

2.3 細(xì)胞培養(yǎng)

RAW264.7細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到50%時(shí)，采用一次性細(xì)胞刮刀進(jìn)行脫壁并傳代，待細(xì)胞透明、邊界清晰后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.4 溪黃草甲素對(duì)RAW264.7 細(xì)胞存活率的影響

RAW264.7 細(xì)胞以2.5×105/mL 接種于96 孔板中，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。設(shè)置對(duì)照組、溪黃草甲素（0.312 5、0.625 0、1.250 0、2.500 0、5.000 0 μmol/L）組，溪黃草甲素溶于DMSO，配制成25 mmol/L 的母液，使用時(shí)以培養(yǎng)基稀釋至相應(yīng)濃度。各給藥組加入相應(yīng)藥物，對(duì)照組加入不含藥物的培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h；每孔加入50 μL XTT，培養(yǎng)4 h，振蕩30 s，采用酶標(biāo)儀測(cè)定492、690 nm 處的吸光度（A）值，計(jì)算細(xì)胞存活率。

2.5 溪黃草甲素對(duì)LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞上清液中NO 水平的影響

RAW264.7 細(xì)胞以5×105/mL 接種于96 孔板中，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。設(shè)置對(duì)照組、模型組、溪黃草甲素（0.312 5、0.625 0、1.250 0、2.500 0、5.000 0 μmol/L）組。各給藥組加入溪黃草甲素預(yù)處理30 min，模型組和各給藥組再加入LPS（0.5 μg/mL）刺激24 h，對(duì)照組加入不含藥物的培養(yǎng)基。采用Griess 法檢測(cè)細(xì)胞上清液中NO 水平。

2.6 溪黃草甲素對(duì)LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞iNOS 蛋白表達(dá)的影響

RAW264.7 細(xì)胞以5×105/mL 接種于100 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。設(shè)置對(duì)照組、模型組、溪黃草甲素（1.25、2.50、5.00 μmol/L）組。按“2.5”項(xiàng)下方法進(jìn)行處理，收集細(xì)胞，加入RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，采用BCA 蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)量濃度，于95 ℃水浴加熱10 min 使蛋白變性。蛋白樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF 膜，加入5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，分別加入iNOS、GAPDH 抗體，4 ℃孵育過(guò)夜；TBST 洗滌5 次，5 min/次，加入HRP 標(biāo)記的山羊抗兔IgE 抗體，室溫孵育1 h，TBST 洗滌后，加入ECL 發(fā)光液顯影，采用Image J 分析條帶灰度值。

2.7 溪黃草甲素對(duì)LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞上清液中TNF-α 和IL-6 水平的影響

RAW264.7 細(xì)胞以5×105/mL 接種于96 孔板中，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。按“2.6”項(xiàng)下方法進(jìn)行分組和處理，收集細(xì)胞上清液，按試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定細(xì)胞上清液中TNF-α 和IL-6 水平。

2.8 溪黃草甲素對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞JAK2、p-JAK2、STAT3 和p-STAT3 蛋白表達(dá)的影響

RAW264.7 細(xì)胞以5×105/mL 接種于100 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。按“2.6”項(xiàng)下方法進(jìn)行分組，各給藥組加入溪黃草甲素預(yù)處理30 min，模型組和各給藥組再加入LPS（0.5 μg/mL）刺激4 h，對(duì)照組加入不含藥物的培養(yǎng)基。收集細(xì)胞，按“2.6”項(xiàng)下方法檢測(cè)細(xì)胞JAK2、p-JAK2、STAT3和p-STAT3 蛋白表達(dá)情況。

做好基建工程項(xiàng)目檔案資料管理工作，可以為工程的各環(huán)節(jié)提供真實(shí)可靠數(shù)據(jù)，使工程項(xiàng)目順利完成。在開(kāi)展基建工程項(xiàng)目中，對(duì)檔案資料進(jìn)行科學(xué)化管理和監(jiān)控，做好基建檔案管理是一項(xiàng)必不可少的工作。

2.9 溪黃草甲素對(duì)IL-6 誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞STAT3 和p-STAT3 蛋白表達(dá)的影響

RAW264.7 細(xì)胞以5×105/mL 接種于100 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。按“2.6”項(xiàng)下方法進(jìn)行分組，各給藥組加入溪黃草甲素預(yù)處理30 min，模型組和各給藥組再加入IL-6（3 ng/mL）刺激30 min，對(duì)照組加入不含藥物的培養(yǎng)基。收集細(xì)胞，按“2.6”項(xiàng)下方法檢測(cè)細(xì)胞STAT3 和p-STAT3蛋白表達(dá)情況。

