張 亮，金紅梅

吉林省龍井市智新鎮(zhèn)綜合服務(wù)中心，吉林龍井 133400

黑熊是大型獸類，在我國有較大地區(qū)分布，在延邊地區(qū)是一項傳統(tǒng)的特種養(yǎng)殖項目。熊膽是東北的一種特產(chǎn)，有較高的商業(yè)價值，市場上有很多戒酒保肝產(chǎn)品都采自黑熊膽。

本實驗正是從熊血液分離血清中得到的一些抗氧化指標(biāo)來進行采膽熊組和原熊組之間的對比，分析和研究血清中膽紅素含量、超氧化物歧化酶活力等指標(biāo)對黑熊養(yǎng)殖的影響和意義。

1 材料

1.1 試驗動物

黑熊（延吉市白頭山熊場）未經(jīng)采膽手術(shù)的原熊，飼料中添加黃芪等中藥的采膽熊，未經(jīng)飼喂藥物的對照采膽熊。

1.2 受試物及試劑

黑熊血清（延吉市白頭山熊場），丙二醛、堿性磷酸酶等生理生化指標(biāo)測定試劑盒（由南京建成生物工程研究所）。

1.3 試驗設(shè)備

EASY pureⅡ 純水儀、722S型分光光度計，電子天平、高速臺式離心機。

2 方法

2.1 試驗設(shè)計

24只成年黑熊，年齡相近，飼喂的飼料情況相同，健康狀態(tài)相近，按采膽狀況分為A、B、C三組，其中A組是在飼養(yǎng)食物中添加了黃芪等中草藥的采膽熊，B組是未給藥物的對照組采膽熊，C組為未經(jīng)采膽手術(shù)過的原熊。分幾天對這24只黑熊進行麻醉后采血。對采出的血液樣品進行離心處理（2 500轉(zhuǎn)/min），分離出血清。對得到的每個血清樣本進行各項生理生化指標(biāo)的測定，并對A,B,C三組的測定結(jié)果進行對比研究。

2.2 丙二醛（MDA）的測定

過氧化脂質(zhì)降解產(chǎn)物中的丙二醛（MDA）可與硫代巴比妥酸（TBA）縮合，形成紅色產(chǎn)物，在532 nm處有最大吸收峰（因底物為硫代巴比妥酸，所以此法稱TBA法）。實驗時設(shè)定四組測試管，分別為標(biāo)準(zhǔn)管、標(biāo)準(zhǔn)空白管、測定管、測定空白管。其中標(biāo)準(zhǔn)管中加入10 nmol/mL標(biāo)準(zhǔn)品0.06mL，測定管混合試劑2.4mL。標(biāo)準(zhǔn)空白管中加入0.06mL無水乙醇，測定管混合試劑2.4mL。測定管中加入0.06mL測試樣品，2.4mL測定管混合試劑。測定空白管中加0.06mL測試樣品，2.4mL對照管混合試劑。之后所有試管旋渦混勻器混勻，試管口用保鮮膜扎緊，用針頭刺一小孔，95℃水浴40min，取出后流水冷卻，532 nm處，1cm光徑，蒸餾水調(diào)零，測各管吸光度值。

2.3 總膽紅素的測定

重氮法。在強酸性介質(zhì)中，血清中的膽紅素可與工作液（由R1對氨基苯磺酸+鹽酸+十二烷基三甲基氯化銨；R2亞硝酸鈉；膽紅素組成）混合后生成的重氮鹽反應(yīng)，形成紅紫色的偶氮化合物。

實驗時設(shè)定三組試管，即空白管、校準(zhǔn)管、樣品管。其中空白管中加入0.05mL生理鹽水、1mL工作液，校準(zhǔn)管中加入0.05mL校準(zhǔn)品、1mL工作液，樣品管中加入0.05mL樣品、1mL工作液。混勻，在溫度37℃保溫10min，波長546 nm，比色杯光徑1cm以空白管調(diào)零，分別讀取吸光度，計算樣品濃度。

