邵輝 李娜 李輝 劉磊 林宏芳 楊麗靜 閆琳 程禹 劉春艷 張玉婷 郭永澤

摘? ? 要：本研究建立了豇豆中噁唑酰草胺及其代謝物HPFMPA、HFMPA、6-CBO殘留量的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）測定方法。采用乙腈提取，PSA凈化，UPLC-MS/MS在多反應(yīng)離子監(jiān)測模式（MRM）下測定，外標(biāo)-標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量方法。結(jié)果表明，豇豆中添加噁唑酰草胺、HPFMPA、HFMPA、6-CBO濃度水平為0.005 ～1.000 mg·kg-1，平均回收率在75%～97%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在5%～13%，定量限在0.005～0.010 mg·kg-1。方法可同時(shí)測定噁唑酰草胺及其代謝物，準(zhǔn)確度高，靈敏度好，特異性強(qiáng)，前處理操作簡單，適用于豇豆中噁唑酰草胺及其代謝物殘留量測定。

關(guān)鍵詞：豇豆;噁唑酰草胺;代謝物;超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法;測定

中圖分類號(hào)：S643.4; O657.63? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A? ? ? ? ? ? ? ? DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2021.05.016

Abstract： An accurate UPLC-MS/MS method for the determination of metamifop and its metabolites HPFMPA，HFMPA，6-CBO in cowpea was developed. Cowpea samples were extracted with acetonitrile， cleaned up by PSA ，and finally determinated by UPLC-MS/MS under multiple reaction monitoring （MRM） mode. The results showed that the concentration levels of metamifop， HPFMPA， HFMPA and 6-CBO added to cowpea were 0.005-1.000 mg·kg-1， the average recoveries of metamifop and its metabolites were between 75% and 97% with the RSDs between 5% and 13%， the limits of quantitation were between 0.005 mg·kg-1 and 0.010 mg·kg-1. The method is qualitative， quantitative， sensitive， specific， simple， suitable for determination of metamifop and its metabolites in cowpea.

Key words： cowpea; metamifop; metabolites; UPLC-MS/MS; determination

噁唑酰草胺，英文名稱為metamifop，化學(xué)名稱為（R）-2-{ （4-氯-1，3-苯并噁唑-2-基氧）苯氧基}-2′-氟-N-甲基丙酰替苯胺，是由韓國化工技術(shù)研究院開發(fā)的芳氧苯氧丙酸酯類除草劑，屬ACC酶抑制劑，能抑制植物脂肪酸的合成，主要用于移栽和直播稻田防除一年生禾本科雜草，有廣泛的可混性，并有望用于其他作物，是一個(gè)很有發(fā)展前景的除草劑[1-3]。噁唑酰草胺在田間施用以后，會(huì)降解為有毒理學(xué)意義的代謝物N-（2-氟苯基）-2-（4-羥基苯氧基）-N-甲基丙酰胺（HPFMPA）、N-（2-氟苯基）-2-羥基-N-甲基丙酰胺（HFMPA）以及6-氯-2-苯噁唑啉酮（6-CBO）。目前國內(nèi)外對于噁唑酰草胺及其代謝物殘留量的測定方法研究已有報(bào)道，如大米中噁唑酰草胺及其代謝物殘留量的高效液相色譜測定法（HPLC）[4-6]，水和糧谷中噁唑酰草胺殘留量的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定法（LC/MS/MS）[7-9]，大米和水中噁唑酰草胺殘留量的液相色譜測定法[10-14]，如水稻、水和土中噁唑酰草胺及其代謝物殘留量的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[15-16]等。但是，尚未有豇豆中噁唑酰草胺及其代謝物殘留量的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）測定法報(bào)道。

基于此，本研究建立了這一方法，為測定豇豆中噁唑酰草胺及其代謝物殘留量和噁唑酰草胺在豇豆上登記使用提供技術(shù)參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 儀器設(shè)備 Acquity UPLC/Xevo TQS micro超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國Waters公司）、T50勻漿機(jī)（德國IKA公司）、0.01 g電子天平（天津天馬衡基儀器有限公司）、CK2000垂直振蕩器（托摩根生物科技有限公司）、3-18KS高速離心機(jī)（德國Sigma公司）、QL-901渦旋振蕩器（江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司）、Milli-Q純水儀（美國Millipore公司）、100 μL移液槍（德國eppendorf公司）。

