乙型肝炎后肝硬化患者外周血免疫指標(biāo)的水平及臨床意義

邢亞斯 秦方園 楊靜文 翟亞萍

乙型肝炎病毒（HBV）感染人體后，主要通過免疫損害引起肝臟病變。肝硬化是HBV感染后肝病發(fā)展的晚期階段。該病并發(fā)癥多，且發(fā)病率和死亡率均較高，發(fā)展成為肝衰竭和肝癌的風(fēng)險極大[1]。乙型肝炎肝硬化（乙肝肝硬化）的發(fā)病機(jī)制與HBV感染機(jī)體后的一系列免疫反應(yīng)所致的免疫病理損害相關(guān)，多種免疫細(xì)胞和細(xì)胞因子共同參與了其發(fā)生和發(fā)展的過程[2]。本研究對慢性乙肝、乙肝肝硬化患者及健康志愿者外周血中淋巴細(xì)胞亞群及其血清中細(xì)胞因子的水平變化進(jìn)行了對比，從細(xì)胞免疫的角度分析了乙肝肝硬化患者的免疫狀態(tài)，為乙肝肝硬化患者的臨床評估和早期干預(yù)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 一般資料 選擇2017年1月～2018年5月在我院感染科就診的30例慢性乙肝患者（A組），男15例，女15例，平均年齡（45.37±10.28）歲；32例乙肝肝硬化患者（B組），男17例，女15例，平均年齡（48.75±9.43）歲，另選取同期30例健康志愿者作為對照組（C組），男15例，女15例，平均年齡（46.40±13.77）歲。以2015版《慢性乙型肝炎防治指南》及2012版《肝衰竭診療指南》作為診斷標(biāo)準(zhǔn)[3，4]?；颊吲懦渌≡w感染、自身免疫性疾病、酒精性肝病、肝癌、三個月內(nèi)使用過免疫調(diào)節(jié)劑或者激素等情況。三組性別、年齡比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。本研究經(jīng)我院倫理委員會批準(zhǔn)，且所有入組患者或家屬簽署知情同意書。

1.1.2 主要試劑及儀器 流式細(xì)胞術(shù)檢測淋巴細(xì)胞亞群，標(biāo)記所用抗體：CD3 FITC、CD4 PE-Cy7、CD8 APC-Cy7、CD45 PerCP-Cy5-5、CD19 APC、CD16+CD56 PE、CD4 FITC、CD25 PE、CD127 APC、CD3 PE-Cy7、CD5 APC、CD19 FITC、HLA-DR APC（BD公司，美國），AimPlex流式多因子檢測試劑盒（曠博生物公司，北京），流式細(xì)胞儀（BD公司Canto Plus，美國）。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣本采集 清晨采集患者及健康志愿者空腹時肘靜脈血，2ml置于乙二胺四乙酸二鈉（EDTANa2）抗凝管中，2ml置于無抗凝劑的采血管中。EDTANa2抗凝管顛倒混勻數(shù)次并于2h內(nèi)進(jìn)行淋巴細(xì)胞亞群的檢測。無抗凝血采集后避免顛倒混勻以免發(fā)生溶血，室溫靜置2h，待紅細(xì)胞凝固自然析出血清后，取出上清液，置-80℃冰箱保存?zhèn)錂z。采用流式法檢測外周血淋巴細(xì)胞亞群比例及細(xì)胞因子含量。

1.2.2 淋巴細(xì)胞亞群檢測 采用淋巴細(xì)胞亞群檢測試劑檢測三組受試者外周血中各細(xì)胞亞群百分比，所用試劑及檢測內(nèi)容見表1。在流式管中分別取相應(yīng)量的試劑及50μl抗凝血混勻，室溫避光孵育20min，每管中分別加入1ml溶血劑，混勻，室溫避光孵育9min，1 500r/min離心5min,棄上清，加入2ml流式鞘液，1 500r/min洗滌5min，棄上清并加入500μl流式鞘液重懸，立即用流式細(xì)胞儀檢測。采用Diva Analysis軟件分析淋巴細(xì)胞百分比。

