陳 方，張鈺玉，龍登瑩，鮮 紅，彭敬東*

（1．貴陽學(xué)院 化學(xué)與材料工程學(xué)院，貴州 貴陽 550005；2．西南大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，重慶 400715）

雷尼替?。≧NTD）和法莫替?。‵MTD）均為H2受體阻滯劑，是抑制胃酸分泌的藥物，具有抑制胃酸和胃蛋白酶活性，通過改善胃粘膜的微循環(huán)促進(jìn)細(xì)胞再生和修復(fù)的作用，主要用于治療胃和十二指腸潰瘍，但大量服用會損傷腎功能、性腺功能和中樞神經(jīng)，對人體健康產(chǎn)生不利影響［1－2］。RNTD和FMTD的半衰期約為2～3 h，主要通過尿液排泄，尿液中的藥物濃度變化幅度大且快，因此研究其在尿液樣品中的測定方法對于臨床用藥和科學(xué)研究具有重要意義［3－4］。RNTD和FMTD的檢測方法包括熒光光譜法［5］、流動注射-抑制化學(xué)發(fā)光法［6］、Gran電位滴定法［7］、表面增強拉曼散射法（SERS）［8］、高效液相色譜法（HPLC）［9］、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（LC－MS）［10］和毛細(xì)管電泳法（CE）［11］。上述方法雖有很好的優(yōu)勢，但實際應(yīng)用仍存在局限，如：HPLC法的選擇性很高，但靈敏度較低；LC－MS和CE方法復(fù)雜且靈敏度不高，因而有必要探索高選擇性、高靈敏度和快速檢測RNTD和FMTD的方法。

目前，共振瑞利散射（RRS）作為一種新穎、高靈敏度的分析方法已被采用。該方法是基于當(dāng)瑞利散射的波長接近分子吸收光譜帶時，由于發(fā)生共振而產(chǎn)生再次散射的過程［12］，具有較高的靈敏度，且分析速度快，已被廣泛用于藥物分析［13－14］、環(huán)境分析［15－16］、無機物［17］及生物大分子分析［18］等領(lǐng)域。但該方法的選擇性較差，易受相同結(jié)構(gòu)物質(zhì)的干擾，可利用HPLC的高選擇性，將HPLC與RRS聯(lián)用得到高選擇性和高靈敏度的分析方法。

本研究發(fā)現(xiàn)在pH 4．6的BR緩沖溶液中RNTD和FMTD能與金屬離子Pd（Ⅱ）螯合形成陽離子，再與染料赤蘚紅（Ery）在靜電引力和疏水作用下形成三元離子締合物，導(dǎo)致整個體系的RRS信號急劇增強?；诖?，將高效液相色譜作為分離裝置，通過柱后衍生系統(tǒng)與共振瑞利散射反應(yīng)裝置聯(lián)用，經(jīng)HPLC分離后的RNTD和FMTD，再與柱后衍生系統(tǒng)引入的探針在反應(yīng)裝置中締合成離子化合物，然后記錄得到RRS信號，從而實現(xiàn)對RNTD和FMTD的分析。該方法成功應(yīng)用于實際樣品的檢測。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

HPLC－RRS聯(lián)用技術(shù)包括HPLC和RRS反應(yīng)裝置。其中高效液相色譜儀包含分離和柱后衍生系統(tǒng)（日本Shimadzu公司）：DGU-20A5R脫氣裝置，兩個LC-20AD泵，RF-20A熒光檢測器。PCX-BT柱后衍生裝置（沈陽天美達(dá)儀器公司），F(xiàn)-2500熒光檢測器（日本Hitachi公司），UV-2450分光光度計（日本Shimadzu公司），PHS-FE20酸度計（上?？茖W(xué)儀器有限公司），Millipore SZ-93自動純水二水蒸餾器（上海圣科儀器設(shè)備有限公司）。

雷尼替丁、法莫替丁標(biāo)準(zhǔn)品和醋酸鈉（阿拉丁化工試劑有限公司），赤蘚紅（麥克林生化科技有限公司），醋酸鈀（Pd（Ac）2，瑞奇斯特集團有限公司），乙腈（色譜純，天津市科密歐公司）。不同pH值的BR緩沖溶液：由0．2 mol/L的NaOH溶液和0．4 mol/L的H3PO4、HAc－H3BO3混合酸按一定比例混合而成。氫氧化鈉（分析純）、硼酸、醋酸均購于重慶川東化工有限公司。實驗用水為二次蒸餾水，各溶液均用0．22μm濾膜過濾。