1.1.2 試劑? 乙腈（分析純，天津市康科德科技有限公司）、鹽酸（分析純，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司）、氯化鈉（分析純，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司）、乙腈（色譜純，德國默克公司）、甲酸（色譜純，德國默克公司）、超純水（Milli-Q純水儀制備）、PSA（顆粒直徑為60 μm，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司）。

噁唑酰草胺（100 mg·L-1，天津阿爾塔科技有限公司）、噁唑酰草胺代謝物HPFMPA（99.1%，杭州宇昊化工科技有限公司）、噁唑酰草胺代謝物HFMPA（98.9%，國家農(nóng)藥質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心（沈陽））、噁唑酰草胺代謝物6-CBO（99.5%，美國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司）。

1.2 測定方法

1.2.1 樣品前處理 稱取5.00 g樣品（精確至0.01 g）于50 mL離心管中，加入5 mL 1 mol·L-1鹽酸，搖勻，再加25 mL乙腈、3.00 g氯化鈉，垂直振蕩5 min，4 000 r·min-1離心5 min。取上清液1.5 mL，加入25 mg PSA，渦旋振蕩1 min，4 000 r·min-1離心5 min，取上清液，過0.22 μm濾膜于進(jìn)樣小瓶中，待測。

1.2.2 儀器條件 色譜柱：Acquity UPLC BEH C18柱 （50×2.1 mm，1.8 μm）;流動(dòng)相：A為乙腈，B為0.1%甲酸水溶液，體積比：A/B=85/15，等度洗脫;流速：0.3 mL·min-1;洗脫時(shí)間：3 min;柱溫：33 ℃;進(jìn)樣量：5 μL。

離子源：電子噴霧離子源;毛細(xì)管電壓：3.0 KV;脫溶劑溫度：450 ℃;離子源溫度：150 ℃;錐孔氣流速：900 L·h-1;脫溶劑氣流速：50 L·h-1。掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM），條件見表1。

1.2.3 定性 在相同儀器條件下進(jìn)行樣品測定，如果檢出的色譜峰的保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)樣品相同，并且在扣除背景后的樣品質(zhì)譜圖中，目標(biāo)化合物選擇的離子均出現(xiàn)，而且同一檢測批次，對同一化合物，樣品中目標(biāo)化合物的離子豐度比與質(zhì)量濃度相當(dāng)?shù)幕|(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液相比一致，則可判斷樣品中存在目標(biāo)農(nóng)藥。

1.2.4 定量 外標(biāo)-基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量殘留量計(jì)算公式如下：

式中，R為樣品中農(nóng)藥殘留量（mg·kg-1）;C為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算的檢測樣品中的農(nóng)藥殘留濃度（mg·L-1）;V為定容體積（mL）;W為代表檢測樣品的樣品質(zhì)量（g）。

殘留量之和計(jì)算公式如下：

R噁唑酰草胺殘留量之和=R噁唑酰草胺 + RHPFMPA ×440.9/289.3+ RHFMPA ×440.9/197.2+ R6-CBO×440.9/169.6（2）

式中，R噁唑酰草胺殘留量之和為噁唑酰草胺殘留量之和（mg·kg-1）;R噁唑酰草胺為噁唑酰草胺殘留量（mg·kg-1）;RHPFMPA為HPFMPA殘留量（mg·kg-1）;RHFMPA-HFMPA殘留量（mg·kg-1）;R6-CBO-6-CBO殘留量（mg·kg-1）。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件的確定

配制噁唑酰草胺及其代謝物溶劑標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，根據(jù)其理化性質(zhì)，在合適的離子模式（正離子模式或負(fù)離子模式）下對進(jìn)行母離子掃描，結(jié)合其分子量，確定母離子大小，然后對錐孔電壓進(jìn)行優(yōu)化，確定母離子響應(yīng)最大時(shí)的錐孔電壓。接下來對母離子施加碰撞電壓進(jìn)行子離子掃描，找到響應(yīng)較大且穩(wěn)定的2個(gè)作為定性子離子，再分別對兩個(gè)子離子進(jìn)行碰撞電壓的優(yōu)化，找到子離子響應(yīng)最大時(shí)的碰撞電壓，最后選擇響應(yīng)較高的子離子作為定量子離子，使儀器靈敏度達(dá)到最佳。同樣的方法，得到噁唑酰草胺、HPFMPA、HFMPA、6-CBO的母離子、錐孔電壓、子離子、碰撞電壓，見表1，基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液譜圖（圖1）。

