郭良勇，殷雨洋，周俊波，曹訪*，王翀，鄭開之，吳建良，彭彩娥

(1. 湖州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院湖羊研究所，浙江 湖州 313000；2. 湖州師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，浙江 湖州 313000；3. 浙江農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，浙江 臨安 311300；4. 浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)所，浙江 杭州 310021；5. 湖州市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，浙江 湖州 313000)

近年來，隨著人工授精技術(shù)在家畜繁殖領(lǐng)域的逐步推廣，依托稀釋液的精液液態(tài)低溫保存技術(shù)也逐漸受到研究者的關(guān)注。液態(tài)低溫保存是通過溫度降低使精子代謝減弱，從而延長(zhǎng)精子存活時(shí)間，當(dāng)溫度回升后，能夠恢復(fù)正常代謝機(jī)能而不喪失受精能力。稀釋液配方是液態(tài)低溫保存的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，良好的稀釋液包含營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、抗氧化劑、酶和激素等各種成分，不僅可以擴(kuò)大有效精液容積，還可以為精子代謝提供所需的能量物質(zhì)[1-2]，可提高精子活力、延長(zhǎng)精子壽命。

目前，在精液稀釋保存領(lǐng)域針對(duì)抗氧化物的添加效果研究，越來越受到科研工作者的關(guān)注。維生素不僅是一種酸性抗氧化劑，也是一種重要的和有效的自由基清除劑[3]，它能有效地維持精細(xì)胞基因的完整，保護(hù)精子質(zhì)膜免受氧化，因此在畜禽精液的保存過程中發(fā)揮重要作用[4]。Aurich等[5]向馬的精液中添加0.9 mg/mL維生素C，發(fā)現(xiàn)維生素C能抑制精子代謝，從而延長(zhǎng)精子的存活時(shí)間。馬紅等[6]向含有民豬精液的常溫稀釋液中添加維生素C，發(fā)現(xiàn)可提高精子活力和質(zhì)膜完整率，延長(zhǎng)精液保存時(shí)間。此外還有研究表明，維生素C可提高藏豬、貴州黑山羊、藏西北絨山羊、馬等家畜精液的4 ℃液態(tài)保存的效果[7-10]。鑒于此，本試驗(yàn)在精液稀釋保存液中添加不同水平的維生素C，探究其對(duì)湖羊精子體外生存狀況的影響，以期為精液稀釋保存液的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

健康、繁殖能力正常且年齡在2～3周歲的成年種公羊5頭，湖州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院湖羊試驗(yàn)場(chǎng)提供。

1.2 藥品及試劑

維生素C、果糖、三羥甲基氨基甲烷、檸檬酸均為分析純級(jí)別。精子快速染色試劑盒、總抗氧化能力(T-AOC)檢測(cè)試劑盒、丙二醛(MDA)檢測(cè)試劑盒、過氧化氫酶(CAT)檢測(cè)試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)檢測(cè)試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.3 精液采集

利用假陰道法采集精液，精液采集后放入預(yù)溫的集精杯中并于30 min內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室，用顯微鏡于37 ℃水浴進(jìn)行精液品質(zhì)檢測(cè)，鮮精活力達(dá)到0.85以上的用于試驗(yàn)。

1.4 稀釋與保存

試驗(yàn)采用前期篩選的湖羊精液稀釋液配方，配方為：果糖5 g/L、三羥甲基氨基甲烷30.63 g/L、檸檬酸19.9 g/L，蛋黃添加濃度20 %[11]。試驗(yàn)分3組，以不添加維生素C的基礎(chǔ)稀釋液為對(duì)照組，以添加1 mg/mL、3 mg/mL維生素C的稀釋液為試驗(yàn)1組、試驗(yàn)2組。在等溫條件下按1∶3的稀釋倍數(shù)對(duì)原精進(jìn)行稀釋，將稀釋后的精液保存在4 ℃冰箱中。在精液保存過程中，每12 h翻動(dòng)1次精液。保存0、24、48、72、96 h后，檢測(cè)精子活力、T-AOC、MDA、GSH-Px、CAT，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 精液品質(zhì)檢測(cè)

1.5.1 精子常規(guī)指標(biāo)

在顯微鏡下觀察精子活力，采用百分制法，計(jì)算直線前進(jìn)精子數(shù)占總精子數(shù)的百分比。

1.5.2 精子生化指標(biāo)

