郭艷霞，李孟偉，唐振華，彭麗娟，彭開屏，梁辛，謝芳，楊承劍

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院廣西水牛研究所/農(nóng)業(yè)部(廣西)水牛遺傳繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530001)

延胡索酸及其鈉鹽，安全無毒，作為飼料添加劑在單胃動(dòng)物飼料中廣泛使用，可作為酸化劑、抗應(yīng)激劑和防腐劑。在反芻動(dòng)物中，延胡索酸是瘤胃發(fā)酵的中間產(chǎn)物，可作為電子受體，是抑制瘤胃甲烷生成和生成丙酸的重要前體物[1]。有研究表明，在體外條件下添加延胡索酸二鈉能提高瘤胃總揮發(fā)性脂肪酸(TVFA)和丙酸濃度[2]，且能促進(jìn)纖維素分解菌增殖及對(duì)纖維素的消化[3]。關(guān)于延胡索酸及其鈉鹽對(duì)甲烷產(chǎn)量影響效果報(bào)道有所不同。Li等[4]在薩能奶山羊飼糧中添加延胡索酸，延胡索酸競(jìng)爭(zhēng)性的利用甲烷生成過程中的氫而抑制了瘤胃甲烷產(chǎn)量，對(duì)干物質(zhì)降解率無顯著影響。而Beauchemin等[5]研究結(jié)果表明，延胡索酸鹽不能有效地減少甲烷產(chǎn)量。延胡索酸及其鈉鹽沒有降低甲烷排放原因可能是由于瘤胃中延胡索酸分解生成乙酸，產(chǎn)生氫氣，分解產(chǎn)生的氫氣抵消了其消耗的氫氣，沒有使甲烷產(chǎn)量發(fā)生變化。延胡索酸及鈉鹽影響瘤胃發(fā)酵主要是通過影響瘤胃微生物對(duì)代謝氫的利用[6]，而瘤胃微生物對(duì)氫的代謝也可能會(huì)影響不飽和脂肪酸的生物氫化過程，因?yàn)闅浠緩街邪嗖綒涞睦煤碗娮拥膫鬟f[7]。目前關(guān)于通過添加延胡索酸及鈉鹽的方式來降低瘤胃甲烷生成是否影響脂肪酸生物氫化途徑進(jìn)的研究尚未見有報(bào)道。所以，本試驗(yàn)選擇在體外培養(yǎng)條件下添加不同濃度延胡索酸二鈉來研究延胡索酸二鈉對(duì)瘤胃發(fā)酵參數(shù)、瘤胃脂肪酸組成以及關(guān)鍵微生物數(shù)量的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選擇3頭體重約為(650±50)kg安裝永久性瘤胃瘺管的水牛作為瘤胃液的供體動(dòng)物。體外發(fā)酵底物的精粗比為40∶60(風(fēng)干基礎(chǔ))，底物飼料分為精飼料(豆粕 25%，玉米15%)和粗飼料(象草60%)，其營(yíng)養(yǎng)成分見表1。試驗(yàn)所用豆粕、玉米、象草均采自廣西水牛研究所，經(jīng)65 ℃烘干制成風(fēng)干樣后，粉碎過40目篩用于體外發(fā)酵。通過體外批次培養(yǎng)法(重復(fù)試驗(yàn)2次，2次對(duì)照組產(chǎn)氣量相對(duì)偏差小于10%)，采用單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)，共設(shè)4個(gè)組，每組處理設(shè)5個(gè)重復(fù)，延胡索酸二鈉(分析純)添加水平分別為0(對(duì)照)、1、2、3 mg/mL(mL指瘤胃緩沖液和瘤胃液的總體積)，在每組各添加0.25 mg/mL的α-亞麻酸(純度≥99%，購于美國(guó)Sigma公司)，為了更好觀察脂肪酸生物氫化過程。在體外試驗(yàn)培養(yǎng)3、6、9 、12、24 h時(shí)，分別測(cè)定產(chǎn)氣量和甲烷含量。在培養(yǎng)24 h結(jié)束后測(cè)定培養(yǎng)液pH值、氨態(tài)氮(NH3-N)、微生物蛋白(MCP)、揮發(fā)性脂肪酸(VFA)、脂肪酸及關(guān)鍵瘤胃微生物數(shù)量。

