李連鳳， 周 婷， 余其梅， 林 慧， 王震宇， 秦靈芝， 孔憲榮， 廖 偉

武漢科技大學醫(yī)學院 1公共衛(wèi)生學院 2基礎醫(yī)學院，武漢 430065 華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院 3病理科 4放射科，武漢 430030 5武漢市第五醫(yī)院呼吸與重癥內(nèi)科，武漢 430050

近年來，肺癌導致的死亡人數(shù)超過乳腺癌、前列腺癌、結(jié)直腸癌和腦癌所致死亡人數(shù)的總和，其中男性和女性的死亡率分別為23%和22%[1]。肺癌可分為非小細胞肺癌(NSCLC，約占85%)和小細胞肺癌(SCLC，約占15%)兩種類型，NSCLC的主要組織學類型是鱗癌與腺癌，而肺腺癌是肺癌中較常見的一種類型，約占肺癌總數(shù)的40%，且易發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移，5年平均生存率約為18%[2]。

受體酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase，RTK)家族在胚胎發(fā)育和疾病進展中具有重要作用，受體酪氨酸激酶樣孤核受體2(receptor tyrosine kinase-like orphan receptor 2，ROR2)是其中的一種蛋白，屬于Ⅰ型跨膜蛋白[3]，在發(fā)育期的胚胎中表達，存在于胚芽、心臟、原始生殖器、發(fā)育中的體細胞和間充質(zhì)細胞中[4]。ROR2在調(diào)節(jié)細胞周期、遷移、增殖和分化等方面也發(fā)揮著重要作用[5]。腫瘤發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移依賴于細胞的極化作用，即細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運到細胞膜表面。有研究發(fā)現(xiàn)ROR2信號通路會導致細胞極化，促使腫瘤細胞發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移[6]。在乳腺癌[7]、宮頸癌[8]、軟骨肉瘤[9]、胰腺癌[4]、平滑肌肉瘤和胃腸道間質(zhì)瘤[10]等多種惡性腫瘤中ROR2 mRNA或蛋白高表達與患者總體生存率較低相關(guān)；但另有研究報道在胃癌[3]、肝癌[5，11]和結(jié)直腸癌[12]中ROR2的表達下降。這表明在不同的癌癥中ROR2蛋白的作用可能不盡相同。

目前，ROR2蛋白在肺腺癌患者體內(nèi)的表達情況尚不清楚。本研究采用組織芯片及免疫組織化學法檢測了ROR2蛋白在肺腺癌患者癌組織及癌旁組織中的表達情況，分析ROR2蛋白與肺腺癌患者臨床特征及生存情況的關(guān)系，以期為早期干預和治療肺腺癌提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 研究對象

本研究選取了華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院2010年3月至2015年9月入院后進行切除手術(shù)的235例肺腺癌患者，收集患者的年齡、性別、吸煙情況、腫瘤的分化類型、腫瘤大小、TNM分期、是否有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或遠處轉(zhuǎn)移、細胞增殖指數(shù)Ki67的表達量和是否接受放化療等基本信息和臨床特征資料。

在腫瘤分化類型中，微乳頭型和實體型屬于低分化(71例)，腺泡型和乳頭型屬于中分化(124例)，貼壁型為高分化(40例)；TNM分期是按照美國癌癥聯(lián)合委員會肺癌TNM分期第7版(2009年)標準進行分期，其中Ⅰ期52例、Ⅱ期37例、Ⅲ期99例、Ⅳ期47例。隨訪至2018年6月，存活患者56例，死亡患者179例。所有參與本研究的患者均簽署了知情同意書，本研究獲得華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院倫理委員會的批準。

1.2 組織芯片的制作

收集所有研究對象的肺癌組織和癌旁組織，分別取小塊肺組織置于4%多聚甲醛固定液中固定24 h，再進行脫水、石蠟包埋、切片及蘇木精-伊紅(HE)染色，在顯微鏡下鏡檢，確定芯片取點部位。在取點前，稍加熱蠟塊，根據(jù)HE染色的結(jié)果定位，用取樣器對目的部位的組織點進行取樣，并按順序依次注入到相應規(guī)格的受體蠟塊孔內(nèi)，再利用組織芯片融合儀(BP0100，Biossci公司)對芯片進行融合(60～65℃，20 min)，將熔好的芯片蠟塊取出放于蠟模中，并用蠟填充滿，再在制作好的組織芯片表面填充薄薄一層蠟，4 μm切片。

1.3 免疫組織化學(IHC)染色

將組織芯片的石蠟切片置于環(huán)保透明劑及梯度乙醇中脫蠟復水，蒸餾水沖洗，高溫高壓抗原修復1～2 min，冷卻至室溫，TBS沖洗3次，3%H2O2室溫20 min，TBS沖洗3次，10%山羊血清孵育20 min，加ROR2一抗工作液(1∶200，Abcam，ab190145)4℃過夜，復溫15 min，TBS沖洗3次，滴加50 μL DAKO二抗，室溫孵育25 min，TBS沖洗3次，DAB顯色，蘇木精復染，清水洗凈、脫水、封片。在光學顯微鏡下觀察ROR2蛋白的表達并拍照。