使用相應(yīng)試劑盒，對(duì)精液的精漿中T-AOC、MDA、GSH-Px、CAT進(jìn)行測(cè)定。其中T-AOC檢測(cè)依據(jù)Fe3+還原比色法原理，比色波長(zhǎng)為520 nm；MDA檢測(cè)依據(jù)硫代巴比妥酸比色法原理，比色波長(zhǎng)為532 nm；GSH-Px采用二硫代二硝基甲酸比色法原理，比色波長(zhǎng)為412 nm；CAT檢測(cè)依據(jù)鉬酸銨比色法原理，比色波長(zhǎng)為405 nm。以上測(cè)定相關(guān)操作均嚴(yán)格按照南京建成生物工作有限公司試劑盒說明書要求進(jìn)行。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel軟件進(jìn)行處理，SPSS 23.0進(jìn)行雙因素方差分析；結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，P<0.01表示差異極顯著，P<0.05表示差異顯著，P>0.05表示差異不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 維生素C對(duì)湖羊精液4 ℃保存時(shí)精子活力的影響

由表1可知，隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)照組、試驗(yàn)1組和試驗(yàn)2組的精子活力整體呈顯著下降趨勢(shì)，各組96 h精子活力最低；24、48、72、96 h與0 h相比下降極顯著(P<0.01)。試驗(yàn)2組的精子活力下降最快，24 h活力低于0.1，且24、48、72、96 h活力均極顯著低于對(duì)照組和試驗(yàn)1組(P<0.01)。對(duì)照組和試驗(yàn)1組的活力保持較好，96 h活力都在0.7以上，但試驗(yàn)1組的24、48、72、96 h活力極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)。

表1 湖羊精液4 ℃保存時(shí)的精子活力變化

2.2 維生素C對(duì)湖羊精液4 ℃保存時(shí)精漿中MDA含量的影響

由表2可知，時(shí)間和維生素C對(duì)精漿中MDA含量影響極顯著(P<0.01)。隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)照組、試驗(yàn)1組、試驗(yàn)2組的精漿中MDA含量整體呈曲折下降的趨勢(shì)。試驗(yàn)1組和試驗(yàn)2組0、24、48、72、96 h精漿中MDA含量極顯著低于對(duì)照組(P<0.01)；試驗(yàn)2組0、24、48 h精漿中MDA含量極顯著低于試驗(yàn)1組(P<0.01)，96 h時(shí)試驗(yàn)2組顯著低于試驗(yàn)1組(P<0.05)，但72 h時(shí)兩組差異不顯著(P>0.05)。

表2 湖羊精液4 ℃保存時(shí)精漿中MDA含量變化 nmol/mL

2.3 維生素C對(duì)湖羊精液4 ℃保存時(shí)精漿中T-AOC水平的影響

由表3可知，時(shí)間和維生素C對(duì)精漿中T-AOC水平影響明顯。與對(duì)照組相比，添加維生素C的試驗(yàn)1組和試驗(yàn)2組精漿中T-AOC水平成倍數(shù)增長(zhǎng)，保存0、24、48、72、96 h，其T-AOC水平極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)，且試驗(yàn)2組精漿中T-AOC整體水平極顯著高于試驗(yàn)1組(P<0.01)；隨著保存時(shí)間延長(zhǎng)，T-AOC水平逐漸降(P<0.01)。

表3 湖羊精液4 ℃保存時(shí)精漿中T-AOC水平變化 U/mL

2.4 維生素C對(duì)湖羊精液4 ℃保存時(shí)精漿中GSH-Px活力的影響

由表4可知，時(shí)間和維生素C極顯著影響精漿中GSH-Px活力(P<0.01)。隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)照組、試驗(yàn)1組和試驗(yàn)2組精漿中GSH-Px活力整體呈極顯著下降趨勢(shì)(P<0.01)。雖然試驗(yàn)1組0 h精漿中GSH-Px活力極顯著低于對(duì)照組(P<0.01)，但24、48、72、96 h精漿中GSH-Px活力極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)；試驗(yàn)2組精漿中GSH-Px活力整體極顯著低于試驗(yàn)1組(P<0.01)。

表4 湖羊精液4 ℃保存時(shí)精漿中GSH-Px活力變化 U/mL

2.5 維生素C對(duì)湖羊精液4 ℃保存時(shí)精漿中CAT活力的影響

由表5可知，時(shí)間和維生素C極顯著影響精漿中CAT活力。試驗(yàn)1組在0、24 h，精漿中CAT活力極顯著低于對(duì)照組(P<0.01)，但在48、72、96 h精漿中CAT活力極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)。試驗(yàn)2組精漿中CAT水平整體顯著低于試驗(yàn)1組。

