基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的烏梅抗結(jié)直腸癌機(jī)制研究

潘雨煙，羅夢(mèng)雪，方霜霜，徐楚楚，蘇曉蘭，魏 瑋

（1. 中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院望京醫(yī)院脾胃病科，北京 100102；2. 北京中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，北京 100029；3. 功能性胃腸病中醫(yī)診治北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100102）

結(jié)直腸癌是世界排名第三的惡性腫瘤，在世界癌癥死亡原因中排第四［1］。且近年來，結(jié)直腸癌在發(fā)展中國(guó)家的發(fā)病率顯著上升［2-4］，為我國(guó)造成了嚴(yán)重的健康負(fù)擔(dān)及經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)［5，6］。中醫(yī)藥對(duì)于結(jié)直腸癌的認(rèn)識(shí)歷史久遠(yuǎn)，在整體觀念和辨證論治思想指導(dǎo)下能夠參與結(jié)直腸癌的全程治療，對(duì)于控制病情進(jìn)展、減輕癌癥放化療不良反應(yīng)、提高患者生存質(zhì)量等方面具有明顯優(yōu)勢(shì)，能夠在整體治療過程中起到至關(guān)重要的作用［7］。

烏梅（Fructus mume）為薔薇科植物梅Prunus mume（Sieb.）Sieb.etZuce.的干燥近成熟果實(shí)，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，性平，味酸、澀，歸肝、脾、肺、大腸經(jīng)?！侗静輳男隆酚涊d其可澀腸斂肺，止血涌痰，消腫解毒，生津止渴，治久嗽瀉痢，血痢尤良。其化學(xué)成分主要包括萜類、甾醇類、黃酮類、糖類、生物堿等，具有抗菌、抗病毒性肝炎、抗腫瘤、抗氧化等作用［8］。徐超［9］用烏梅提取物對(duì)AOM-DSS 誘導(dǎo)的腸病癌變小鼠進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，烏梅能夠預(yù)防腸道炎癌轉(zhuǎn)化，對(duì)于AOM-DSS 誘導(dǎo)的腸病可起到防止向腸癌轉(zhuǎn)化的作用。然而烏梅的成分較多，其抗結(jié)直腸癌的作用機(jī)制尚未得到揭示?；诖?，本文利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法搜集出烏梅中潛在的有效物質(zhì)，并對(duì)抗結(jié)直腸癌作用靶點(diǎn)及藥理活性進(jìn)行預(yù)測(cè)，建立藥物-靶標(biāo)-疾病相互關(guān)系網(wǎng)絡(luò)并進(jìn)行分析，揭示烏梅抗結(jié)直腸癌的潛在作用機(jī)制，為更深入的實(shí)驗(yàn)研究提供一定參考。

1 資料與方法

1.1 烏梅主要活性成分與靶點(diǎn)的搜集與篩選

利 用TCMSP 數(shù) 據(jù) 平 臺(tái)（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php），檢索烏梅所含的所有化學(xué)成分，通過口服利用度（oral bioavailability，OB）≥30%和類藥性（drug-likeness，DL）≥0.18 對(duì)所有化學(xué)成分進(jìn)行篩選，并在TCMSP 平臺(tái)檢索主要活性成分的靶點(diǎn)，同時(shí)，借助Uniprot（http：//www.uniprot.org/）數(shù)據(jù)庫查找所得基因靶點(diǎn)的基本信息。限定物種為人，對(duì)靶點(diǎn)基因名稱進(jìn)行校正，剔除沒有靶點(diǎn)的化學(xué)成分及多余的重復(fù)項(xiàng)。

1.2 烏梅抗結(jié)直腸癌潛在作用靶點(diǎn)的預(yù)測(cè)

以“Colorectal Cancer”為關(guān)鍵詞，通過Genecard數(shù)據(jù)庫、DisGeNET 數(shù)據(jù)庫檢索獲取結(jié)直腸癌相關(guān)靶點(diǎn)，與烏梅化學(xué)成分靶點(diǎn)映射，得到共同靶點(diǎn)作為烏梅抗結(jié)直腸癌潛在靶點(diǎn)，建立數(shù)據(jù)集。

1.3 烏梅相關(guān)活性成分-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

將烏梅的活性成分與抗結(jié)直腸癌的潛在靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape3.7.2 軟件，構(gòu)建烏梅抗結(jié)直腸癌的活性成分-作用靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)。

1.4 烏梅抗結(jié)直腸癌相關(guān)靶標(biāo)相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

將潛在靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 數(shù)據(jù)庫，物種選定為“homo sapiens”，獲得蛋白相互作用關(guān)系，設(shè)置信度分值大于0.7，隱藏?zé)o蛋白互作關(guān)系的靶點(diǎn)，以TSV格式保存結(jié)果。再將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape3.7.2 軟件進(jìn)行可視化處理和分析。

1.5 GO 功能富集分析及KEGG 通路富集分析

采用在線分析系統(tǒng)DAVID 對(duì)烏梅抗結(jié)直腸癌的靶點(diǎn)進(jìn)行GO（Gene Ontology）基因功能富集及KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）通路富集分析，設(shè)定閾值P＜0.05，篩選具有顯著性差異的生物過程。