表1 淋巴細(xì)胞亞群及其試劑

1.2.3 血清中相關(guān)細(xì)胞因子的檢測 取出-80℃冰箱保存?zhèn)溆玫难澹捎肁imPlex流式多因子檢測試劑盒對三組受試者血清中的IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17A、INF-γ、TNF-α七種因子同時進(jìn)行處理，操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行，流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測并分析結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 19.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，A、B、C三組同時符合正態(tài)分布的計量資料采用t檢驗，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，三組中有一組或多組不符合正態(tài)分布的計量資料采用非參數(shù)檢驗，用中位數(shù)（四分位數(shù)間距）表示，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 B組患者外周血淋巴細(xì)胞亞群流式結(jié)果通過三種組合Panel檢測乙肝肝硬化患者的外周血淋巴細(xì)胞亞群流式結(jié)果，見圖1。

圖1 乙肝肝硬化患者外周血淋巴細(xì)胞亞群鑒別

2.2 三組外周血中淋巴細(xì)胞亞群水平比較B組外周血中淋巴細(xì)胞、Th、NK、T、Tc、NKT細(xì)胞比例、CD4+/CD8+均低于A組和C組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），A組除Tc細(xì)胞較C組稍高，其余指標(biāo)均低于C組，但只有NK細(xì)胞的降低比例較C組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），其余差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。B組中B、B1、B2、Treg、活化T細(xì)胞比例顯著高于A、C組（P＜0.05），且A組中除B2細(xì)胞低于C組，其余指標(biāo)均較C組升高，但只有Treg細(xì)胞及活化T細(xì)胞的升高比例較顯著（P＜0.05），見表2。

表2 三組外周血中淋巴細(xì)胞亞群水平比較（%）

2.3 三組血清中細(xì)胞因子水平的比較外周血血清中的IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17A、INF-γ在B組中的含量顯著高于A、C組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。TNF-α在B組中的含量顯著高于C組（P＜0.05）,但與A組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。A組中IL-6、IL-10、IL-17A、INF-γ與C組相比顯著升高（P＜0.05），而IL-2、IL-4、TNF-α較C組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

表3 三組外周血血清中細(xì)胞因子水平比較（pg/ml）

3 討論

宿主免疫調(diào)控紊亂是導(dǎo)致肝損傷的主要原因，肝硬化相關(guān)的免疫功能紊亂包括一系列的免疫功能異常、免疫缺陷和全身性的炎癥。乙肝肝硬化的病程也與宿主的免疫狀態(tài)相關(guān)[5]。

