許晴雨，許靜怡，蔡沛蓉，鄒輝，顧建紅，袁燕，劉學忠，劉宗平，卞建春*

(1. 揚州大學獸醫(yī)學院，江蘇 揚州 225009；2. 江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 揚州 225009)

玉米赤霉烯酮(zearalenone，ZEA)，又名F-2毒素，是真菌的二級代謝產(chǎn)物，可通過被污染的谷類食物進入動物和人體內(nèi)。ZEA具有類似雌激素的作用，對生殖系統(tǒng)有明顯的危害，可導致家畜、家禽發(fā)生過量雌激素樣的代謝綜合征[1]。懷孕動物食用含有ZEA的食物會導致流產(chǎn)、死產(chǎn)和胎兒缺陷，雄性動物食用易發(fā)生睪丸萎縮、精子活性降低、精子發(fā)生障礙等現(xiàn)象。

雄性動物的睪丸主要分為生精小管與管間間質(zhì)兩個部分。睪丸管間間質(zhì)中的細胞即為睪丸間質(zhì)細胞，雄性激素主要由睪丸間質(zhì)細胞分泌[2]。研究表明，ZEA可通過引起睪丸間質(zhì)細胞發(fā)生氧化應激并產(chǎn)生凋亡，從而干擾雄性生殖系統(tǒng)功能。SIRT1為 NAD-依賴性去乙酰化酶，屬于Sirtuin-1家族，其主要功能是去除蛋白質(zhì)上的乙酰基團(去乙?；?，這一功能在一些生物學過程中發(fā)揮著重要作用，如SIRTI能通過脫乙?；疐OXO3 (上調(diào)CAT和Mn-SOD)來間接減輕細胞的氧化應激[3]，SIRT1的抑制會降低細胞的應激抵抗，進而促進細胞凋亡[4]；SIRT1 還主要通過FOXO3來調(diào)節(jié)細胞周期阻滯，高活性的SIRT1有利于細胞生存。SIRT1活性受到細胞中NAD+水平的嚴格調(diào)控。白藜蘆醇(resveratrol，RSV)作為COX-1選擇性生物抑制殺菌劑，被廣泛發(fā)現(xiàn)于植物葡萄皮和果皮等植物中，它能夠抑制細胞中NADPH的合成。在哺乳動物體內(nèi)，RSV能激活SIRT1基因組的表達，并且通過改變SIRT1的構象使其更易于與底物結合[5]。本試驗以小鼠睪丸間質(zhì)細胞系(TM3細胞)為研究對象，觀察了在RSV的激活下，SIRT1 對于ZEA致睪丸間質(zhì)細胞的氧化損傷及細胞凋亡的調(diào)控作用。本研究可以為制定ZEA雄性生殖毒性的防控措施提供參考。

1 材料與方法

1.1 細胞

TM3細胞(小鼠細胞睪丸間質(zhì)細胞系)購自中國科學院細胞庫。

1.2 主要試劑

玉米赤霉烯酮(Sigma，USA)；白藜蘆醇(索萊寶，中國北京)；CCK-8細胞檢測試劑盒、過氧化氫酶(CAT)測定試劑盒、丙二醛(MDA)測定試劑盒(DOJINDO，Japan)；活性氧熒光(DCFH-DA)探針、胎馬血清、胎牛血清(Gibco，USA)；雙抗(青霉素,鏈霉素)、谷氨酰胺、胰蛋白酶及其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 CCK-8法檢測TM3細胞活率的影響

96孔板(5×103個/孔)接種TM3細胞，待細胞生長至穩(wěn)定狀態(tài)的細胞，分別用0、2.5、5、10、15、20 μmol/L的ZEA對TM3處理24 h，用0、2.5、5、10、15、20、30 μmol/L的RSV對TM3處理24 h，每個濃度設3個重復。按CCK-8∶培養(yǎng)基=1∶10的比例配置預混液，棄去染毒的培養(yǎng)液，預混液以100 μL/孔加入，培養(yǎng)3 h后，用酶標儀在450 nm處測定細胞的吸光度值(OD值)，并計算細胞活率。