理論計算公式：總膽紅素濃度=（A樣品/A標(biāo)準(zhǔn)）×C標(biāo)準(zhǔn)，標(biāo)準(zhǔn)濃度參考值為29.8g/L。

2.4 堿性磷酸酶（AKP）的測定

對硝基苯磷酸鹽與水在堿性磷酸酶的作用下可生成對硝基苯酚和磷酸鹽。

實驗時首先制備工作液（由R1硝基苯磷酸鹽；R2 2-氨基-2-甲基-1丙醇緩沖液和氯化鎂組成）。設(shè)定兩組試管空白管、樣品管。其中空白管中加工作液1mL、蒸餾水0.02mL，樣品管中加工作液1mL、樣品0.02mL。混合均勻，在反應(yīng)溫度25℃、30℃、37℃保溫60 s，讀取初始吸光度，確定每分鐘吸光度變化△A。

計算AKP（U/L）=(△A樣品/分-△A空白/分)×F

F=Vt/（Vs×消化系數(shù)）×1000=2757，Vt=反應(yīng)總體積，Vs=樣品體積。

3 統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)用x±s表示,用軟件EXCEL進行分析，0.01＜T＜0.05或T＜0.01表示差異顯著及極顯著。

所測定的4項指標(biāo)，按生理作用可分為三組進行對比研究，其中與肝功能血液有關(guān)的生理指標(biāo)有總膽紅素（TBIL）。與抗氧化性有關(guān)的血清指標(biāo)有丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶(SOD)和堿性磷酸酶(AKP)。

3.1 A組給藥采膽熊與B組對照采膽熊的對比結(jié)果

與抗氧化性和肝功能有關(guān)的血清指標(biāo)

3.2 B組對照采膽熊與C組原熊的對比結(jié)果

與抗氧化性和肝功能有關(guān)的血清指標(biāo)

3.3 A、B、C三組的對比結(jié)果

3.3.1 丙二醛MDA的對比情況：由表1和表2對比數(shù)據(jù)顯示，可知A、B間比較差異顯著。表2中B、C間比較，數(shù)據(jù)差異性不顯著。

3.3.2 超氧化物歧化酶SOD的對比情況：由表1和表2數(shù)據(jù)顯示，A、B間有顯著差異，B、C比較則不顯著。

3.3.3 堿性磷酸酶AKP的對比情況：由表1和表2對比數(shù)據(jù)顯示，A、B比較和B、C比較都沒有顯著差異。

3.3.4 總膽紅素TBIL的對比情況：由表1和表2對比數(shù)據(jù)顯示，A、B間差異不顯著和B、C比較都沒有顯著差異。

4 討論

動物血液生化正常參考值為生物醫(yī)學(xué)研究的重要參考指標(biāo)，是臨床醫(yī)療和科學(xué)研究的重要依據(jù)，它不僅對動物正常生理狀態(tài)和飼養(yǎng)管理具有指導(dǎo)意義，而且是病理學(xué)、毒理學(xué)研究以及探討發(fā)病機理等研究中動物選擇的根據(jù)。本實驗對黑熊血清中各項生理生化指標(biāo)的測定為臨床研究和黑熊熊膽的采集生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。本實驗研究顯示，加入黃芪等中藥制劑的采膽熊與對照組比較，加入藥物對采膽熊的肝功能指標(biāo)沒有檢查出好的促進作用，可能是當(dāng)時的采血時藥物的功效還未表現(xiàn)出來或藥物選擇不當(dāng)。

5 結(jié)論

本實驗研究顯示，采膽熊與原熊血液生化指標(biāo)中丙二醛、超氧化物歧化酶呈顯著差異。采膽熊飼喂過程中應(yīng)慎重添加中草藥，為今后黑熊的健康養(yǎng)殖、疾病診斷和預(yù)測積累了資料。