2.2 前處理方法的確定

本研究采用乙腈提取，乙腈可有效提取大多數(shù)樣品中大多數(shù)農(nóng)藥及其代謝物殘留，且提取出來的影響定性定量的脂類物質(zhì)較少，更為重要的是，通過加入氯化鈉，乙腈相可與水相分層，達(dá)到去除水溶性雜質(zhì)的目的。再加入PSA作為凈化吸附劑，可有效去除樣品中影響農(nóng)殘測定的色素、酸類、糖類等物質(zhì)，降低了基質(zhì)對信號(hào)響應(yīng)的抑制，凈化效果良好，提高了方法靈敏度，保護(hù)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀免受污染和堵塞，可延長儀器壽命并提高穩(wěn)定性，而且噁唑酰草胺及其代謝物的回收率均可以達(dá)到要求。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系分析

用豇豆基質(zhì)空白溶液稀釋，配制噁唑酰草胺/HPFMPA/HFMPA/6-CBO混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液系列濃度0.001/0.0005/0.001/0.001 mg·L-1，0.002/0.001/0.002/0.002 mg·L-1，0.01/0.01/0.01/0.01 mg·L-1，0.05/0.05/0.05/0.05 mg·L-1，0.2/0.2/0.2/0.2 mg·L-1。在上述液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜條件下進(jìn)樣，以化合物濃度為橫坐標(biāo)，以對應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得噁唑酰草胺線性方程為y=1 431 219.2x-181.5，r = 0.999 7;HPFMPA線性方程為y=1 329 521.9x+ 306.1，r=0.999 9;HFMPA線性方程為y=344 752.0x -167.7，r=0.999 7;6-CBO線性方程為y=103 942.3x-107.0，r=0.999 8。線性關(guān)系均良好，標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2。

2.4 方法的特異性

本方法采用多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）掃描模式，先對母離子進(jìn)行掃描，再對母離子產(chǎn)生的子離子進(jìn)行掃描，而且選擇兩對母離子-子離子反應(yīng)掃描來定性定量，保證了基本只對目標(biāo)化合物有響應(yīng)，對雜質(zhì)有良好的區(qū)分能力，可有效地排除假陽性結(jié)果。

2.5 方法的靈敏度

方法的靈敏度以定量限（LOQ）表示。根據(jù)實(shí)測，本方法噁唑酰草胺、HPFMPA、HFMPA、6-CBO的定量限分別為0.01，0.005，0.01，0.01 mg·kg-1，國內(nèi)外均未制定噁唑酰草胺在豇豆中的最大殘留限量（MRL）值，定量限足以達(dá)到農(nóng)藥殘留量測定的要求。

2.6 方法的準(zhǔn)確度和精密度

添加噁唑酰草胺0.01，0.05，1.00 mg·kg-1，平均回收率分別為75%，84%，77%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為6%，8%，5%。添加HPFMPA 0.005，0.050，1.000 mg·kg-1，平均回收率分別為90%，83%，91%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為12%，12%，10%。添加HFMPA 0.01，

0.05，1.00 mg·kg-1，平均回收率分別為90%，90%，82%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為13%，7%，12%。添加6-CBO 0.01，0.05，1.00 mg·kg-1，平均回收率分別為84%，97%，85%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為7%，13%，8%。平均回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均滿足農(nóng)藥殘留量測定的要求，具體見表2。

3 結(jié) 論

不同類型的樣品所含成分不同，樣品中成分可影響待測物的提取效率和儀器響應(yīng)，在一類樣品上建立了檢測方法，在其他類樣品上不一定適用，因此還需要驗(yàn)證、改進(jìn)才能使用。已有文獻(xiàn)報(bào)道的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定噁唑酰草胺及其代謝物殘留量的方法，涉及到的樣品有水、土壤、糙米、稻殼、秸稈。豇豆含水量高、葉綠素含量高、極性雜質(zhì)較多，和前人研究過的樣品大有不同，本研究采用乙腈提取、PSA凈化、超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定、外標(biāo)法定量，建立了豇豆中噁唑酰草胺及其代謝物殘留量的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定方法，拓寬了樣品檢測類型范圍。方法可同時(shí)測定噁唑酰草胺及其代謝物，準(zhǔn)確度高，靈敏度好，特異性強(qiáng)，在實(shí)際樣品測定中準(zhǔn)確高效，可為豇豆中噁唑酰草胺及其代謝物殘留量測定提供技術(shù)支撐。

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