計算公式：細胞活率=[(OD試驗-OD空白)/(OD對照-OD空白)]×100%。

1.4 qRT-PCR檢測細胞SIRT1、SOD和GSH-Px基因表達

將細胞接種在60 孔板中，分成4組，分別設置對照(CON)組、ZEA組(10 μmol/L)、RSV組(5 μmol/L)、RSV+ZEA組(先用5 μmol/L RSV處理30 min，再用10 μmol/L ZEA共處理24 h)，每組設3個重復并處理24 h。隨后進行細胞處理，加入預冷PBS，進行1次洗滌，通過Trizol法提取細胞內(nèi)的總RNA，使用主混合物(Vazyme)試劑盒Hiscript ⅢRTSuperMix for qPCR進行反轉錄，隨后，將每個樣品重復3次進行分析，并使用ChamQ SYBR qPCR為Vazyme，制備體積為20 μL的反應混合物。以GAPDH為內(nèi)參基因，引物序列如表1和表2所示。以基因表達體現(xiàn)倍數(shù)變化;通過 2-ΔΔCt進行結果分析。

表1 qRT-PCR檢測SIRT1基因表達引物序列

表2 qRT-PCR檢測SOD和GSH-Px基因表達引物序列

1.5 實時無標記細胞分析技術(RTCA) 檢測細胞活性

將TM3細胞接種在16 孔E-plate檢測板中(1×104個/孔)，待細胞生長至對數(shù)生長期，進行染毒和藥物處理。設置CON組、ZEA組(10 μmol/L)、RSV組(5 μmol/L)、RSV+ZEA組(先用5 μmol/L RSV處理30 min，再用10 μmol/L ZEA共處理24 h)，每組重復3次，使用RTCA儀監(jiān)測細胞電阻抗值，每15 min記錄一次細胞指數(shù)。

1.6 DCFH-DA熒光探針法檢測TM3細胞活性氧(ROS)水平

將TM3接種于6 孔板(4×105個/孔)，待細胞生長至穩(wěn)定的細胞狀態(tài)時，分別設置CON組、ZEA組(10 μmol/L)、RSV組(5 μmol/L)、RSV+ZEA組(先用5 μmol/L RSV處理30 min，再用10 μmol/L ZEA共處理24 h)，細胞染毒24 h。在待處理的時間中，按DCFH-DA∶培養(yǎng)基=1∶1 000的比例加入探針，暗箱孵育30 min。收集細胞，用滅菌的PBS緩沖液洗滌。用500 μL PBS進行細胞重懸，細胞ROS水平采用流式細胞儀檢測。

1.7 TM3細胞內(nèi)丙二醛(MDA)和過氧化氫酶(CAT)含量檢測

將細胞接種在60 mm培養(yǎng)皿中，分別設置CON組、ZEA組(10 μmol/L)、RSV組(5 μmol/L)、RSV+ZEA組(先用5 μmol/L RSV處理30 min，再用10 μmol/L ZEA共處理24 h)，每組進行3組重復并處理24 h。處理期間采用預冷PBS緩沖液進行2次洗滌，加入100 μL細胞裂解液并進行超聲破碎細胞。隨后，分別按照過氧化氫酶(CAT)測定試劑盒和丙二醛(MDA)測定試劑盒的說明書，檢測細胞內(nèi)的MDA及CAT水平。

1.8 吖啶橙/溴乙錠AO/EB染色法檢測細胞凋亡

采用24孔板(4×104個/孔)接種TM3，待細胞生長至細胞狀態(tài)穩(wěn)定時，分別設置CON組、ZEA組(10 μmol/L)、RSV組(5 μmol/L)、RSV+ZEA組(先用5 μmol/L RSV處理30 min，再用10 μmol/L ZEA共處理24 h)，細胞染毒24 h。提前配置熒光染色液。將10倍的buffer稀釋為1倍，將5 μL的AO試劑及5 μL 的EB試劑加入90 μL 1× Buffer中，充分混勻。待細胞處理時間到，將含毒的培養(yǎng)基棄去，加入預冷的無菌PBS洗滌細胞2次，隨后加入熒光染色液避光孵育5 min，棄去熒光液并加入200 μL PBS，倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.9 統(tǒng)計方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件對試驗組間差異進行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)結果以“平均數(shù)±標準差”表示。相關性檢驗采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，P<0.05表示結果差異顯著，P<0.01表示差異極顯著，P>0.05差異不顯著。