表1 底物組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

1.2 培養(yǎng)方法

采用體外批次培養(yǎng)法，人工瘤胃緩沖液的配制參照Menke等[8]的方法。根據(jù)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，準(zhǔn)確稱取發(fā)酵底物500 mg(300 mg象草粉+125 mg豆粕粉+75 mg玉米粉)，置入180 mL厭氧培養(yǎng)瓶中，分別添加不同劑量的延胡索酸二鈉。將乳化后的α-亞麻酸液按相應(yīng)設(shè)定比例加入到培養(yǎng)瓶中，持續(xù)通入CO2氣體保持厭氧環(huán)境，加入人工瘤胃緩沖液40 mL，然后用橡膠塞和鋁蓋密閉，置于39 ℃水浴鍋預(yù)熱。在早飼前抽取3只瘺管水牛的瘤胃液，混合后經(jīng)4層紗布過濾，將過濾后的瘤胃液，加入經(jīng)預(yù)熱處理過、且有充足CO2氣體的保溫瓶中，密封帶回實(shí)驗(yàn)室。抽取瘤胃液20 mL加入到已升溫至39 ℃的培養(yǎng)瓶中，混勻。置于恒溫水浴搖床中，水浴溫度(39.0±0.5)℃，振蕩頻率50 r/min。

1.3 檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.3.1 總產(chǎn)氣量和甲烷產(chǎn)量的測(cè)定

在體外培養(yǎng)3、6、9 、12、24 h時(shí)，分別測(cè)定產(chǎn)氣量和甲烷產(chǎn)量。取一注射器針頭，用一軟細(xì)短管將100 mL潤(rùn)滑的玻璃注射器與針頭連接，將針頭插入發(fā)酵瓶橡膠塞，讀取注射器上的刻度并記錄數(shù)據(jù)，測(cè)定方法參考文獻(xiàn)[9]。

培養(yǎng)瓶?jī)舢a(chǎn)氣量=時(shí)間段產(chǎn)氣量-對(duì)應(yīng)時(shí)間段空白均產(chǎn)氣量。

24 h累積總產(chǎn)氣量即各時(shí)間段培養(yǎng)瓶?jī)舢a(chǎn)氣量相加之和。

用注射器測(cè)完產(chǎn)氣量后，旋轉(zhuǎn)管塞排出管內(nèi)氣體，然后再測(cè)定甲烷含量。甲烷含量利用氣相色譜儀(Agilent 7890A，美國(guó)安捷倫科技公司)測(cè)定。用手動(dòng)進(jìn)樣針從發(fā)酵瓶抽取10 μL氣體，直接進(jìn)樣至氣相色譜儀，色譜柱為 HP-INNOWAX (19091N-133) 毛細(xì)管柱，規(guī)格為30 m × 0.25 mm × 0.25 μm 。測(cè)定條件為：柱溫80 ℃；氣化室溫度100 ℃；檢測(cè)室溫度120 ℃；載氣為高純氮?dú)?壓力為179.5 pa，總流量為46.2 mL/min，柱流量為2.7 mL/min，分流比15∶1，吹掃流量3 mL/min，循環(huán)流量100 mL/min)，氫氣流量40 mL/min，空氣流量400 mL/min。

1.3.2 體外發(fā)酵參數(shù)的測(cè)定

pH值測(cè)定：在瘤胃培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h結(jié)束后時(shí)，將發(fā)酵瓶取出馬上放進(jìn)冰水混合物中，冷卻15 min終止發(fā)酵。開瓶檢測(cè)瘤胃培養(yǎng)液pH值，測(cè)定前將pH計(jì)(HANNA HI 8424，上海何亦儀器儀表有限公司)先用緩沖液進(jìn)行校正，然后取10 mL培養(yǎng)液，用pH計(jì)測(cè)定培養(yǎng)液pH值。