1.4 組織芯片IHC染色的結(jié)果判定

按染色顏色深淺對蛋白的表達程度進行半定量評分：未著色為0分，定義為陰性(-)；淡黃色為1分，定義為弱陽性(+)；棕黃色為2分，定義為陽性()；棕褐色為3分，定義為強陽性()。由5名經(jīng)專業(yè)培訓的人員在不知患者臨床資料的情況下單獨完成閱片，以3人以上的一致性評分作為最終的評分結(jié)果。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 26.0軟件進行統(tǒng)計學分析。符合正態(tài)分布的連續(xù)性變量采用兩獨立樣本的t檢驗，不符合正態(tài)分布的連續(xù)性變量采用兩獨立樣本的Wilcoxon秩和檢驗，分類變量采用R×C卡方檢驗；ROR2在癌組織和癌旁組織表達的差異采用Wilcoxon配對樣本秩和檢驗；不同臨床特征與ROR2陽性表達程度的關(guān)系采用趨勢性卡方檢驗；分層分析采用Cochran-Mantel-Haenszel(CMH)卡方檢驗；以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 肺腺癌患者的臨床特征分析

本研究中納入的肺腺癌患者年齡在27～80歲之間，平均年齡為56.7歲。隨訪結(jié)束時存活病例有56例，平均年齡(53.86±8.64)歲；死亡病例有179例，平均年齡(57.33±9.98)歲，存活病例的平均年齡明顯小于死亡病例，且差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。死亡病例中，癌組織為低分化類型、腫瘤大小>3 cm、TNM分期為Ⅱ～Ⅳ期以及發(fā)生淋巴結(jié)和遠處轉(zhuǎn)移的比例明顯高于存活病例，且差異均具有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。而性別、吸煙情況、吸煙量、是否接受放化療和ROR2蛋白表達程度等特征在兩組人群中的分布差異無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)，見表1。

表1 肺腺癌患者的臨床特征分析

2.2 肺腺癌患者肺組織中ROR2蛋白的表達情況

如圖1所示，肺部癌組織中的肺泡結(jié)構(gòu)不完整，肺泡上皮細胞發(fā)生了增生性改變，癌組織多以貼壁型、乳頭型和腺泡型腺癌為主。癌旁的肺組織結(jié)構(gòu)基本正常，少部分出現(xiàn)增生性變化。ROR2蛋白在癌組織和癌旁組織中均有表達，呈現(xiàn)黃色或棕黃(褐)色的陽性顆粒，主要表達定位于腺癌細胞的細胞膜和細胞質(zhì)內(nèi)。235例肺腺癌患者中，49例(20.85%)患者癌組織中ROR2蛋白呈陰性表達，186例(79.15%)患者癌組織中ROR2蛋白呈陽性表達，其中112例(47.66%)為弱陽性，62例(26.38%)為陽性，12例(5.11%)為強陽性表達；在癌旁組織中，148例(62.98%)呈陰性表達，78例(33.19%)為弱陽性，9例(3.83%)為陽性表達，無強陽性表達。我們對ROR2蛋白在癌組織和癌旁組織的表達進行半定量分析，肺腺癌患者癌組織中ROR2蛋白的相對表達量明顯高于癌旁組織，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

A、B：41號患者的癌組織和癌旁組織，評分分別為0分和2分；C、D：15號患者的癌組織和癌旁組織，評分分別為1分和0分；E、F：5號患者的癌組織和癌旁組織，評分分別為2分和0分；G、H：19號患者的癌組織和癌旁組織，評分分別為3分和1分。0分為陰性，1分為弱陽性，2分為陽性，3分為強陽性。標尺=50 μm

2.3 肺腺癌的臨床特征與癌組織中ROR2蛋白表達的關(guān)系

TNM分期達到Ⅲ和Ⅳ期，或者發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者癌組織中ROR2蛋白陽性表達率明顯高于腫瘤分期為Ⅰ和Ⅱ期或未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者(均P<0.05)，且在ROR2蛋白陽性表達的患者中，當細胞增殖指數(shù)Ki67≥50%、癌組織為低分化、TNM分期達到Ⅲ和Ⅳ期或發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移時，ROR2蛋白陽性或者強陽性表達率明顯增加，且隨著ROR2表達程度的增強而增加，差異均具有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。而在性別、年齡、吸煙情況、分化程度、腫瘤大小、是否接受放化療、生存率和遠處轉(zhuǎn)移率等方面ROR2蛋白陽性表達率無明顯差異(均P>0.05)，見表2。

表2 肺腺癌的臨床特征與癌組織中ROR2蛋白表達的關(guān)系[例(%)]

