郝廣志,初廣新,劉佳明,梁國標

(解放軍北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院神經外科,沈陽 110016;*通訊作者,E-mail:liangguobiao2011@163.com)

蛛網膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage, SAH)是腦底或腦表淺部位顱內血管破裂引起的出血性中風,是一種常見的出血性腦卒中疾病,具有較高的發(fā)病率和死亡率[1]。其中由腦內動脈瘤破裂導致蛛網膜下腔動脈出血約占85%,即使挽救了患者的生命,幸存者也常伴有神經功能損傷和認知功能障礙,嚴重地影響了患者的生存質量[2]。研究表明SAH后會引起早期腦損傷(early brain injury,EBI),包括顱內壓升高、腦血流和腦灌注壓降低、血腦屏障(BBB)損傷、腦水腫、急性腦血管痙攣和神經元凋亡,是導致蛛網膜下腔出血患者不良預后的重要因素[3-5]。研究表明蛛網膜下腔出血后會出現神經元凋亡的情況[6]。李霞等[7]研究發(fā)現SAH后神經元的凋亡與JNK/c-Jun/caspase-3信號通路密切相關,誘導細胞凋亡過程。提示減輕細胞凋亡可作為減輕SAH后EBI的新靶點。

Bcl-2/Bax凋亡信號通路作為一種調節(jié)細胞凋亡和存活的信號通路,與多種神經系統(tǒng)疾病密切相關[8,9]。潘峰等[10]發(fā)現,在缺血性腦卒中模型大鼠中,Bcl-2蛋白表達水平顯著降低,Bax蛋白表達水平顯著升高,誘導神經元凋亡,造成神經功能障礙。在SAH后,Bcl-2在腦皮質部位的表達呈時間依賴性下降[11]。caspase-3和Bax在下丘腦部位表達量顯著上升,而Bcl-2呈現下降趨勢[12]。但是Bcl-2在蛛網膜下腔出血中誘導神經細胞凋亡的作用機制還需進一步的探究。

微小RNA(miRNA, microRNA)由19-24個核苷酸組成,能結合到目標mRNA上,進而抑制mRNA的翻譯及功能,促進相應mRNA降解。miRNA還可靶向結合到基因啟動子特定區(qū)域并誘導基因表達[13]。研究表明SAH后存在多種miRNAs異常表達的現象[14],miR-448在多種腫瘤細胞中表達異常,如肝癌[15]、非小細胞肺癌[16]等。本課題組前期研究中通過基因芯片篩查發(fā)現miR-448在SAH時表達上調。本研究旨在探討miR-448對蛛網膜下腔出血的作用及機制,為蛛網膜下腔出血的治療提供新方法。

1 材料與方法

1.1 材料

大鼠主動脈血管內皮細胞RAOEC(上海晶抗生物工程有限公司),lipo2000轉染脂質體(美國invitrogen公司),FBS、DMEM培養(yǎng)基(美國Gibco公司),Trizol(美國life technologies公司),氯仿、DEPC(DNase/RNase-free)水、異丙醇(北京鼎國生物技術有限公司),報告基因試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司),NP40裂解液、反轉錄試劑盒、SYBR試劑盒(北京天根生化科技有限公司),抗體:Bcl-2,GAPDH和羊抗兔IgG(北京博奧森公司)。

1.2 模型建立

本研究中使用的所有方案均經北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院動物管理和使用委員會批準。選取體質量在160-180 g之間的成年雄性SD大鼠,購自北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院實驗動物中心,許可證號:SCXL(遼)2014-0002。采用血管內穿刺法[17]構建SAH動物模型,戊巴比妥鈉將大鼠麻醉后,暴露出頸內動脈、頸外動脈和左頸總動脈,結扎左頸外動脈并切開,留下一個3 mm的動脈截塊,通過大腦中動脈分支將尼龍縫合線插入左側,縫合線進一步向前推進約3-5 mm,以刺穿動脈,持續(xù)10 s后有明顯的血流流出即成功建立蛛網膜下腔出血模型;假手術大鼠(sham)采用相同的治療程序,但不刺破血管,血流也無明顯變化。36只大鼠隨機分為兩組:模型組(n=18)和假手術組(n=18)。

