李園春 劉 耘

1.河北省唐山市豐南區(qū)醫(yī)院(063300) 2.河北省唐山中心醫(yī)院

妊娠高血壓疾病臨床特征表現(xiàn)為原因不明的全身小血管痙攣，與血管內(nèi)皮功能紊亂、胎盤缺氧、細(xì)胞凋亡等因素密切相關(guān)，無特異性表現(xiàn)[1]?？梢l(fā)腎衰竭、心力衰竭、胎盤早剝、肺水腫以及產(chǎn)后出血等多種并發(fā)癥，屬高危妊娠范疇[2-3]。缺乏早期篩查的特異性指標(biāo)。本文分析脂肪分化相關(guān)蛋白(ADRP)、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)脫氫酶、熱休克蛋白70(HSP70)在妊娠高血壓疾病患者胎盤組織中的表達(dá)變化，為臨床早期篩查和疾病評估提供參考。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2019年2月—2020年2月本院收治的152例妊娠高血壓疾病患者為高血壓組，同期110例健康產(chǎn)婦為健康對照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：妊娠高血壓符合相關(guān)指南診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]，近2周內(nèi)未使用相關(guān)藥物干預(yù)，單胎妊娠；健康對照組產(chǎn)婦身體健康，無妊娠期合并癥。所有研究對象均配合研究且自愿參與。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并妊娠期糖尿病、肝內(nèi)膽汁淤積癥、心臟病等其他妊娠期合并癥；多胎妊娠；原發(fā)性高血壓；合并甲亢、甲減等內(nèi)分泌系統(tǒng)疾?。患谞钕傧到y(tǒng)疾?。辉星昂喜⒏哐獕杭膊≌?；精神、溝通障礙。本研究經(jīng)本院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2ADRP、NADH、HSP70檢測

在所有研究對象胎盤娩出后5min內(nèi)取胎盤中央母體面組織(1cm×1cm×1cm)，避開梗死、鈣化、出血區(qū)域，分兩份，其中一份反復(fù)沖洗后置4%多聚甲醛中固定1d后做石蠟包埋，制備4μm石蠟切片，保存?zhèn)溆?。另一份?70℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.1 ADRP、NADH、HSP70表達(dá)將石蠟切片標(biāo)本在二甲苯脫蠟處理30min，在梯度乙醇中各浸泡5min，無菌蒸餾水清洗5min。在沸水中加入檸檬酸鈉抗原修復(fù)液水浴20min，冷卻到室溫，采用PBS清洗3次，每次5min。分別滴加ADRP、NADH、HSP70抗體(1：200)，在4℃濕盒中保存過夜。第2d取出濕盒，復(fù)溫1 h，采用PBS洗片3次，每次5min。加入二氨基聯(lián)苯胺(1：50)顯色lmin，加入蒸餾水終止反應(yīng)。加入蘇木素復(fù)染，鹽酸乙醇分化后梯度乙醇脫水，二甲苯?jīng)_洗片3次直到透明，采用中性樹脂封片處理，顯微鏡下觀察免疫組化染色情況。隨機(jī)選取5個視野，病理切片均由2位以上有經(jīng)驗的醫(yī)師采用雙盲法確認(rèn)。根據(jù)染色程度和染色細(xì)胞百分比進(jìn)行評估：陽性細(xì)胞數(shù)<10%為(-)，10～25%為(+)，25～75%為(++)，>75%為(+++)。

1.2.2 ADRP、NADH、HSP70 mRNA表達(dá)量取在冰箱中保存的胎盤組織，采用Trizol法提取胎盤組織總RNA，檢測RNA純度、含量，使用Takara逆轉(zhuǎn)錄試劑盒行逆轉(zhuǎn)錄處理后獲得cDNA，采用Primer5.0軟件設(shè)計引物序列，使用實時熒光定量PCR(RT-PCR)方法檢測兩組患者治療前后胎盤組織中ADRP、NADH、HSP70 mRNA表達(dá)量，采用2-△△Ct方法計算出需要檢測的ADRP、NADH、HSP70 mRNA表達(dá)量。反應(yīng)體系：0.4μl上下游引物、1μlcDNA模板、10μl SYB Green，加蒸餾水至20μl。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30s、95℃ 5s、60℃ 31s，共進(jìn)行40個循環(huán)。ADRP引物序列：上游：5’-AGCTGTTGGTAGAACAGTAC-3’，下游：5’-AGATGTCGCCTGCCATCACC-3’；NADH引物序列：上游：5’-CCGCCGCCAAGAAGTATAAT-3’，下游：5’-ACATGTCTAGGTGCCAGTGC-3’；HSP70引物序列：上游：5’-GAGTTTGAGCACAAGAGGAAGG-3’，下游：5’-AAGAAATAGTCGTAAGATGGCAG-3’；內(nèi)參β-actin引物序列：上游：5’-CTGGCACCACACCTTCTACAATGAGC-3’，下游：5’-GAGGATCTTCATGAGGTAGTCAGT-3’。