2.4 分層分析ROR2蛋白表達與肺腺癌患者生存情況的關(guān)系

根據(jù)不同的臨床特征進行分層分析，結(jié)果顯示，在從不吸煙、腫瘤大小≤3 cm、TNM分期為Ⅰ和Ⅱ期和未接受放化療的患者中，ROR2高表達是肺腺癌患者發(fā)生死亡的危險因素，其OR及95%CI分別為3.42(1.11～10.56)、3.39(1.00～11.20)、3.37(1.03～10.97)和2.89(1.03～8.18)，見表3。

表3 分層分析ROR2蛋白表達與肺腺癌患者生存情況的關(guān)系

3 討論

肺腺癌是非小細胞肺癌中較常見的一種亞型，TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是影響肺腺癌患者預后的主要因素[13]。本研究結(jié)果顯示，肺腺癌患者的存活情況與細胞的分化程度、腫瘤的大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠處轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)，死亡病例中，癌組織為低中分化的類型、腫瘤大小>3 cm、TNM分期為Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ期以及發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠處轉(zhuǎn)移的比例明顯高于存活病例。有研究發(fā)現(xiàn)，低分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠處轉(zhuǎn)移均是肺腺癌總體生存期(OS)的獨立危險因素[14]，與本研究結(jié)果一致。

本研究發(fā)現(xiàn)，ROR2蛋白在肺腺癌的癌組織和癌旁組織中均有表達，且癌組織中ROR2蛋白的相對表達量明顯高于癌旁組織。Lu等[15]研究表明ROR2 mRNA在非小細胞肺癌組織中的表達水平顯著高于匹配的正常組織；Huang等[4]研究發(fā)現(xiàn)ROR2 mRNA在胰腺癌患者癌組織中的表達量也顯著高于癌旁組織，這與我們的研究結(jié)果一致。但有研究發(fā)現(xiàn)ROR2 mRNA和蛋白在肝癌組織中的表達明顯低于癌旁組織或者非癌組織(如慢性肝炎患者組織和肝硬化患者組織)[5，11]。因此，在不同的癌細胞或組織中，ROR2基因可能具有不同的調(diào)節(jié)作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，在肺腺癌患者TNM分期達到Ⅲ和Ⅳ期或發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移時，ROR2蛋白陽性表達率較高，且在ROR2陽性表達的肺腺癌組織中，其陽性表達率會隨著表達程度的增強而增高。有研究表明在非小細胞肺癌中ROR2高表達與TNM分期相關(guān)[15]，這與我們的研究結(jié)果基本一致。此外，在胰腺癌、膽囊鱗癌/腺鱗癌和腺癌及乳腺癌等癌組織中，ROR2的表達也與遠處轉(zhuǎn)移和TNM分期顯著相關(guān)，且在晚期的表達量顯著升高，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的組織中ROR2陽性表達率也顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的癌組織[4，16-17]。早期的研究已發(fā)現(xiàn)，ROR2蛋白高表達會促進腫瘤細胞發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移[7]，因此，癌組織中ROR2的表達情況可能與肺腺癌的TNM分期以及是否會發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。在ROR2蛋白陽性表達的肺腺癌患者中，當細胞增殖指數(shù)Ki67≥50%、腫瘤為低分化時，ROR2蛋白為陽性或者強陽性的表達率也顯著增加。其中，癌組織的Ki67表達情況以及癌組織的分化程度與肺腺癌患者的預后密切相關(guān)，Ki67值越大，說明腫瘤細胞增殖能力越強，分化程度越低，患者的預后越差[18-19]。ROR2蛋白的表達也可能影響腫瘤細胞的增殖及惡化程度，但其相關(guān)的機制有待進一步的研究。

值得注意的是，在不吸煙患者、腫瘤大小≤3 cm、TNM分期為Ⅰ和Ⅱ期或未接受放化療的肺腺癌患者中，癌組織中ROR2蛋白高表達是患者出現(xiàn)死亡的危險因素。有研究表明肺組織中ROR2異常高表達的非小細胞肺癌患者預后較差[15，20]，與本研究結(jié)果相似。這提示在肺腺癌發(fā)生的早期階段，癌組織中ROR2的表達量與患者術(shù)后的生存情況有關(guān)，其在評估肺腺癌患者預后及是否需要進行放化療等方面可能具有潛在的指導作用，為早期干預和治療肺腺癌提供了新的思路。但由于本研究納入的病例數(shù)量有限，因此ROR2在肺腺癌發(fā)生及發(fā)展過程中的作用尚需要進一步的探討。

綜上所述，癌組織中ROR2蛋白的表達情況與肺腺癌患者TNM分期、分化程度以及是否發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)，且ROR2蛋白的高表達可能是肺腺癌患者術(shù)后出現(xiàn)死亡的危險因素之一。因此，檢測肺組織中ROR2的表達情況可能為早期干預和治療肺腺癌提供新的思路。