T淋巴細(xì)胞亞群介導(dǎo)的細(xì)胞免疫及細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)在免疫調(diào)控中起著重要作用。T淋巴細(xì)胞主要分為Th、Tc亞群，Th細(xì)胞又分為Th1、Th2、Treg和Th17。Th細(xì)胞在免疫應(yīng)答中被抗原激活后誘導(dǎo)細(xì)胞免疫和體液免疫，能促進(jìn)B細(xì)胞、Tc細(xì)胞及其它免疫細(xì)胞的增殖和分化，具有較強(qiáng)的抗病毒作用[6]。Tc細(xì)胞包括抑制性T細(xì)胞和殺傷性T細(xì)胞，其在被細(xì)胞因子激活后，產(chǎn)生穿孔素和顆粒酶，將靶細(xì)胞破壞，這是HBV感染機(jī)體后引起肝細(xì)胞損傷的主要原因，也是機(jī)體清除細(xì)胞內(nèi)病毒的主要機(jī)制[7]。Treg細(xì)胞在機(jī)體自身耐受的維持中發(fā)揮著重要作用，與免疫調(diào)節(jié)、自身免疫性疾病、移植耐受、腫瘤免疫、乙肝慢性化等相關(guān)。B淋巴細(xì)胞主要分為B1a、B1b和B2三個細(xì)胞亞群，B細(xì)胞分泌多種自身抗體及抗病原菌抗體，參與許多自身免疫性疾病和腫瘤的發(fā)生。NK細(xì)胞是機(jī)體重要的執(zhí)行非適應(yīng)性免疫反應(yīng)的免疫細(xì)胞，它介導(dǎo)天然的免疫應(yīng)答，不依賴抗體和補(bǔ)體，能直接殺傷靶細(xì)胞，具有抗感染、免疫調(diào)節(jié)和免疫監(jiān)視的作用[8]。本研究結(jié)果顯示B組患者外周血中總淋巴、T、Th、Tc、NK、NKT細(xì)胞比例及CD4+/CD8+均低于A組和C組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），A組中除Tc細(xì)胞較C組稍高外，其余指標(biāo)均低于C組，但只有NK細(xì)胞的降低比例較C組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），其余差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。提示隨著乙肝病情的進(jìn)展，患者體內(nèi)的T細(xì)胞和NK細(xì)胞的比例逐漸降低，長期的HBV感染可導(dǎo)致機(jī)體免疫功能降低，且病情越重免疫功能降低的越明顯，這可能是導(dǎo)致HBV感染慢性化的原因之一[9，10]。B組中B、B1、B2、Treg、活化T細(xì)胞比例顯著高于A、C組（P＜0.05），且A組中除B2細(xì)胞低于C組，其余指標(biāo)均較C組升高，但只有Treg細(xì)胞及活化T細(xì)胞的升高比例較顯著（P＜0.05）。提示HBV感染機(jī)體后，B細(xì)胞主要發(fā)揮體液免疫應(yīng)答和抗原遞呈作用，B細(xì)胞比例的升高，提示B細(xì)胞可能參與乙肝肝硬化的進(jìn)展。Treg細(xì)胞是具有免疫抑制功能的T細(xì)胞亞群，能負(fù)向調(diào)節(jié)對自身和外來抗原的免疫反應(yīng)，慢性乙肝和肝硬化患者中Treg細(xì)胞比例逐漸升高，認(rèn)為其可抑制HBV抗原特異性T細(xì)胞，從而導(dǎo)致免疫耐受和免疫逃逸而使病毒長期存在，最終致使肝細(xì)胞損傷發(fā)生[11]?；颊邫C(jī)體被HBV抗原刺激后，T細(xì)胞及B細(xì)胞處于活化狀態(tài)。T細(xì)胞的活化與病毒的殺傷和清除相關(guān)，雖然T細(xì)胞處于活化狀態(tài)，但慢性乙肝及肝硬化患者中T細(xì)胞的比例降低，長期持久的病毒抗原刺激導(dǎo)致T細(xì)胞應(yīng)答能力較弱，故而不能有效清除病毒[12]。而B細(xì)胞的活化與體液免疫及肝病的進(jìn)程相關(guān)。HBV感染機(jī)體后通過各種病毒抗原激發(fā)機(jī)體免疫系統(tǒng)使致敏的B細(xì)胞轉(zhuǎn)化為漿細(xì)胞，并產(chǎn)生相應(yīng)抗體，從而對HBV進(jìn)行反應(yīng)并殺滅，而在此過程中受感染的肝細(xì)胞亦遭到攻擊，使肝細(xì)胞受到損傷[13]。有研究報道，外周血B1細(xì)胞隨著乙肝轉(zhuǎn)為慢性乙肝到重癥乙肝最后發(fā)展成肝硬化，其水平有逐步升高的趨勢，說明B1細(xì)胞可能參與多種肝病的發(fā)展過程[14]。