2.10 溪黃草甲素對(duì)LPS 誘導(dǎo)RAW264.7 細(xì)胞不同時(shí)間后的上清液中IL-6 水平的影響

RAW264.7 細(xì)胞以5×105/mL 接種于96 孔板中，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。設(shè)置模型組和溪黃草甲素（5 μmol/L）組，給藥組加入溪黃草甲素預(yù)處理30 min，模型組和給藥組再加入LPS（0.5 μg/mL）分別刺激1、2、3、4、6、8、12、16、24 h，收集細(xì)胞上清液，按ELISA 試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞上清液中IL-6 水平。

2.11 溪黃草甲素對(duì)LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞NF-κB 與MAPK 信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

RAW264.7 細(xì)胞以5×105/mL 接種于100 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。按“2.6”項(xiàng)下方法進(jìn)行分組，各給藥組加入溪黃草甲素預(yù)處理30 min，模型組和各給藥組再加入LPS（0.5 μg/mL）刺激30 min，對(duì)照組加入不含藥物的培養(yǎng)基。收集細(xì)胞，加入RIPA 裂解液提取細(xì)胞總蛋白，或采用細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞質(zhì)蛋白抽提試劑提取細(xì)胞核與胞質(zhì)蛋白，按“2.6”項(xiàng)下方法檢測(cè)細(xì)胞p-IκBα、p65、p-JNK、p-ERK1/2、p-p38 蛋白表達(dá)情況。

2.12 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)以±s表示，使用GraphPad Prism 6.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，采用單因素方差分析和t檢驗(yàn)進(jìn)行差異比較。

3 結(jié)果

3.1 溪黃草甲素對(duì)LPS 誘導(dǎo)的急性炎性小鼠模型血清中TNF-α 和IL-6 水平的影響

如圖1 所示，與對(duì)照組比較，模型組小鼠血清中TNF-α 和IL-6 水平顯著升高（P＜0.001）；與模型組比較，各給藥組血清中TNF-α 水平顯著降低（P＜0.05、0.001），溪黃草甲素（100 mg/kg）組和地塞米松組血清中IL-6 水平顯著降低（P＜0.01、0.001），表明溪黃草甲素對(duì)LPS 誘導(dǎo)的小鼠急性炎性反應(yīng)具有抑制作用。

圖1 溪黃草甲素對(duì)LPS 誘導(dǎo)的急性炎性小鼠模型血清中TNF-α 和IL-6 水平的影響 ( ± s, n = 9)Fig.1 Effect of rabdoserrin A on TNF-α and IL-6 levels in serum of acute inflammation mice model induced by LPS ( ± s, n = 9)

3.2 溪黃草甲素對(duì)RAW264.7 細(xì)胞存活率的影響

如圖2 所示，與對(duì)照組比較，各劑量溪黃草甲素對(duì)RAW264.7 細(xì)胞存活率均無(wú)顯著影響。

3.3 溪黃草甲素對(duì)LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞上清液中NO 水平的影響

如圖3 所示，與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞上清液中NO 水平顯著升高（P＜0.001）；與模型組比較，溪黃草甲素（0.625 0、1.250 0、2.500 0、5.000 0 μmol/L）組細(xì)胞上清液中NO 水平顯著降低（P＜0.05、0.001），呈劑量相關(guān)性，其半數(shù)抑制濃度（50% concentration of inhibition，IC50）值為2.68 μmol/L。 因此，選取1.25、2.50、5.00 μmol/L 3 個(gè)濃度展開(kāi)后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖 2 溪黃草甲素對(duì) RAW264.7 細(xì)胞存活率的影響 ( ± s , n=3)Fig.2 Effect of rabdoserrin A on survival rate of RAW264.7 cells ( ± s , n=3)

圖3 溪黃草甲素對(duì)LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞上清液中NO 水平的影響 ( ± s , n=3)Fig.3 Effect of rabdoserrin A on NO level in supernatant of RAW264.7 cells induced by LPS ( ± s , n=3)

3.4 溪黃草甲素對(duì)LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞iNOS 蛋白表達(dá)的影響