表5 湖羊精液4 ℃保存時(shí)精漿中CAT活力變化 U/mL

3 討論

3.1 保存時(shí)間對(duì)湖羊精子活力的影響

在綿羊精液液態(tài)低溫保存過程中，稀釋液中營(yíng)養(yǎng)成分充分保障精子代謝的營(yíng)養(yǎng)需求，低溫條件下精子的運(yùn)動(dòng)和代謝速率下降慢，精子體外存活時(shí)間得以延長(zhǎng)，同時(shí)不喪失受精能力。但在精液的稀釋處理、降溫以及低溫保存過程中，都會(huì)不可避免產(chǎn)生大量活性氧(ROS)和活性氮(RNS)，它們會(huì)對(duì)精子結(jié)構(gòu)和遺傳物質(zhì)穩(wěn)定性造成不可逆損傷。雖然適量ROS對(duì)維持精子正常的生理功能是必要的，如生理功能的調(diào)節(jié)、結(jié)合透明帶能力的提升等[12]，但過量ROS會(huì)造成精子DNA碎裂、質(zhì)膜損傷、線粒體功能異常和凋亡等，最終縮短精子在體外存活時(shí)間[13]。研究表明，綿羊精液保存過程中ROS主要由精子的芳香族氨基酸氧化酶催化產(chǎn)生，這種酶主要來源于死精子。如果精液中死精子越多，芳香族氨基酸氧化酶活性越強(qiáng)，從而造成惡性循環(huán)，導(dǎo)致某些仍有活力的精子因?yàn)镽OS濃度升高而受到損害[14]。本試驗(yàn)中，對(duì)照組、試驗(yàn)1組和試驗(yàn)2組精子活力整體都呈極顯著下降趨勢(shì)，這可能與精液采集、稀釋、降溫處理等過程導(dǎo)致部分精子死亡，釋放出過量芳香族氨基酸氧化酶，產(chǎn)生過量ROS等物質(zhì)有關(guān)。過量的ROS不利于精子的存活，隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)，死亡精子顯著增加，從而引發(fā)惡性循環(huán)，進(jìn)而導(dǎo)致精子活力極顯著降低。

3.2 維生素C對(duì)湖羊精子活力的影響

維生素C是哺乳類動(dòng)物精液稀釋保存中添加的常用維生素類抗氧化劑。本研究發(fā)現(xiàn)，添加維生素C的試驗(yàn)組0 h精子活力要略低于對(duì)照組，且添加濃度更高的試驗(yàn)2組精子活力更低，這可能與添加了維生素C的稀釋液滲透壓偏高有關(guān)。趙憲林等[15]研究發(fā)現(xiàn)，一定濃度的維生素C對(duì)荷斯坦牛X精子活力具有顯著提高作用，而高濃度則對(duì)精子存活不利，原因是高濃度維生素C可能導(dǎo)致稀釋液濃度較大，滲透壓較高。本研究也證實(shí)，當(dāng)維生素C添加濃度達(dá)到3 mg/mL時(shí)，湖羊精子活力顯著降低，這可能是因?yàn)榫S生素C添加濃度過高會(huì)導(dǎo)致稀釋液滲透壓偏高，精子無法正常代謝，進(jìn)而影響精子細(xì)胞結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，導(dǎo)致精子活力偏低。

試驗(yàn)中添加1 mg/mL維生素C的試驗(yàn)1組，雖然0 h精子活力由于稀釋液滲透壓存在差異的原因略低于對(duì)照組，但24、48、72、96 h后的精子活力要極顯著高于對(duì)照組，說明1 mg/mL的維生素C可以延緩湖羊精子活力的下降趨勢(shì)，延長(zhǎng)精液的保存時(shí)間。這可能與維生素C是一種有效的自由基清除劑有關(guān)[3]。由于湖羊精液在稀釋和保存過程中，產(chǎn)生的大量ROS會(huì)攻擊精細(xì)胞質(zhì)膜上豐富的多不飽和脂肪酸，發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，從而導(dǎo)致精子質(zhì)膜過氧化損傷。Valcarce等[16]研究發(fā)現(xiàn)，ROS的產(chǎn)生會(huì)誘導(dǎo)漿細(xì)胞構(gòu)象和完整性發(fā)生不可逆損傷，造成DNA損傷并加速細(xì)胞凋亡。正常情況下湖羊原精中含有大量抗氧化物質(zhì)，可以發(fā)揮自身抗氧化系統(tǒng)作用而消除大部分自由基。但由于稀釋過程中導(dǎo)致抗氧化物濃度大大降低，因而會(huì)對(duì)精液保存效果造成一定影響[17]。而維生素C作為一種外源性抗氧化劑，可在一定程度上增強(qiáng)精液稀釋后系統(tǒng)內(nèi)部的抗氧化能力，及時(shí)清理代謝產(chǎn)生的ROS，減輕對(duì)精子質(zhì)膜的過氧化損傷，減少DNA損傷并減緩精細(xì)胞凋亡，從而達(dá)到保護(hù)頂體、提高精子活力的效果。此外，研究表明合理濃度的維生素C，其偏酸性可抑制羊精液低溫保存時(shí)精子代謝，延長(zhǎng)精子存活時(shí)間[18]。本試驗(yàn)也證實(shí)，添加1 mg/mL的維生素C，可提高湖羊精液的保存質(zhì)量，提高精子活力。