NH3-N含量的測(cè)定：在培養(yǎng)24 h結(jié)束時(shí)，吸取4 mL培養(yǎng)液，加入4 mL 0.2 mol/L HCl進(jìn)行酸化，冷凍保存。在4 ℃下解凍，采用苯酚-次氯酸鈉比色法[10]，用紫外可見分光光度計(jì)(PE Lambda 35，上海普迪生物技術(shù)有限公司)，在630 nm波長(zhǎng)條件下比色，根據(jù)吸光度和標(biāo)準(zhǔn)曲線換算出NH3-N含量。

MCP含量的測(cè)定：在培養(yǎng)24 h結(jié)束時(shí)，吸取8 mL培養(yǎng)液于離心管里，冷凍保存待測(cè)。測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)G250染色法，必要時(shí)可稀釋，用紫外可見分光光度計(jì)(PE Lambda 35，上海普迪生物技術(shù)有限公司)在595 nm波長(zhǎng)條件下比色，根據(jù)吸光度和標(biāo)準(zhǔn)曲線換算出MCP含量。

VFA含量的測(cè)定：在培養(yǎng)24 h 結(jié)束時(shí)，吸取1 mL 培養(yǎng)液，加入8.2%的偏磷酸0.5 mL，4 ℃下，20 000 g離心10 min，取離心后的上清液920 μL，加入內(nèi)標(biāo)物巴豆酸(1 mol/L)80 μL，采用氣相色譜儀測(cè)定。測(cè)定條件：氣化室溫度200 ℃；檢測(cè)室溫度220 ℃；柱溫采用程序升溫，80 ℃持續(xù)1 min，以15 ℃/min升溫至170 ℃后維持1.5 min；載氣為高純氮?dú)?壓力100 kpa，總流量63.8 mL/min，柱流量1.19 mL/min，分流比50∶1，吹掃流量3 mL/min，循環(huán)流量30 mL/min)；氫氣流量40 mL/min，空氣流量400 mL/min；進(jìn)樣量2.0 μL。

1.3.3 瘤胃液中長(zhǎng)鏈脂肪酸含量的測(cè)定

瘤胃液中長(zhǎng)鏈脂肪酸含量的測(cè)定參照Tianle等[11]方法，利用氣相色譜儀，應(yīng)用毛細(xì)管氣相色譜-氫火焰離子化檢測(cè)器(GC-FID)，自動(dòng)進(jìn)樣器(Agilent G4513A，美國(guó)安捷倫科技公司)，HP-88脂肪酸甲酯測(cè)定專用毛細(xì)管柱，C17:0內(nèi)標(biāo)法檢測(cè)中長(zhǎng)鏈脂肪酸含量。

1.3.4 瘤胃微生物數(shù)量的測(cè)定

瘤胃液微生物總DNA的提取參照Denman等[12]的方法，采用十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)法提取DNA。用超微量分光光度計(jì)(NanoDrop ND-2000，北京欣興強(qiáng)森生物科技有限公司 )測(cè)定DNA的純度和濃度。

瘤胃液微生物數(shù)量的測(cè)定采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，儀器是高通量實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(LightCycler 480，美國(guó))，具體操作參照Shingfield等[13]方法。瘤胃液微生物的引物序列見表2，引物由上海生工生物工程公司合成。

表2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用Excel軟件整理統(tǒng)計(jì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)，SPSS 18.0 統(tǒng)計(jì)軟件ANOVA過程進(jìn)行單因子方差分析，差異顯著性以P<0.05為判斷標(biāo)準(zhǔn)，試驗(yàn)結(jié)果以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。

2 結(jié)果

2.1 添加延胡索酸二鈉對(duì)體外發(fā)酵總產(chǎn)氣量和甲烷產(chǎn)量的影響

不同濃度延胡索酸二鈉對(duì)體外發(fā)酵24 h累積總產(chǎn)氣量和甲烷產(chǎn)量的影響見表3。由表3可得知，添加延胡索酸二鈉對(duì)體外發(fā)酵24 h累積總產(chǎn)氣量和甲烷產(chǎn)量沒有顯著性影響(P>0.05)。