如圖4 所示，與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞iNOS蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.001）；與模型組比較，溪黃草甲素（2.50、5.00 μmol/L）組細(xì)胞iNOS 蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05、0.01）。

圖4 溪黃草甲素對(duì)LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞iNOS 蛋白表達(dá)的影響 ( ± s , n=3)Fig.4 Effect of rabdoserrin A on iNOS expression of RAW264.7 cells induced by LPS ( ± s , n=3)

3.5 溪黃草甲素對(duì)LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞上清液中TNF-α 和IL-6 水平的影響

如圖5 所示，與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞上清液中TNF-α 和IL-6 水平顯著升高（P＜0.001）；與模型組比較，各劑量溪黃草甲素組上清液中IL-6 水平顯著降低（P＜0.001），溪黃草甲素（2.50、5.00 μmol/L）組上清液中TNF-α 水平顯著降低（P＜0.05、 0.01），且呈劑量相關(guān)性，表明溪黃草甲素能夠抑制LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞的炎性反應(yīng)。

圖5 溪黃草甲素對(duì)LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞上清液中TNF-α 和IL-6 水平的影響 ( ± s , n=3)Fig.5 Effect of rabdoserrin A on TNF-α and IL-6 levels of RAW264.7 cells induced by LPS ( ± s , n=3)

3.6 溪黃草甲素對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞JAK2、p-JAK2、STAT3 和p-STAT3 蛋白表達(dá)的影響

如圖6 所示，與對(duì)照組比較，模型組p-JAK2、p-STAT3 蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.01、0.001）；與模型組比較，各劑量溪黃草甲素組p-STAT3 蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05、0.01、0.001），溪黃草甲素（2.50、5.00 μmol/L）組p-JAK2蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05、0.01），且呈劑量相關(guān)性。

圖6 溪黃草甲素對(duì)LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞JAK2、p-JAK2、STAT3 和p-STAT3 蛋白表達(dá)的影響 ( ± s , n=3)Fig.6 Effect of rabdoserrin A on expressions of JAK2, p-JAK2, STAT3 and p-STAT3 of RAW264.7 cells induced by LPS ( ± s , n=3)

3.7 溪黃草甲素對(duì)IL-6 誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞STAT3 和p-STAT3 蛋白表達(dá)的影響

JAK2/STAT3 的激活可以促進(jìn)IL-6 的產(chǎn)生，IL-6能夠與胞膜上的受體結(jié)合，進(jìn)一步激活JAK2/ STAT3 信號(hào)通路。如圖7 所示，與對(duì)照組比較，模型組p-STAT3 蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.001）；與模型組比較，溪黃草甲素（2.50、5.00 μmol/L）組p-STAT3 蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.001），且呈劑量相關(guān)性。

圖7 溪黃草甲素對(duì)IL-6 誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞STAT3 和p-STAT3 蛋白表達(dá)的影響 ( ± s , n=3)Fig.7 Effect of rabdoserrin A on expressions of STAT3 and p-STAT3 of RAW264.7 cells induced by IL-6 ( ± s , n=3)

3.8 溪黃草甲素對(duì)LPS 誘導(dǎo)RAW264.7 細(xì)胞不同時(shí)間后的上清液中IL-6 水平的影響

如圖8 所示，LPS 誘導(dǎo)RAW264.7 細(xì)胞4 h 時(shí)，IL-6 未顯著釋放，而溪黃草甲素已經(jīng)能夠顯著抑制p-JAK2、p-STAT3 蛋白表達(dá)水平，表明LPS 誘導(dǎo)RAW264.7 細(xì)胞4 h，溪黃草甲素對(duì)JAK2/STAT3 的下調(diào)與IL-6 分泌無(wú)關(guān)。

圖8 溪黃草甲素對(duì)LPS 誘導(dǎo)RAW264.7 細(xì)胞不同時(shí)間后的上清液中IL-6 水平的影響 ( ± s , n=3)Fig.8 Effect of rabdoserrin A on IL-6 level of RAW264.7 cells induced by LPS for different time ( ± s , n=3)

3.9 溪黃草甲素對(duì)LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞NF-κB 與MAPK 信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

如圖9、10 所示，LPS 誘導(dǎo)RAW264.7 細(xì)胞30 min 時(shí)，與對(duì)照組比較，模型組p-IκBα、胞核p65、p-JNK、p-ERK1/2、p-p38 蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.001）；與模型組比較，各給藥組對(duì)NF-κB 與MAPK 信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平無(wú)明顯影響。