1.2 溶液制備

分別準(zhǔn)確稱取一定量的RNTD和FMTD標(biāo)準(zhǔn)品用水溶解并定容，配制成1 mg/L的儲備液，于冰箱0～4℃下避光保存；準(zhǔn)確稱取一定量醋酸鈀，用醋酸溶解并配制成2×10-4mol/L的儲備液；準(zhǔn)確稱取一定量赤蘚紅用水配制成4×10-4mol/L的儲備液，避光保存，用水稀釋儲備液得到不同濃度的操作液。

1.3 尿樣采集及前處理

采集服用法莫替丁膠囊志愿者的尿樣，該患者服用法莫替丁膠囊3粒/天，每粒350 mg（269 mg FMTD）。在患者用藥12 h后，收集其尿液。取200μL尿樣加入400μL乙腈，渦旋1 min并以5 000 r/min離心10 min，取上清液轉(zhuǎn)移至離心管中，在真空干燥箱（40℃）中干燥1 h，以除去乙腈。用0．22 μm混合相針式濾器過濾后，待測定。

1.4 HPLC分離及RRS檢測條件

HPLC－RRS聯(lián)用裝置如圖1。柱前分離條件為：以pH 4．5的醋酸－醋酸鈉緩沖溶液與乙腈（90∶10）為流動相等度洗脫，流速為0．5 mL/min，進(jìn)樣量為20μL，使用Kinetex 5μm C18液相色譜柱（250 mm×4．60 mm），柱溫為35℃。柱后衍生條件為：Pd（Ac）2溶液以0．3 mL/min流入三通管1內(nèi)，體系中流動的螯合離子與Ery在三通管2內(nèi)混合，Ery流速為0．2 mL/min。最后流至加熱反應(yīng)管路中，直至締合反應(yīng)完全后進(jìn)入檢測器，F(xiàn)－2500熒光檢測器的檢測波長λex=λem=370 nm，記錄RRS信號。

圖1 HPLC－RRS反應(yīng)裝置示意圖Fig．1 The schematic diagram of HPLC－RRS system

2 結(jié)果與討論

2.1 反應(yīng)機理的探究

分別用等摩爾連續(xù)變化法測定Pd（Ⅱ）與FMTD二元配合物及Pd（Ⅱ）與Ery形成離子化合物的組成比，如圖2所示，該二元配合物Pd（Ⅱ）－FMTD的組成比為1∶1；Pd（Ⅱ）-Ery的結(jié)合比為1∶2，而當(dāng)Pd（Ⅱ）－FMTD二元配合物進(jìn)一步與染料Ery作用形成［Pd（FMTD）］·（Ery）2時，該三元離子締合物的組成比為nFMTD∶nPd（Ⅱ）∶nEry＝1∶1∶2，這與文獻(xiàn)結(jié)果一致［5］。此外，采用分布分?jǐn)?shù)計算法討論了反應(yīng)生成的離子化合物組成形式，因在pH 4．6時，Ery的pKa1＝2．9，pKa2＝3．8，經(jīng)過計算該實驗條件下Ery各型體（H2L、HL-、L2－）的分布系數(shù)分別為0．3%、13．6%、86．1%，Ery主要以Ery－的形式存在。而Ery－形式分子中的1個苯基上有2個π6鍵，與苯基相接的羧基上有1個π2鍵，使得Ery－的羧基處于強大的共軛體系中，帶有極強的電子，更易離解，在實驗條件下二元配合物Pd（Ⅱ）－FMTD可通過靜電引力和疏水作用力形成電中性的［Pd（FMTD）］·（Ery）2三元離子締合物。

圖2 等摩爾連續(xù)變化法測定Pd（Ⅱ）與法莫替丁二元配合物和Pd（Ⅱ）與赤蘚紅形成離子化合物的組成比Fig．2 Composition ratios of Pd（Ⅱ）and FMTD，Pd（Ⅱ）and Ery by molar ratio method