表3 不同濃度延胡索酸二鈉對(duì)體外發(fā)酵總產(chǎn)氣量和甲烷產(chǎn)量的影響

2.2 添加不同濃度延胡索酸二鈉對(duì)瘤胃體外發(fā)酵發(fā)酵參數(shù)的影響

添加不同濃度延胡索酸二鈉對(duì)體外發(fā)酵參數(shù)的影響見表4。添加2 mg/mL、3 mg/mL延胡索酸二鈉，其培養(yǎng)液的pH值、TVFA含量均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；丙酸含量也隨著延胡索酸二鈉添加量的增加而顯著升高(P<0.05)，乙酸/丙酸隨著延胡索酸二鈉添加量的增加而顯著降低(P<0.05)。添加延胡索酸二鈉對(duì)其他幾種VFA含量的影響差異不顯著(P>0.05)。添加延胡索酸二鈉對(duì)NH3-N濃度和MCP含量沒有顯著性影響(P>0.05)。

表4 不同濃度延胡索酸二鈉對(duì)瘤胃體外發(fā)酵參數(shù)的影響

2.3 添加不同濃度延胡索酸二鈉對(duì)瘤胃脂肪酸組成的影響

添加不同濃度延胡索酸二鈉對(duì)瘤胃脂肪酸組成的影響見表5。添加延胡索酸二鈉后，C18:3n6含量顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；添加3 mg/mL延胡索酸二鈉，C6:0、C8:0和C14:1n5含量顯著低于對(duì)照組(P<0.05)；添加1 mg/mL延胡索酸二鈉，C18:2n6c、c9,t11-CLA和C20:1含量顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；添加1 mg/mL、2 mg/mL延胡索酸二鈉組C22:2n6含量顯著高于其他組(P<0.05)；添加延胡索酸二鈉對(duì)其他脂肪酸組成的含量影響差異不顯著(P>0.05)。

表5 不同濃度延胡索酸二鈉對(duì)瘤胃脂肪酸組成的影響 μg/mL

2.4 添加不同濃度延胡索酸二鈉對(duì)瘤胃相關(guān)微生物數(shù)量的影響

不同濃度延胡索酸二鈉對(duì)瘤胃微生物數(shù)量的影響見表6。添加2 mg/mL延胡索酸二鈉，瘤胃液的真菌、溶纖維丁酸弧菌、非典型丁酸弧菌和蛋白分解丁酸弧菌的數(shù)量顯著升高(P<0.05)；添加2 mg/mL和3 mg/mL延胡索酸二鈉，瘤胃液的原蟲和產(chǎn)甲烷菌的數(shù)量顯著高于其他組，且呈現(xiàn)相同的趨勢(shì)；添加3 mg/mL延胡索酸二鈉，瘤胃液的亨氏丁酸弧菌數(shù)量顯著升高(P<0.05)；添加延胡索酸二鈉對(duì)瘤胃液的總細(xì)菌數(shù)量影響差異不顯著(P>0.05)。

表6 不同濃度延胡索酸二鈉對(duì)瘤胃微生物數(shù)量的影響 copies/mL

3 討論

延胡索酸二鈉具有甲烷抑制潛能，在反芻動(dòng)物中的應(yīng)用已被多人研究。Baraz等[17]利用體外發(fā)酵，在飼料精粗比為50∶50的底物中添加8、10、12 mmol/L延胡索酸二鈉顯著降低了甲烷的產(chǎn)量，但對(duì)總產(chǎn)氣量影響不顯著。毛勝勇等[18]發(fā)現(xiàn)在不同日糧中添加4、7 mmol/L延胡索酸二鈉，能顯著提高累積產(chǎn)氣量，降低甲烷產(chǎn)量，且在高牧草日糧組下降幅度最大。在本研究中，添加延胡索酸二鈉對(duì)總產(chǎn)氣量和甲烷產(chǎn)量影響差異不顯著。本研究結(jié)果與以上報(bào)道不完全相同，原因可能是發(fā)酵底物和延胡索酸二鈉添加量不同，最終通過延胡索酸-琥珀酸途徑利用氫數(shù)量有所不同，進(jìn)而導(dǎo)致在延胡索酸影響甲烷生成的效果上出現(xiàn)差異。毛勝勇等[18]曾報(bào)道，延胡索酸二鈉抑制甲烷生成的效應(yīng)，與發(fā)酵底物的天然特性有關(guān)，其中粗飼料添加比例越高，甲烷減少量越顯著。