本試驗(yàn)中，1 mg/mL的維生素C添加濃度是精液4倍稀釋后的濃度，相當(dāng)于原精液中的維生素C添加量為4 mg/mL，陳宗明等[7]、宋天增等[19]在原精液中分別添加3 mg/mL、2 mg/mL維生素C可顯著提高云貴高原貴州黑山羊、藏西北絨山羊精液4 ℃保存的精子活力與本試驗(yàn)結(jié)果基本一致。維生素C的添加量差異可能與羊的品種以及本試驗(yàn)的濃度設(shè)計(jì)有關(guān)，具體原因還有待進(jìn)一步研究。

3.3 維生素C對(duì)精漿中MDA含量、T-AOC水平、GSH-Px和CAT活力的影響

哺乳動(dòng)物精液自身具有抗氧化系統(tǒng)，主要由超氧化物歧化酶(SOD)、CAT、GSH-Px和谷胱甘肽還原酶(GR)等組成[20-21]，它們可以清除ROS，防止過氧化反應(yīng)的發(fā)生。在精子細(xì)胞內(nèi)，SOD催化超氧陰離子自由基(O2-)為過氧化氫(H2O2)，后者將其呈遞給CAT和GSH-Px。在二者的共同作用下降解為水和氧氣，可降低超氧陰離子自由基(O2-)對(duì)細(xì)胞膜的損害[22]。王爭(zhēng)光等[23]在金華豬精液的冷凍稀釋液中添加一定濃度的抗氧化劑SOD，發(fā)現(xiàn)可顯著提高豬精子4 ℃平衡后的活率、解凍后精子活率和質(zhì)膜完整率。易康樂等[24]在水牛冷凍保存液中添加一定濃度的SOD和GSH，發(fā)現(xiàn)可以顯著提高精子冷凍解凍后活率，且兩者共同加入時(shí)效果更明顯。任俊玲等[25]在冷凍稀釋液中聯(lián)合添加一定濃度的SOD和CAT，可明顯提高冷凍精液解凍后的精子活力、活率、質(zhì)膜完整率和頂體完整率。相關(guān)研究表明，GSH-Px、T-AOC和CAT 可以反映出精液內(nèi)部抗氧化系統(tǒng)清除ROS，減少過氧化反應(yīng)，進(jìn)而延長(zhǎng)精子的存活時(shí)間的能力。本試驗(yàn)添加1 mg/mL維生素C的試驗(yàn)1組，其精漿中的GSH-Px和CAT活力相對(duì)于對(duì)照組顯著降低，但后期活力都要極顯著高于對(duì)照組，說明維生素C具有延緩GSH-Px和CAT活力喪失的功能。且添加維生素C的試驗(yàn)1組和試驗(yàn)2組T-AOC水平要極顯著高于對(duì)照組，96 h內(nèi)都維持在一個(gè)較高水平，說明維生素C能顯著增強(qiáng)精液自身內(nèi)部的抗氧化功能。

由于ROS攻擊精細(xì)胞膜引發(fā)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，會(huì)產(chǎn)生MDA等脂質(zhì)過氧化物，而MDA主要通過影響線粒體內(nèi)酶的活性，引起蛋白質(zhì)和核酸等生物大分子聚合，對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用[26]，因此MDA的水平在一定程度上反映了精細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化損傷情況[27]。本研究中，添加維生素C可以顯著降低精液中的MDA含量，說明外源性維生素C，在一定程度上可以抑制過氧化反應(yīng)，減少M(fèi)DA的產(chǎn)生量，從而減輕對(duì)精細(xì)胞的毒害作用，進(jìn)而延長(zhǎng)精子的有效保存時(shí)間。

本研究證實(shí)，合理濃度的維生素C一方面通過增加系統(tǒng)抗氧化物濃度，提高相關(guān)抗氧化酶活力，激活精液自身抗氧化系統(tǒng)，及時(shí)清理ROS；另一方面通過弱酸性抑制精子代謝，減少ROS的產(chǎn)生，從而減輕對(duì)精細(xì)胞膜和遺傳物質(zhì)的損傷，達(dá)到提高精子活力，提高精液保存質(zhì)量的效果。

4 結(jié)論

研究結(jié)果表明，在湖羊精液4 ℃保存稀釋液中，添加1 mg/mL濃度的維生素C，可顯著提高精子活力，延緩GSH-Px、CAT活性下降，提高T-AOC水平，減少M(fèi)DA生成量，從而提高精液保存效果。本研究結(jié)果將為湖羊精液低溫保存的生產(chǎn)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。