2.2 體系共振瑞利散射信號增強的原因

共振瑞利散射過程是當(dāng)散射光譜帶接近分子紫外吸收光譜帶時，發(fā)生散射后吸收再次散射產(chǎn)生極強的共振瑞利散射光譜。反應(yīng)體系中三元離子締合物［Pd（FMTD）］·（Ery）2的RRS光譜與紫外吸收光譜如圖3所示，比較發(fā)現(xiàn)較強的RRS信號分別位于295 nm和360 nm，以及生成1個很小的散射峰處于610 nm，而該體系最大的吸收光譜信號分別位于335 nm和560 nm，即RRS光譜與吸收光譜非常接近，與最大散射峰相比紅移了40 nm。因此散射信號顯著增強的主要原因是散射光譜接近吸收光譜帶時產(chǎn)生了共振增強效應(yīng)。

圖3 Pd（Ⅱ）－赤蘚紅－法莫替丁的RRS光譜與紫外吸收光譜Fig．3 RRS and UV absorption spectra of the Pd（Ⅱ）－Ery－FMTD

2.3 檢測波長的優(yōu)化

將F-2500熒光檢測器設(shè)置成入射波長等于發(fā)射波長，從220 nm到800 nm進(jìn)行同步掃描，分析不同波長下該體系的RRS信號值。由圖4A可見，F(xiàn)MTD和Ery自身的RRS信號均很弱，F(xiàn)MTD分別與Pd(Ⅱ)、Ery作用時的RRS信號仍較弱。如圖4B所示，金屬離子Pd(Ⅱ)與Ery相互作用時體系的RRS信號很弱，但分別加入藥物RNTD和FMTD后，三元混合反應(yīng)體系的RRS信號顯著增強。實驗考察了不同檢測波長（300～380 nm）對三元混合體系RRS信號的影響，結(jié)果顯示，RNTD和FMTD的RRS信號在檢測波長370 nm處達(dá)到最大（圖4C），因而選擇最佳檢測波長為λex=λem=370 nm。

圖4 FMTD與Pd（Ⅱ）、Ery分別作用的RRS光譜（A），Pd（Ⅱ）－Ery－藥品的RRS光譜（B），以及檢測波長對反應(yīng)體系RRS光譜信號的影響（C）Fig．4 RRS spectra of FMTD with Pd（Ⅱ）and Ery，respectively（A），RRS spectra of Pd（Ⅱ）－Ery－drugs（B）and the effect of detection wavelength on RRS spectra signal（C）

2.4 溶液p H值、反應(yīng)溫度與有機溶劑濃度的優(yōu)化

溶液pH值直接影響整個反應(yīng)體系的RRS信號，因此考察了柱后衍生系統(tǒng)的溶液pH值對Pd（Ⅱ）－Ery－藥品三元體系RRS光譜的影響，以BR緩沖溶液調(diào)節(jié)溶液的pH值在3．5～5．0范圍內(nèi)。結(jié)果表明，當(dāng)pH值為4．6時體系的RRS響應(yīng)值最高，若酸度較低，染料自身會發(fā)生聚集；而酸度較高時，Pd（Ⅱ）與藥物形成的螯合陽離子難以與Ery相互作用，因此確定最佳pH值為4．6。考察了不同的柱后反應(yīng)溫度（20～50℃）對體系RRS信號的影響，發(fā)現(xiàn)當(dāng)反應(yīng)體系處于30℃時RRS信號最強，因此確定柱后反應(yīng)溫度為30℃。HPLC－RRS聯(lián)用裝置中有機相在分離系統(tǒng)不可或缺，而有機溶劑的濃度對體系反應(yīng)物締合作用的影響很大，因而考察了不同含量的乙腈對體系RRS信號的影響。結(jié)果顯示，當(dāng)溶液中乙腈含量為10%時體系的RRS信號最大，因此選擇乙腈含量為10%。