Th細(xì)胞中的Th1細(xì)胞亞群主要分泌IL-2、TNF-α、IFN-γ。IL-2能反映機(jī)體的免疫狀態(tài)，是重要的免疫增強(qiáng)劑，它能刺激T細(xì)胞增殖，激活NK和巨噬細(xì)胞。TNF-α可增強(qiáng)抗原提呈細(xì)胞促進(jìn)免疫應(yīng)答的能力，也可產(chǎn)生抗病毒蛋白，起到抑制病毒復(fù)制的作用。IFN-γ也具有抗病毒和免疫調(diào)節(jié)的功能，可激活肝細(xì)胞自身抗病毒機(jī)制從而抑制HBV DNA的復(fù)制[15]。本研究中IL-2、TNF-α和IFN-γ在A組和B組中有所升高，且與C組相比，B組的升高比例更顯著，說明HBV感染機(jī)體后，患者體內(nèi)的T細(xì)胞被病毒抗原所激活，使體內(nèi)的細(xì)胞因子含量逐漸升高，這些因子又可使機(jī)體產(chǎn)生大量的Tc細(xì)胞，從而有利于HBV的清除。但由于T細(xì)胞的比例隨著病情的進(jìn)展逐漸降低，導(dǎo)致其分泌的因子含量不足以抑制和清除病毒，最終導(dǎo)致病毒長期存在和疾病進(jìn)展。Th2細(xì)胞亞群主要分泌IL-4、IL-6、IL-10，主要作用于B細(xì)胞，刺激B細(xì)胞的活化并分泌免疫球蛋白，介導(dǎo)體液免疫。IL-4是誘導(dǎo)前體細(xì)胞向Th2分化的直接刺激因子，是Th2應(yīng)答強(qiáng)度的重要衡量指標(biāo)，王茸等[16]研究表明，IL-4在慢性肝炎、重型肝炎組中呈升高趨勢，說明IL-4升高與HBV感染病情進(jìn)展及肝硬化、肝癌的發(fā)生有關(guān)，與本研究中的結(jié)果一致。IL-6和IL-10都是具有多種功能的細(xì)胞因子[17，18]，HBV感染機(jī)體后可刺激單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IL-6和IL-10, IL-6在肝內(nèi)可以調(diào)節(jié)許多急性期反應(yīng)蛋白的合成，同時也是一種與慢性肝病相關(guān)的調(diào)節(jié)因子。IL-10是免疫抑制劑，可通過抑制Th1細(xì)胞的增殖及IFN-γ等細(xì)胞因子的分泌而抑制機(jī)體的抗病毒能力。本研究中乙肝肝硬化患者IL-6水平顯著高于正常人和慢性乙肝患者，說明IL-6與乙肝的慢性化相關(guān)，IL-10水平的升高提示其合成的增加限制了機(jī)體清除HBV的能力，導(dǎo)致病程的延長。IL-17A是由Th17細(xì)胞分泌的一種重要的促炎因子，且與HBV感染后肝臟的炎性損傷密切相關(guān)。IL-17A可以動員、募集和激活中性粒細(xì)胞，引發(fā)嚴(yán)重的組織炎癥，并促進(jìn)自身免疫性疾病的發(fā)展[19]。有研究表明血清IL-17A水平的升高，可作為肝損傷嚴(yán)重程度的標(biāo)志物[20]。本研究中IL-17A在乙肝肝硬化患者體內(nèi)的水平顯著高于正常人和慢性乙肝患者，且慢性乙肝患者中該水平顯著高于正常人，反映了HBV感染機(jī)體后，隨著病情進(jìn)展，患者肝臟的損傷程度進(jìn)一步惡化，提示IL-17A可做為檢測肝臟損傷程度的重要參考指標(biāo)。

乙肝肝硬化的發(fā)生是一個復(fù)雜的過程，免疫系統(tǒng)紊亂在其發(fā)病過程中起著重要作用，乙肝肝硬化患者外周血淋巴細(xì)胞亞群、血清中細(xì)胞因子的水平較正常人及慢性乙肝患者都發(fā)生了明顯變化，免疫功能的失調(diào)使得乙肝肝硬化的病死率和肝移植風(fēng)險顯著升高。因此，在乙肝肝硬化發(fā)生的早期對其進(jìn)行診斷，并采取有效的措施進(jìn)行治療干預(yù)，對提高患者的生存質(zhì)量具有重要意義。