姚燕麗 黃宇哲 韓芝斌 曹春玲 吳靜標(biāo)

DNA 甲基化是表觀遺傳學(xué)領(lǐng)域研究的重點之一［1］。DNA 甲基化是指在DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶（DNA methyltransferase，DNMT）的作用下，基因組DNA 序列上CpG 島的二核苷酸5′端胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)?′甲基胞嘧啶。DNA 的異常甲基化通常發(fā)生在腫瘤的超早期，是腫瘤生長的“種子”因素［2］。CpG 存在兩種形式，一種為分散型的中高度重復(fù)序列；另一種為高度聚集，形成CpG 島［3］。CpG 島中的CpG 一般是非甲基化狀態(tài)，其異常甲基化與腫瘤息息相關(guān)。甲基化一般都是連續(xù)發(fā)生的，即某一CpG 位點發(fā)生甲基化，那么該位點上下游一定區(qū)域內(nèi)的CpG 也發(fā)生甲基化。研究表明，基因組啟動子區(qū)甲基化，會改變重要遺傳基因表達(dá)，是導(dǎo)致癌癥發(fā)生的原因之一［3］。隨著癌癥進(jìn)程改變，甲基化也會動態(tài)改變。此外，不同腫瘤的甲基化圖譜也存在明顯的差異。綜上，利用甲基化檢測對腫瘤進(jìn)行早期篩查具有很大應(yīng)用潛力［4］。循環(huán)腫瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA），屬于血液循環(huán)游離DNA（cell-free DNA，cfDNA）的一種，作為近年來腫瘤領(lǐng)域檢測的研究重點，在腫瘤無創(chuàng)前期早篩中具有重要應(yīng)用價值。本文將綜述甲基化的各檢測技術(shù)，對DNA 甲基化的臨床應(yīng)用情況進(jìn)行總結(jié)，分析相關(guān)產(chǎn)品目前存在的技術(shù)難點及未來發(fā)展趨勢。

1 特異位點甲基化檢測方法

有效的甲基化基因檢測手段是應(yīng)用的關(guān)鍵。近年來，市面上出現(xiàn)了不少DNA 甲基化的檢測技術(shù)，發(fā)展已達(dá)十幾種［5-6］，按照技術(shù)類型，分為甲基化特異性擴(kuò)增技術(shù)［如甲基化特異性PCR、甲基化特異性半巢式/巢式PCR、甲基化敏感性限制性內(nèi)切酶（methylation-sensitive restriction Endonuclease，MS-RE）-PCR/Southern 法）、甲基化測序檢測分析技術(shù)（如亞硫酸氫鹽測序、簡化表觀亞硫酸氫鹽測序、甲基化敏感性單核苷酸引物延伸（methylation-sensitive single nucleotide primer extension，Ms-SnuPE）］、甲基化基因芯片及圖譜檢測技術(shù)［如甲基化特異性寡核苷酸芯片、限制性酶切基因掃描技術(shù)、甲基化敏感性單鏈構(gòu)象分析（methylation-specific single-strand conformation analysis，MS-SSCA）］、甲基化傳感器檢測分析技術(shù)（如基于OsO4 氧化的電化學(xué)傳感器、化學(xué)氧化裂解誘導(dǎo)的指數(shù)擴(kuò)增反應(yīng)、基于比例競爭型定量PCR 的橫向流動核酸生物傳感器）［7］，此外，磁珠和油包水微液滴結(jié)構(gòu)的數(shù)字PCR 技術(shù)（BEAMing 技術(shù)）、納米芯片技術(shù)也被應(yīng)用到DNA 甲基化的檢測中。特異位點甲基化檢測一般作為后期的技術(shù)驗證手段。見表1。

表1 特異位點甲基化檢測方法匯總Table 1 Summary of methods for detecting DNA methylation at specific sites

不同的特異性位點甲基化檢測技術(shù)各有優(yōu)劣勢?？傮w而言，其檢測覆蓋范圍可分為大、中、小三個程度［5-6］：大范圍的檢測是全基因組甲基化測序技術(shù)，檢測位點廣泛但費時費錢；中等覆蓋度的檢測可用芯片捕獲測序技術(shù)，對熱點進(jìn)行針對性檢測，成本較低；小范圍則用甲基化特異性PCR技術(shù)，可對多個熱點甲基化狀態(tài)快速、準(zhǔn)確檢測，無需測序，費用相對低。目前應(yīng)用最多的是后兩種檢測方法［10-11］。中低覆蓋程度檢測都需針對熱點區(qū)域，設(shè)計特異性探針或引物，檢測靶標(biāo)區(qū)域的甲基化狀態(tài)。熱點區(qū)域的篩選，即生物標(biāo)記物（biomarker）篩選，又稱為靶標(biāo)區(qū)域或靶標(biāo)位點的篩選。見表2。