瘤胃pH值、NH3-N、MCP和VFA都是反映瘤胃內(nèi)環(huán)境和瘤胃發(fā)酵模式的重要參數(shù)。本試驗(yàn)添加延胡索酸二鈉后，瘤胃發(fā)酵液的pH值顯著升高，對(duì)NH3-N濃度和MCP含量沒有顯著性影響。賴瀚卿等[19]研究表明，延胡索酸二鈉能夠顯著提高瘤胃pH值，延胡索酸二鈉具有一定的緩沖作用，可避免瘤胃過酸的不良影響。Yu等[3]利用體外培養(yǎng)法，在日糧中添加延胡索酸鹽，NH3-N濃度隨延胡索酸鹽添加量的增加顯著降低，并能促進(jìn)對(duì)纖維素的分解。因?yàn)檠雍魉猁}能夠促進(jìn)纖維分解菌等微生物對(duì)NH3-N的利用[3]，使瘤胃NH3-N濃度降低。姜宇晨等[20]發(fā)現(xiàn)，添加1%和2%延胡索酸二鈉，瘤胃液丙酸和TVFA濃度升高，NH3-N濃度降低，但添加3%延胡索酸二鈉，則瘤胃液NH3-N濃度上升，說明添加適量延胡索酸二鈉可以促進(jìn)游離氨氮形成微生物蛋白，有利于瘤胃發(fā)酵。Jin等[21]研究發(fā)現(xiàn)，體外添加延胡索酸二鈉增加了丙酸、戊酸和TVFA濃度。Remling等[22]的研究也表明，添加延胡索酸二鈉會(huì)提高乙酸和丙酸的含量，降低乙酸/丙酸。本研究添加延胡索酸二鈉，顯著提高了丙酸、TVFA產(chǎn)量，降低乙酸/丙酸，但對(duì)乙酸產(chǎn)量影響差異不顯著。表明了延胡索酸二鈉提高了瘤胃發(fā)酵能力，原因可能包括延胡索酸本身發(fā)酵和延胡索酸對(duì)整個(gè)發(fā)酵過程的影響。添加延胡索酸二鈉瘤胃丙酸含量顯著增加，可能意味著某些微生物能夠與產(chǎn)甲烷菌競(jìng)爭(zhēng)氫，將原本用于甲烷生成的氫，轉(zhuǎn)移到生成延胡索酸二鈉還原途徑上，進(jìn)而形成丙酸。