1.3 觀察指標(biāo)

分析高血壓組(妊娠期高血壓、輕度子癇前期、重度子癇前期)、健康對照組胎盤組織ADRP、NADH、HSP70表達(dá)情況并分析與妊娠高血壓組疾病嚴(yán)重程度及臨床特征關(guān)系。追蹤高血壓組至妊娠終止，記錄羊水過少、胎盤早剝、胎兒窒息、胎兒生長受限等不良妊娠結(jié)局發(fā)生情況，分為不良妊娠結(jié)局組和妊娠結(jié)局良好組，分析ADRP、NADH、HSP70之間相關(guān)性及與妊娠結(jié)局關(guān)系。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 一般臨床資料

高血壓組年齡(28.0±3.8)歲(24～35歲)，體質(zhì)指數(shù)(BMI)(27.6±2.4)kg/m2(25～33 kg/m2)，孕周(38.0±2.0)周(36～40周)；初產(chǎn)婦70例，經(jīng)產(chǎn)婦82例；妊娠期高血壓62例，輕度子癇前期41例，重度子癇前期49例。健康對照組，年齡(27.1±4.8)歲(22～35歲)，BMI(27.7±2.2)kg/m2(25.3～32.9 kg/m2)，孕周(38.5±2.5)周(36～41周)；初產(chǎn)婦52例，經(jīng)產(chǎn)婦58例。兩組對比無差異(P>0.05)

2.2 胎盤組織中ADRP、NADH、HSP70表達(dá)

與健康對照組相比，高血壓組胎盤組織中ADRP、NADH、HSP70 mRNA表達(dá)量升高(P<0.05)。見表1、圖1(856頁)。

表1 兩組胎盤組織中各mRNA表達(dá)情況對比

2.3ADRP、NADH、HSP70與妊娠高血壓疾病程度關(guān)系

隨著妊娠高血壓疾病加重，患者ADRP、NADH、HSP70 mRNA表達(dá)量逐漸升高(P<0.05)。見表2。

表2 各mRNA與妊娠高血壓疾病程度關(guān)系

2.4ADRP、NADH、HSP70與妊娠高血壓疾病臨床特征關(guān)系

ADRP、NADH、HSP70表達(dá)與妊娠高血壓患者年齡、BMI、孕產(chǎn)次無關(guān)(P>0.05)，與患者家族子癇前期史、家族高血壓史、尿蛋白水平有關(guān)。與無家族子癇前期史、無家族高血壓史、尿蛋白水平+、++的患者相比，有家族子癇前期史、有家族高血壓史、尿蛋白水平+++的患者ADRP、NADH、HSP70 mRNA表達(dá)量升高(P<0.05)。見表3。

表3 各mRNA與妊娠高血壓患者臨床特征關(guān)系

臨床特征 例數(shù)ADRP mRNAt/FPNADH mRNAt/FPHSP70 mRNAt/FP子癇前期家族史8.3500.00112.3100.00115.2200.001 有321.86±0.331.98±0.382.02±0.39 無1201.45±0.221.34±0.221.22±0.22高血壓家族史11.6500.00116.6800.0017.7800.001 有281.95±0.541.85±0.161.86±0.35 無1241.21±0.221.32±0.151.33±0.32尿蛋白18.0110.00128.1030.00123.8950.001 +591.05±0.221.13±0.131.11±0.16 ++431.52±0.261.76±0.211.56±0.21 +++502.03±0.582.05±0.351.92±0.35

2.5ADRP、NADH、HSP70與妊娠高血患者妊娠結(jié)局關(guān)系

妊娠高血壓疾病患者中，妊娠結(jié)局不良組ADRP、NADH、HSP70 mRNA表達(dá)量高于妊娠結(jié)局良好組(P<0.05)。見表4。

表4 各mRNA與妊娠高血壓疾病患者妊娠結(jié)局關(guān)系

2.6ADRP、NADH、HSP70相關(guān)性

Pearson分析顯示，ADRP與NADH呈正相關(guān)(r=0.309,P=0.001)，ADRP與HSP70呈正相關(guān)(r=0.265,P=0.001)；NADH呈HSP70之間正相關(guān)(r=0.254,P=0.002)。見圖2(856頁)。