表2 甲基化biomarker 篩選方法Table 2 Screening methods of methylated biomarker

以上方法雖有一定應(yīng)用性，但限制缺點較大。因此，研發(fā)新篩選方法，對DNA 甲基化檢測和基于甲基化檢測的腫瘤早期篩查具有重要意義。

2 DNA 甲基化的臨床應(yīng)用

DNA 甲基化的臨床應(yīng)用領(lǐng)域包括非腫瘤與腫瘤疾病［6-7］。非腫瘤甲基化檢測主要用于炎癥性疾病、代謝性疾病、感染性疾病、心血管疾病等［12-15］。腫瘤甲基化檢測主要用于肺癌、結(jié)腸癌、膀胱癌、乳腺癌等多種腫瘤的早期診斷和預(yù)后分析治療等［16-19］。腫瘤中普遍存在DNA 異常甲基化，其特點是甲基化水平總體降低與局部升高。低甲基化可誘導(dǎo)原癌基因和轉(zhuǎn)座子活化、基因印跡缺失以及染色體不穩(wěn)定性增加，最終誘發(fā)腫瘤［20］。某些抑癌基因發(fā)生高甲基化，導(dǎo)致基因沉默，抑制腫瘤能力下降。見表3。

表3 部分基因甲基化對應(yīng)腫瘤應(yīng)用Table 3 Application of partial genes methylation in tumors

3 國家藥品監(jiān)督管理局產(chǎn)品獲證情況匯總

目前，基于DNA 甲基化位點的檢測產(chǎn)品陸續(xù)面世，給疾病診斷篩查帶來福音。通過查閱國家藥品監(jiān)督管理局，國內(nèi)已獲證產(chǎn)品見表4。國內(nèi)甲基化試劑盒轉(zhuǎn)化商業(yè)產(chǎn)品集中在近幾年，且獲批的都為甲基化特異性PCR 技術(shù)，主要原因還是該技術(shù)操作簡便、特異性強(qiáng)、靈敏度高等特點。目前甲基化檢測試劑盒檢測樣本類型多為cfDNA，特別是ctDNA，其檢測方法具有早期、無創(chuàng)、快捷、靈敏度高等特點?；谘簶颖局衏tDNA 的檢測克服實體瘤組織樣本的局限性，具有以下優(yōu)點：①克服腫瘤組織取樣的異質(zhì)性；②可以識別腫瘤轉(zhuǎn)移性；③可以重復(fù)活檢，使腫瘤克隆演變得以追蹤；④血液中ctDNA 半衰期僅有2 小時，實現(xiàn)實時監(jiān)測腫瘤的變化。然而，血液ctDNA 含量很低，其檢測技術(shù)的靈敏度要求較高。

表4 國內(nèi)NMPA 獲證情況Table 4 Products registered in NMPA

4 小結(jié)與展望

特異位點DNA 甲基化檢測手段發(fā)展至今，技術(shù)應(yīng)用依然存在成本高、檢測量低、引物或探針設(shè)計不一影響效果等問題，因此，優(yōu)化提升DNA 甲

基化檢測技術(shù)亟待解決。新技術(shù)如納米芯片技術(shù)、免疫組化與數(shù)字PCR 技術(shù)聯(lián)合、微流控芯片與質(zhì)譜聯(lián)用或可應(yīng)用到商用試劑盒檢測中。穩(wěn)定實現(xiàn)甲基化轉(zhuǎn)化需要專業(yè)的數(shù)據(jù)分析人員對大數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，選擇出優(yōu)質(zhì)的靶標(biāo)及成熟的核酸提取純化技術(shù)、超靈敏的PCR 或測序檢測平臺?；赾tDNA 的甲基化檢測，解決了重復(fù)取樣活檢、組織采樣存在異質(zhì)性等問題。目前已實現(xiàn)轉(zhuǎn)化的甲基化位點不多且特異性稍差，為了獲得更高質(zhì)量的ctDNA，建立國際或者國家標(biāo)準(zhǔn)的ctDNA 提純分離方法或者納入細(xì)胞系，對檢出限、背景干擾進(jìn)行研究驗證至關(guān)重要。另外，是要檢測整個DNA 甲基化水平還是位點特異性甲基化水平，或是全基因組水平分析還是位點特異性分析，是否需達(dá)到單核苷酸分別率等問題，是選擇不同甲基化檢測技術(shù)時需考慮的核心問題，也是未來篩選、應(yīng)用、驗證DNA 甲基化的研究方向，助力DNA 甲基化產(chǎn)品研發(fā)的關(guān)鍵。