瘤胃中脂肪酸的代謝，對(duì)反芻動(dòng)物乳和肉中脂肪酸組成及比例有重要影響，瘤胃中的微生物可影響多不飽和脂肪酸向飽和脂肪酸的轉(zhuǎn)化，這一過程稱為生物氫化。共軛亞油酸(CLA)主要就是由亞油酸和亞麻酸的異構(gòu)化和不完全氫化作用形成的。脂肪酸氫化是利用還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)途徑進(jìn)行氫的轉(zhuǎn)移。延胡索酸在瘤胃中可以還原成琥珀酸，進(jìn)一步形成丙酸，此過程消耗氫。所以延胡索酸可能會(huì)通過干擾電子的轉(zhuǎn)移來影響脂肪酸生物氫化。Ke等[23]在了青貯苜蓿添加蘋果酸和檸檬酸，發(fā)現(xiàn)降低了飽和脂肪酸的比例，提高了多不飽和脂肪酸的比例，并且檸檬酸對(duì)青貯苜蓿脂肪酸生物加氫的抑制作用最強(qiáng)。此外，丁酸弧菌屬細(xì)菌在瘤胃脂肪酸生物氫化中起重要作用[24]。Yang等[25]認(rèn)為，丁酸弧菌數(shù)量的增加不影響脂肪酸生物氫化反應(yīng)的進(jìn)行，而王亞萍[26]認(rèn)為，溶纖維丁酸弧菌、非典型丁酸弧菌、假丁酸弧菌屬在內(nèi)的一種或多種丁酸菌屬的氫化菌數(shù)量增加會(huì)抑制瘤胃trans-10氫化路徑。在本研究中，添加2 mg/mL延胡索酸二鈉，瘤胃液的溶纖維丁酸弧菌、非典型丁酸弧菌、亨氏丁酸弧菌和蛋白分解丁酸弧菌數(shù)量升高，添加1 mg/mL、2 mg/mL延胡索酸二鈉，VFA含量分別升高24.37%、26.37%，且1 mg/mL延胡索酸二鈉顯著提高了c9,t11-CLA含量。低濃度的延胡索酸二鈉(1 mg/mL和2 mg/mL)可促進(jìn)丁酸弧菌生長(zhǎng)及提高VFA含量，隨著延胡索酸二鈉濃度的升高，丁酸弧菌數(shù)量和VFA反而逐漸恢復(fù)到與對(duì)照組基本一致的狀態(tài)，但產(chǎn)甲烷菌數(shù)量反而達(dá)到最高值。推測(cè)原因是：低濃度的延胡索酸二鈉可促進(jìn)丁酸弧菌對(duì)氫的利用，從而降低了可用于脂肪酸生物氫化途徑的氫，但高濃度情況下丁酸弧菌對(duì)氫的利用能力減弱，導(dǎo)致丁酸弧菌無法與產(chǎn)甲烷菌競(jìng)爭(zhēng)氫。此結(jié)果與上述他人結(jié)果有所不同，因?yàn)樯餁浠€受到多種因素的影響，包括飼糧中脂肪酸不飽和程度、微生物種類和瘤胃發(fā)酵條件等[27]。

反芻動(dòng)物的瘤胃內(nèi)存在著大量的嚴(yán)格厭氧微生物，包括原蟲、厭氧真菌和細(xì)菌等。毛勝勇等[28]發(fā)現(xiàn)，延胡索酸二鈉具有促進(jìn)瘤胃微生物增殖的作用，從而提高累積產(chǎn)氣量，降低甲烷產(chǎn)量，但在體外單獨(dú)培養(yǎng)真菌添加延胡索酸二鈉，延胡索酸二鈉抑制了瘤胃真菌的增殖[18]。Yang等[29]也報(bào)道，在不同精粗比飼料中添加延胡索酸二鈉，可以改變產(chǎn)甲烷菌和真菌的豐度，但沒有影響到甲烷的產(chǎn)量。在本研究中添加2 mg/mL和3 mg/mL延胡索酸二鈉，提高了產(chǎn)甲烷菌、原蟲和丁酸弧菌數(shù)量，但是對(duì)甲烷生成量沒有顯著影響。此研究結(jié)果與他人報(bào)道不太一致，延胡索酸二鈉對(duì)產(chǎn)甲烷菌和甲烷產(chǎn)量的影響效果不同，主要還是因?yàn)檠雍魉岫c添加量、飼喂方式及瘤胃發(fā)酵狀況不同所致。由此可得，產(chǎn)甲烷菌的多少不能直接決定甲烷的產(chǎn)量，產(chǎn)甲烷菌影響甲烷產(chǎn)量的機(jī)理比較復(fù)雜，還有待研究。

4 結(jié)論

在體外條件下添加1 mg/mL延胡索酸二鈉可以提高c9,t11-CLA含量，2 mg/mL和3 mg/mL延胡索酸二鈉可以提高TVFA含量，增加瘤胃真菌、原蟲、甲烷菌和丁酸弧菌的數(shù)量，促進(jìn)了水牛瘤胃發(fā)酵性能。添加1～3 mg/mL延胡索酸二鈉均能提高丙酸含量，但對(duì)甲烷產(chǎn)量沒有顯著影響。