圖9 溪黃草甲素對(duì)LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞NF-κB 信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 ( ± s , n=3)Fig.9 Effect of rabdoserrin A on NF-κB signaling pathway related protein expressions of RAW264.7 cells induced by LPS( ± s , n=3)

4 討論

巨噬細(xì)胞在炎性反應(yīng)的發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用[11]。LPS 可以促使巨噬細(xì)胞分泌NO、TNF-α、IL-6等多種促炎介質(zhì)，引起炎性反應(yīng)的發(fā)生與發(fā)展[12]。本研究結(jié)果顯示，0.312 5、0.625 0、1.250 0、2.500 0、5.000 0 μmol/L 溪黃草甲素對(duì)RAW264.7 細(xì)胞的活力無(wú)明顯抑制作用，溪黃草甲素對(duì)LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞上清液中NO 水平的IC50值為2.68 μmol/L。因此，后續(xù)選擇1.25、2.50、5.00 μmol/L進(jìn)行研究。溪黃草甲素顯著抑制 LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞中NO 合成關(guān)鍵酶（iNOS）[13]蛋白表達(dá)水平。TNF-α 和IL-6 是2 種重要的促炎細(xì)胞因子，LPS 可以誘導(dǎo)其大量分泌，而溪黃草甲素可以顯著抑制二者的產(chǎn)生，在LPS 誘導(dǎo)的急性炎性小鼠 體內(nèi)，溪黃草甲素也具有同樣的抑制作用。以上結(jié)果表明溪黃草甲素具有良好的抗炎作用，提示溪黃草甲素是溪黃草發(fā)揮抗炎作用的物質(zhì)基礎(chǔ)之一。

圖10 溪黃草甲素對(duì)LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞MAPK 信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 ( ± s , n=3)Fig.10 Effect of rabdoserrin A on MAPK signaling pathway related protein expressions of RAW264.7 cells induced by LPS ( ± s , n=3)

STAT3 是一種關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，在炎性反應(yīng)中發(fā)揮著重要的作用[14]。JAK2/STAT3 信號(hào)的激活由IL-6 識(shí)別細(xì)胞膜表面受體并與之結(jié)合，誘導(dǎo)gp130形成同源二聚體，進(jìn)一步激活JAK，激活后的JAK會(huì)使gp130 胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域上的酪氨酸殘基磷酸化，從而招募STAT3，這種激酶級(jí)聯(lián)使STAT3 磷酸化后形成二聚體并轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，進(jìn)而調(diào)控炎性細(xì)胞因子的表達(dá)，促進(jìn)IL-6 等炎性因子分泌至胞外[15]。溪黃草甲素顯著抑制RAW264.7 細(xì)胞p-JAK2、p-STAT3蛋白表達(dá)水平，表明溪黃草甲素可能通過(guò)JAK2/ STAT3 途徑發(fā)揮抗炎作用。IL-6 可以介導(dǎo)JAK2/ STAT3 的激活[16-17]，本研究采用IL-6 作為刺激劑對(duì)RAW264.7 細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)，發(fā)現(xiàn)溪黃草甲素顯著抑制IL-6 誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞中p-STAT3 蛋白表達(dá)水平。STAT3 的磷酸化可以調(diào)控LPS 誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞中IL-6 的產(chǎn)生[18]，而IL-6 又可以通過(guò)gp130/JAK/ STAT 途徑調(diào)節(jié)p-STAT3 蛋白表達(dá)[17]。為了確定溪黃草甲素對(duì)p-STAT3蛋白表達(dá)與IL-6分泌抑制作用的先后關(guān)系，本研究通過(guò)檢測(cè)LPS 刺激RAW264.7細(xì)胞不同時(shí)間的 IL-6 分泌，發(fā)現(xiàn) LPS 刺激RAW264.7 細(xì)胞4 h 時(shí)，IL-6 還未顯著釋放，但此時(shí)溪黃草甲素已經(jīng)顯著抑制p-STAT3 蛋白表達(dá)水平，表明溪黃草甲素通過(guò)抑制JAK2/STAT3/IL-6 信號(hào)通路，從而發(fā)揮抗炎作用。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)溪黃草甲素能夠抑制LPS 誘導(dǎo)的體內(nèi)外炎性反應(yīng)，其作用機(jī)制與抑制JAK2/STAT3 信號(hào)通路有關(guān)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突