3 討論

妊娠高血壓疾病臨床較常見，長期處于持續(xù)的高血壓狀態(tài)可引發(fā)機(jī)體臍動脈血流異常、母體多器官功能損傷等，威脅著母嬰健康，是導(dǎo)致圍產(chǎn)期母嬰死亡的主要原因之一。多數(shù)研究顯示，此病的發(fā)生與血管內(nèi)皮功能紊亂、胎盤和滋養(yǎng)細(xì)胞缺氧缺血、免疫因素、脂代謝異常以及遺傳因素等[5-6]。雖然研究顯示妊娠高血壓疾病與多因素相關(guān)，但仍缺乏特異性診斷指標(biāo)。

ADRP基因與脂代謝異常過程相關(guān)，屬一種分子量為48.1KDa的膜相關(guān)蛋白，分布于人類的內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、培養(yǎng)的細(xì)胞系纖維母細(xì)胞中[7]。主要生物學(xué)功能包括促進(jìn)長鏈脂肪酸的吸收、調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞中脂質(zhì)代謝、促進(jìn)脂質(zhì)堆積和脂滴形成等[8-9]。目前臨床研究顯示，ADRP參與多種脂代謝異常疾病的發(fā)生，包括糖尿病等，其表達(dá)處于異常升高狀態(tài)[10]。而研究顯示[11]，脂代謝異常是妊娠高血壓疾病的誘發(fā)因素之一，因此推測ADRP可能與妊娠高血壓發(fā)生發(fā)展相關(guān)。本文研究顯示，ADRP在妊娠高血壓患者表現(xiàn)為高表達(dá)，且隨著疾病的進(jìn)展表達(dá)量加劇，推測可能與患者脂肪代謝紊亂有關(guān)。

HSP70屬于熱休克蛋白家族成員，具有保護(hù)細(xì)胞免受侵襲的作用，參與炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)、細(xì)胞凋亡等過程[12]。臨床研究顯示，正常妊娠過程中胎盤發(fā)育均伴隨著微量的炎癥和低氧信號刺激，HSP70處于穩(wěn)定表達(dá)狀態(tài)利于胎盤正常生長發(fā)育[13]。但當(dāng)母體出現(xiàn)較明顯炎癥反應(yīng)時，機(jī)體HSP70會異常增多，介導(dǎo)免疫應(yīng)答反應(yīng)的發(fā)生，參與妊娠高血壓疾病的發(fā)生發(fā)展。臨床研究顯示，妊娠高血壓疾病患者胎盤缺血、氧化應(yīng)激、血流動力學(xué)改變等因素均會加深全面免疫反應(yīng)程度，介導(dǎo)較多的HSP70產(chǎn)生，增強(qiáng)其表達(dá)[14-15]。陳鯤等[16]研究表明，HSP70在妊娠期高血壓患者血清中高表達(dá)，提示HSP70與妊娠期高血壓相關(guān)。本文研究結(jié)果顯示，妊娠高血壓疾病患者胎盤組織中HSP70表達(dá)增高，且隨著疾病進(jìn)展表達(dá)加劇，與妊娠不良結(jié)局相關(guān)。提示患者存在一定的免疫應(yīng)答反應(yīng)，表現(xiàn)為HSP70增加，臨床可根據(jù)其水平評估患者疾病程度和預(yù)測妊娠結(jié)局。

NADH屬于一種由線粒體重鏈區(qū)的ND1～5所編碼的基因，屬電子傳遞鏈中較重要的黃素蛋白[17-18]。目前已有多數(shù)研究顯示，NADH基因參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展，如重癥肺炎、肝臟疾病等[19-20]。臨床研究顯示，線粒體屬于多種真核生物細(xì)胞中的重要細(xì)胞器，可經(jīng)氧化磷酸化過程生成ATP，屬于脂肪有氧代謝的場所，當(dāng)其功能損傷后NADH表達(dá)升高[21]。功能低下的線粒體多因脂肪氧化不足產(chǎn)生過量的超氧化物、脂質(zhì)過氧化物、自由基以及游離脂肪酸等，上述物質(zhì)的出現(xiàn)均會導(dǎo)致血管內(nèi)皮損傷。因此推測，NADH可能經(jīng)損傷線粒體介導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷而誘導(dǎo)妊娠高血壓疾病的發(fā)生。在本研究妊娠高血壓疾病患者胎盤組織中NADH高表達(dá)，且與患者疾病嚴(yán)重程度及不良妊娠結(jié)局的發(fā)生相關(guān)。提示，NADH可能參與妊娠高血壓疾病的發(fā)生進(jìn)展，臨床可根據(jù)其表達(dá)變化評估此病。

綜上所述，妊娠高血壓疾病患者胎盤組織中ADRP、NADH、HSP70均為高表達(dá)狀態(tài)，且隨著疾病進(jìn)展而表達(dá)加劇，并與妊娠結(jié)局相關(guān)。臨床上可根據(jù)其表達(dá)評估此病和預(yù)測妊娠結(jié)局，以改善母嬰預(yù)后。