2 結果

2.1 ZEA和RSV暴露對TM3細胞的毒性影響

用CCK-8法檢測不同濃度ZEA(0、2.5、5、10、15、20 μmol/L)對TM3 的細胞毒性作用，結果如圖1A所示。隨著ZEA染毒濃度的增大，TM3細胞活性逐漸下降，與對照組相比，當ZEA濃度在10、15、20 μmol/L，細胞的活性呈現(xiàn)極顯著性下降。進一步檢測RSV(0、2.5、5、10、15、20、30 μmol/L)對TM3細胞活性的影響，結果如圖1B所示。2.5、5 μmol/L RSV對細胞活性不具備顯著影響。因此以下試驗選擇10 μmol/L ZEA及5 μmol/L RSV作為試驗濃度。

與對照組相比，*表示P<0.05，**表示P<0.01。下同

2.2 ZEA暴露對TM3細胞SIRT1基因表達的影響及RSV的激活作用

通過qRT-PCR檢測TM3細胞內(nèi)SIRT1基因表達，結果如圖2所示。與對照組相比，ZEA能極顯著抑制SIRT1基因表達；與ZEA處理組相比，加入RSV后可以有效激活SIRT1基因。

與ZEA處理組相比，#表示P<0.05，##表示P<0.01。下同

2.3 ZEA暴露對TM3細胞增殖活性影響及RSV激活SIRT1后的保護效應

TM3細胞接種16E-plate后，約10 h后進入對數(shù)增長期，在細胞生長穩(wěn)定后24 h進行染毒處理。RTCA試驗結果顯示，與對照組相比，ZEA組細胞指數(shù)有明顯下降；與ZEA處理組相比，RSV+ZEA組的細胞指數(shù)升高，表明RSV激活SIRT1基因后可部分緩解ZEA所導致的TM3的細胞毒性(圖3)。

圖3 TM3細胞活性變化情況

2.4 ZEA暴露對TM3細胞內(nèi)ROS水平的影響及RSV激活SIRT1后的保護效應

細胞染毒處理24 h后，檢測TM3細胞的ROS水平(流式細胞術)，試驗結果表明，與對照組比，ZEA組細胞內(nèi)的ROS水平顯著性上升(P<0.01)。與ZEA組相比，ZEA+RSV組細胞內(nèi)ROS水平出現(xiàn)下降趨勢但不呈現(xiàn)顯著性(P>0.05)。

圖4 TM3細胞內(nèi)ROS水平變化情況

2.5 ZEA暴露對TM3細胞內(nèi)MDA及CAT的影響及RSV激活SIRT1后的保護效應

TM3細胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化物MDA水平的檢測結果如圖5A所示。ZEA可以顯著提高TM3細胞內(nèi)的MDA水平(P<0.01)，RSV激活SIRT1基因后MDA水平上升。細胞內(nèi)過氧化氫酶活力CAT檢測結果如圖5B所示。與對照組相比，ZEA組的過氧化氫酶活力顯著性下降(P<0.05)；與ZEA組相比，RSV+ZEA組可以有效緩解ZEA所導致的酶活力下降(P<0.05)。

圖5 TM3細胞的MDA水平(A)和CAT活性(B)情況

2.6 ZEA暴露對TM3細胞凋亡的影響及RSV激活SIRT1后的保護效應

通過AO/EB染色檢測RSV激活SIRT1基因后對ZEA致TM3細胞凋亡的保護作用，其中正常細胞可被AO染色液染成綠色熒光，晚期凋亡的TM3細胞EB可被染色液染為桔紅色。由圖6可以看出，與對照組相比，ZEA組中桔紅色的細胞明顯增多；與ZEA組相比，RSV+ZEA組中桔紅色細胞明顯減少。

圖6 TM3細胞凋亡情況(40×)

2.7 ZEA暴露對TM3細胞GSH-Px和SOD基因表達及影響RSV激活SIRT1后的保護效應

通過qRT-PCR檢測TM3細胞內(nèi)GSH-Px和SOD基因表達，結果見圖7。與對照組相比，ZEA能極顯著抑制GSH-Px和SOD基因表達(圖7A)；與ZEA處理組相比，加入RSV激活SIRT1基因后可以有效減緩GSH-Px和SOD基因表達的下降(圖7B)。