2.5 柱后Ery與Pd（Ac）2濃度的優(yōu)化

HPLC－RRS聯(lián)用技術(shù)的柱后衍生系統(tǒng)以Ery和Pd（Ⅱ）同時作為探針引入反應(yīng)裝置，因此Ery和Pd（Ac）2的濃度對反應(yīng)體系RRS強度的影響至關(guān)重要?？疾炝薊ry濃度在2×10-4～10×10-4mol/L范圍內(nèi)對體系RRS強度的影響，結(jié)果表明，Ery濃度為6×10-4mol/L時，體系的RRS信號值最大且穩(wěn)定。當(dāng)Ery濃度太低時，體系中的三元螯合物反應(yīng)不完全；但Ery濃度過大時，其本身的RRS信號增大，且噪音也迅速增大。進(jìn)一步考察了Pd（Ac）2濃度在0．6×10-4～1．4×10-4mol/L范圍內(nèi)對體系RRS強度的影響，發(fā)現(xiàn)Pd（Ac）2的最佳濃度為1．0×10-4mol/L，此時體系的RRS響應(yīng)最大且穩(wěn)定。

2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線與檢出限

在最佳實驗條件下，采用本方法測定質(zhì)量濃度分別為5、10、15、20μg/mL的法莫替丁與雷尼替丁混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，以峰面積為縱坐標(biāo)（y），以樣品的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x，μg/mL）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。如表1所示，法莫替丁與雷尼替丁分別在0．024～25μg/mL和0．033～25μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)（r）分別為0．999 0和0．998 8；根據(jù)信噪比（S/N）大于3計算得到方法檢出限（LOD）分別為7．3、10．1 ng/mL，結(jié)果顯示該方法的靈敏度高。將標(biāo)準(zhǔn)藥品加入空白尿樣中配制系列質(zhì)量濃度的混合溶液，然后分別重復(fù)進(jìn)樣分析5次，得到的RRS信號穩(wěn)定。圖5A為法莫替丁和雷尼替丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖，表明該方法得到的色譜峰尖銳且穩(wěn)定，基線噪音很小，保留時間在12 min內(nèi)。

表1 法莫替丁和雷尼替丁的線性關(guān)系、檢出限、回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 1 Linear relations，detection limits，recoveries and RSDs of famotidine and ranitidine

2.7 回收率與相對標(biāo)準(zhǔn)偏差

在經(jīng)前處理的空白尿液樣品中加入FMTD和RNTD標(biāo)準(zhǔn)品，制備成加標(biāo)濃度分別為5．0、10μg/mL的樣品，各濃度平行進(jìn)樣6次，按照本方法進(jìn)行分析（見表1）。結(jié)果顯示，法莫替丁與雷尼替丁的加標(biāo)回收率為97．8%～102%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）均不大于5．1%，顯示該方法的準(zhǔn)確性和精密度高，符合分析方法要求。

2.8 實際樣品測定

按“1．3”方法采集和處理服用法莫替丁膠囊志愿者的尿樣，采用本方法進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，尿液中法莫替丁的平均質(zhì)量濃度約為0．765μg/mL。其色譜圖中存在其他的代謝產(chǎn)物（如圖5B），但對比標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖，可見尿液中的其它代謝產(chǎn)物不會對樣品檢測產(chǎn)生干擾。

圖5 法莫替丁和雷尼替丁標(biāo)準(zhǔn)溶液（A）及實際人體尿液的色譜圖（B）Fig．5 Chromatograms of the standard solution for FMTD and RNTD（A）and the real urine sample（B）B：a．the standard solution；b．the urine sample was taken 12 h after the patient took 269 mg FMTD

3 結(jié) 論

本研究通過高效液相色譜與共振瑞利散射聯(lián)用建立了一種新穎的分析檢測方法。通過將金屬離子Pd（Ⅱ）與雷尼替丁和法莫替丁在弱酸介質(zhì)中螯合后，再與赤蘚紅通過分子間作用力結(jié)合形成離子締合物，使整個體系的RRS信號顯著增強。采用金屬離子Pd（Ⅱ）和赤蘚紅同時作為探針，引入高效液相色譜的柱后聯(lián)用裝置，與柱前分離的雷尼替丁與法莫替丁相互作用后再通過熒光檢測器記錄RRS信號。該方法具有準(zhǔn)確度和靈敏度高等特點，將其用于服用法莫替丁膠囊患者尿液中殘留藥物的檢測，結(jié)果顯示該法選擇性強、穩(wěn)定可靠。