1.3 逆轉錄定量實時PCR(real-time PCR)檢測miR-448在SAH腦組織中的表達

在CFX96 TouthTM實時PCR檢測系統(tǒng)(Bio-Rad Lab,Inc.,Hercules,California,U.S.A.)上使用SYBR檢測試劑盒進行實時PCR,使用1 μl模板、0.4 μl正向引物、10 μl 2×mix預混劑(含SYBR和ROX)、0.4 μl反向引物、2 μl cDNA和6.2 μl ddH2O,最終體積為20 μl(均來自天根生物科技)。將每次反應的總體積20 μl轉移到96孔板上,在95 ℃下培養(yǎng)15 min,隨后在94 ℃下5個循環(huán)25 s,65 ℃下培養(yǎng)30 s,72 ℃下培養(yǎng)34 s,然后在94 ℃下45個循環(huán)20 s,60 ℃下培養(yǎng)34 s。所有樣品一式三份。引物序列見表1。

表1 基因引物序列

1.4 Bcl-2在SAH腦組織中的表達

1.4.1 免疫熒光法檢測細胞凋亡情況 造模7 d后,在sham組和SAH組隨機各取4只大鼠,處死,取腦組織,制作石蠟切片。脫蠟至水后,用50 μl的TUNEL反應緩沖液處理15 μm厚的腦切片,并在37 ℃的黑暗和潮濕的環(huán)境中培養(yǎng)1 h,然后在4 ℃的溫度下用Bcl-2抗體(1 ∶2 000,北京博奧森公司)培養(yǎng)過夜。切片用PBS洗滌5次,每次10 min,在室溫下用二抗(Alexafluor488和Alexafluor594,1 ∶200)孵育2 h。然后用PBS再次洗滌切片5次,每次10 min,然后用DAPI染色5 min,再洗滌3次后,用熒光顯微鏡觀察切片。

1.4.2 蛋白質免疫印跡(Western blotting)檢測組織中Bcl-2表達情況 采用NP40裂解液將組織勻漿吹散,于冰上靜置5 min,12 000 r/min,4 ℃離心10 min,然后計算樣本蛋白濃度。取30 μg蛋白進行電泳(80-130 V)、轉印(100 V,1 h);將脫脂奶粉于室溫封閉1 h;加入1 ∶1 000稀釋的抗體Bcl-2和GAPDH,4 ℃孵育過夜,TBST室溫洗3次。二抗37 ℃,45 min;ECL發(fā)光。

1.5 miR-448過表達或低表達的細胞培養(yǎng)

大鼠主動脈血管內皮細胞RAOEC分為:control組、miR-448+AS組和miR-448組,分別轉染無意義小鏈、miR-448+反義鏈miR-448、miR-448。將RAOEC細胞接種于6孔板中,培養(yǎng)24 h,之后更換為無血清培養(yǎng)基,采用lipo2000脂質體試劑(購置于廣州銳博生物科技有限公司),分別向RAOEC轉染無意義小鏈、miR-448+反義鏈miR-448、miR-448獲得。

1.6 miR-448對血管內皮細胞凋亡的影響

分別轉染無意義小鏈、miR-448+反義鏈miR-448、miR-448的大鼠主動脈血管內皮細胞RAOEC,采用Annexin Ⅴ-PI染色,培養(yǎng)24 h后進行消化、離心,收集下層的細胞沉淀,重新制成單細胞懸液。在每管細胞中分別加入500 μl的Binding Buffer重懸細胞,再依次加入5 μl Annexin Ⅴ-FITC和5 μl PI。輕輕混勻,室溫下避光孵育15 min,進行流式檢測。