圖7 TM3細胞GSH-Px(A)和SOD(B)基因的表達情況

3 討論

ZEA作為真菌型毒素，具有非甾體雌激素性作用，產(chǎn)生于鐮刀菌屬真菌，急性毒性相對較低，嚙齒動物的口服半數(shù)致死量(LD50)為2 000～20 000 mg/kg[6]。研究結果顯示，ZEA具有雌激素類似作用，能夠干擾動物機體的內(nèi)分泌，是一種可以干擾體內(nèi)環(huán)境的活性物質(zhì)，具有顯著的生殖毒性[1]。精子和雄性激素都是雄性生殖系統(tǒng)產(chǎn)生的，且睪丸間質(zhì)細胞可以并分泌大量的雄激素，約占據(jù)雄性激素的95%[7]。目前，一些研究表明，ZEA對睪丸間質(zhì)細胞的睪酮分泌也有一定的干擾作用，通過誘導TM3細胞活性氧的產(chǎn)生，干擾抗氧化酶SOD、CAT等的活性，引發(fā)脂質(zhì)過氧化物MDA的累積等導致睪丸間質(zhì)細胞發(fā)生氧化應激及凋亡[8]。由此可見ZEA對于養(yǎng)殖業(yè)的經(jīng)濟損失不言而喻。

氧化應激是ZEA導致生殖損傷的主要毒性機制[9]。RSV是一種多酚植物素，存在于多種植物和紅酒中，是一種有效的抗氧化劑[10]。因此，本研究選用RSV增強SIRT1，探討SIRT1在ZEA對TM3的氧化毒性下的調(diào)控作用。試驗前期通過CCK-8法篩選了對TM3具有顯著毒性的ZEA濃度，以及對細胞不產(chǎn)生損害的RSV濃度。qRT-PCR法證明RSV可以有效增強SIRT1的基因表達。RTCA結果驗證了RSV與ZEA共同作用細胞的細胞活性作用。通過用RSV提前預處理細胞，檢測ZEA對TM3細胞的氧化應激相關指標。雖然RSV激活SIRT1基因后沒能顯著性地緩解ZEA導致的ROS上升，但可以顯著性提高CAT活性，有效抑制MDA的過度累積。進一步的試驗證明，RSV激活SIRT1基因后可以有效緩解ZEA導致的GSH-Px和SOD基因表達下降效應，說明在RSV激活SIRT1基因后可以有效對抗ZEA誘導的TM3細胞的氧化應激。

佘進進等[11]研究認為，RSV可以通過下調(diào) ROS 水平，來減少 ZEA 導致的凋亡關鍵蛋白 FasL 的過量表達，降低其與 FasL 的結合，并減少 FADD 與凋亡起始蛋白 Cleaved-caspase8 的表達量，從而減少 ZEA 對 TM4 細胞凋亡的影響。RSV又是SIRT1基因的激活劑[12-14]，SIRT1基因能通過脫乙?；疐OXO3 (上調(diào)CAT和Mn-SOD)來間接減輕細胞的氧化應激，Mn-SOD可以有效降低ROS水平，SIRT1的抑制會降低細胞的應激抵抗，進而促進細胞凋亡。SIRT1 主要依靠調(diào)節(jié)FOXO3的作用來調(diào)節(jié)細胞周期阻滯。RSV預處理細胞之后,會引起SIRTI的表達增加，脫乙?；疐OXO3蛋白，發(fā)揮DNA轉錄調(diào)節(jié)功能，導致下游抗凋亡基因和抗氧化基因等表達增加，使細胞產(chǎn)生氧化應激抵抗、DNA 修復和抗凋亡現(xiàn)象。在本試驗中，通過用AO/EB染色來檢測TM3細胞的凋亡情況，結果表明，RSV激活SIRT1基因后也能抑制ZEA誘導的TM3細胞凋亡，而RSV激活SIRT1基因后，SIRT1具體的調(diào)控路徑還有待進一步研究。