1.7 miR-448對下游靶基因Bcl-2活性和表達的影響

1.7.1 雙熒光素酶報告基因實驗 為了檢測miR-448對Bcl-2靶向作用,首先用Bcl-2上、下游特異性引物擴增Bcl-2的3′UTR序列。將pMIR-REPORT-Luciferase載體進行SpeⅠ和Hind Ⅲ雙酶切。利用連接酶將Bcl-2的3′UTR序列與pMIR-REPORT-Luciferase載體連接,命名為pMIR-LUC-Bcl-2。其次當RAOEC細胞處于對數生長期時,接種于96孔板,達到70%融合度時進行轉染。將已合成的pMIR-LUC-Bcl-2和pRL-TK分別轉染到control組、miR-448+AS組、miR-448組血管內皮細胞中。24 h后,PBS洗滌2次,裂解緩沖液裂解細胞,加入LAR Ⅱ,檢測螢火蟲熒光素酶活性,隨后立即加入海腎熒光素酶底物Stop & Glo Reagent,立即用酶標儀測定海腎熒光。

1.7.2 蛋白質免疫印跡(Western blotting)檢測細胞中Bcl-2的表達情況 Western blotting檢測方法同1.4.2,在control組、miR-448+AS組、miR-448組血管內皮細胞系中,檢測Bcl-2的蛋白表達情況。

1.8 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 miR-448在SAH腦組織中的表達

RT-PCR檢測大鼠腦組織中miR-448 mRNA的表達情況,發(fā)現在SAH組腦組織中miR-448 mRNA的表達量顯著高于假手術sham組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05,見圖1)。

與sham組比較,*P<0.05圖1 miR-448在SAH腦組織中的表達Figure 1 The expression of miR-448 in SAH brain tissue

2.2 miR-448對血管內皮細胞凋亡的影響

與control組和細胞miR-448低表達的miR-448+AS組相比,miR-448過表達的miR-448組細胞凋亡呈現上升趨勢(見圖2)。

2.3 Bcl-2在SAH腦組織中的表達

TUNEL染色觀察Bcl-2的表達情況,發(fā)現在SAH組腦組織中Bcl-2表達顯著低于sham組(見圖3)。

Western blotting檢測Bcl-2的蛋白表達情況,發(fā)現在SAH組腦組織中Bcl-2的蛋白表達水平顯著低于sham組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05,見圖4)。

與control組和miR-448+AS組比較,*P<0.05圖2 miR-448對血管內皮細胞凋亡的影響Figure 2 The effect of miR-448 on apoptosis of vascular endothelial cells

綠色:TUNEL,紅色:Bcl-2,藍色:DAPI圖3 Bcl-2 在SAH腦組織中的表達Figure 3 The expression of Bcl-2 in SAH brain tissue

與sham組比較,*P<0.05圖4 Bcl-2在SAH腦組織中蛋白表達Figure 4 The protein expression of Bcl-2 in SAH brain tissue

2.4 miR-448對下游靶基因Bcl-2活性和表達的影響

miRDB軟件分析發(fā)現,miR-448與Bcl-2的3′UTR區(qū)域具有結合位點(見圖5)。與control組相比,miR-448組血管內皮細胞中Bcl-2活性顯著降低;與miR-448組相比,miR-448+AS組血管內皮細胞中Bcl-2活性顯著提高(見圖6)。

圖5 A miR-448對Bcl-2的靶向作用Figure 5 The targeting effect of miR-448 on Bcl-2

在過表達或低表達miR-448的血管內皮細胞系中檢測Bcl-2的蛋白表達情況,發(fā)現miR-448可抑制Bcl-2的表達(見圖7)。

與control組比較,#P<0.05;與miR-448組比較,*P<0.05圖6 在血管內皮細胞中miR-448對Bcl-2的活性影響Figure 6 The effect of miR-448 on the activity of Bcl-2 in vascular endothelial cells

與control組比較,#P<0.05;與miR-448組比較,*P<0.05圖7 在血管內皮細胞中miR-448對Bcl-2的表達影響Figure 7 The effect of miR-448 on the expression of Bcl-2 in vascular endothelial cells

3 討論

蛛網膜下腔出血是神經外科常見的腦血管疾病之一,病死率較高,幸存患者由于早期腦損傷和遲發(fā)性腦缺血常常伴有神經功能損傷,是患者SAH不良預后主要原因。在臨床實踐中,對于患者早期腦損傷的干預能夠有效地減少遲發(fā)性神經損傷的發(fā)生,有效提高患者的生存質量[18]。在對SAH后EBI發(fā)生機制研究中發(fā)現,神經元凋亡是導致EBI中神經功能障礙的主要因素[19]。Bcl-2是抗凋亡分子,可通過改變細胞膜的通透性抑制相關促凋亡蛋白的釋放和表達,如細胞色素C等,阻礙細胞凋亡一系列的級聯反應,其表達降低與腫瘤細胞的凋亡率呈正相關[20]。直腸癌相關研究發(fā)現,miR-1915能夠靶向與Bcl-2結合,誘導腫瘤細胞發(fā)生凋亡[21]。本研究發(fā)現在SAH腦組織中Bcl-2蛋白表達水平顯著低于sham組,提示SAH后存在神經細胞凋亡的現象,且Bcl-2蛋白參與神經細胞凋亡過程。

近些年,研究發(fā)現非編碼RNA的生物學功能在腫瘤發(fā)生發(fā)展進程中發(fā)揮重要作用,包括miRNA、IncRNA、circRNA等[22]。miRNA是一類單鏈非編碼小分子RNA,能夠定向與靶基因mRNA結合,抑制其蛋白的翻譯過程,是調節(jié)蛋白質表達的重要調節(jié)因子,其次有研究表明在人腦組織發(fā)生損傷后,腦miRNA表達量會發(fā)生顯著變化[23]。研究表明其在創(chuàng)傷性腦損傷發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用,如細胞凋亡和神經元可塑性等[24]。本課題組前期在SAH組和sham組腦組織中通過芯片篩選得到差異表達的miR-448。本研究通過RT-PCR得到相似結論,提示miR-448在SAH后腦組織損傷中發(fā)揮重要作用。同時miR-448已被證實參與調控多種疾病發(fā)生發(fā)展,在肺腺癌中OIP5-AS1靶向作用miR-448/Bcl-2促進腫瘤細胞的增殖,miR-448-3p通過調節(jié)klf5的表達抑制顱內動脈瘤的發(fā)生發(fā)展[25,26]。為了進一步探究miR-448在SAH后網膜下腔出血發(fā)生發(fā)展作用機制,首先分別構建過表達和低表達miR-448的血管內皮細胞,結果顯示miR-448組細胞凋亡水平顯著高于miR-448+AS組,提示miR-448可促進血管內皮細胞的凋亡。其次,通過miRDB軟件分析,miR-448能夠特異性地結合到Bcl-2的3′UTR區(qū)域,熒光素酶報告基因實驗結果提示miR-448可顯著調節(jié)Bcl-2活性,且在miR-448組細胞系中Bcl-2蛋白表達水平顯著低于低miR-448+AS組,提示miR-448可抑制Bcl-2的表達。

綜上所述,miR-448通過調節(jié)Bcl-2的表達參與蛛網膜下腔出血EBI過程,為加深對SAH后EBI相關病理機制的認識,為臨床治療蛛網膜下腔出血患者腦損傷,減低患者的病死率和傷殘率提供理論數據。接下來本課題將探究參與miR-448/Bcl-2過程的信號通路及其他因子,旨在闡明miR-448在蛛網膜下腔出血中的生物學作用。