2 結(jié)果

2.1 烏梅主要活性成分與靶點(diǎn)的搜集與篩選

本研究通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫共檢索到烏梅成分40 個(gè)，根據(jù)OB 和DL 參數(shù)篩選到生物活性成分8個(gè)，見表1。得到蛋白靶點(diǎn)194 個(gè)，通過Uniprot 數(shù)據(jù)庫統(tǒng)一命名并去重后，得到178 個(gè)靶點(diǎn)。

表1 烏梅活性成分信息Tab 1 Basic information of active components in Fructus mume

2.2 烏梅抗結(jié)直腸癌潛在作用靶點(diǎn)的預(yù)測(cè)

通過Genecards 和DisGeNET 數(shù)據(jù)庫中篩選出與結(jié)直腸癌相關(guān)的基因共11 085 個(gè)。為提高研究結(jié)果準(zhǔn)確性，根據(jù)相關(guān)度大小取每個(gè)數(shù)據(jù)庫前300個(gè)靶點(diǎn)組建結(jié)直腸癌相關(guān)靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫，去重后得到513 個(gè)結(jié)直腸癌相關(guān)靶點(diǎn)。與烏梅活性成分178 個(gè)靶點(diǎn)取交集，得到58 個(gè)可能與烏梅抗結(jié)直腸癌相關(guān)的作用靶點(diǎn)，見圖1。

圖1 “烏梅-結(jié)直腸癌”基因映射Venn 圖Fig 1 Venn map of“Fructus mume-colorectal cancer”gene mapping

2.3 烏梅相關(guān)活性成分-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

通過Cytoscape3.7.2 軟件構(gòu)建成分-作用靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)，其中紅色節(jié)點(diǎn)表示烏梅的活性成分，黃色節(jié)點(diǎn)表示結(jié)直腸癌靶點(diǎn)，邊線表示兩者的相互作用關(guān)系，見圖2。

圖2 烏梅抗結(jié)直腸癌的活性成分-靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)圖Fig 2 Chemical components and target networks of Fructus mume in the treatment of colorectal cancer

2.4 烏梅結(jié)直腸癌相關(guān)靶標(biāo)PPI 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析

在STRING 數(shù)據(jù)庫構(gòu)建共有靶點(diǎn)的蛋白互作PPI 網(wǎng)絡(luò)，將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape3.7.2 軟件，利用軟件分析和處理，網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)大小反應(yīng)Degree 值的大小。按Degree 從高到低排序依次為：TP53、AKT1、MAPK8、JUN、MAPK1、TNF、EGF、IL6 等，見圖3、圖4。

圖3 STRING 平臺(tái)PPI 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)Fig 3 PPI protein interaction network of STRING platform

圖4 靶標(biāo)相互作用網(wǎng)絡(luò)Fig 4 Target interaction network

2.5 GO 功能富集分析及KEGG 通路富集分析

利用DAVID 在線平臺(tái)對(duì)烏梅抗結(jié)直腸癌的靶點(diǎn)進(jìn)行富集分析，根據(jù)P＜0.05 確定對(duì)應(yīng)的條目，通過OmicShare 平臺(tái)繪制氣泡圖。

GO 功能富集分析得到相關(guān)條目108 條。其中生物過程（biological process，BP）相關(guān)條目87 條，涉及DNA 損傷的內(nèi)源性信號(hào)通路反應(yīng)、基因表達(dá)正調(diào)控、細(xì)胞因子反應(yīng)等方面：細(xì)胞組成（cellular nucleus，CC）相關(guān)條目7 條：細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞外、細(xì)胞核、線粒體組成等；分子功能（molecular function，MF）相關(guān)條目14 條：蛋白質(zhì)二聚體活化、生長(zhǎng)因子活化、蛋白結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合等方面。生物學(xué)過程、細(xì)胞組成、分子功能3 個(gè)模塊分別生成的前10條相關(guān)條目信息，見表2、圖5～7。

表2 GO 功能富集分析Tab 2 GO functional enrichment analysis

圖5 GO 功能富集的BP 分析Fig 5 BP analysis of GO functional enrichment

圖6 GO 功能富集的CC 分析Fig 6 CC analysis of GO functional enrichment

圖7 GO 功能富集的MF 分析Fig 7 MF analysis of GO functional enrichment

KEGG 通路富集分析得到相關(guān)條目88 條，涉及癌癥信號(hào)通路、蛋白聚糖在癌癥中的信號(hào)通路、結(jié)直腸癌、p53 信號(hào)通路、TNF 信號(hào)通路、HIF-1 信號(hào)通路等，前20 條相關(guān)信息，見表3、圖8。

表3 KEGG 信號(hào)通路富集分析Tab 3 Enrichment analysis of KEGG signal pathway

圖8 KEGG 通路富集分析Fig 8 Enrichment analysis of KEGG pathway

3 討論

本研究結(jié)果顯示，烏梅中有多種活性成分可通過多個(gè)基因靶點(diǎn)、多信號(hào)通路對(duì)結(jié)直腸癌產(chǎn)生影響，本研究檢索出烏梅抗結(jié)直腸癌相關(guān)活性成分包括β-谷甾醇（beta-sitosterol）、山奈酚（kaempferol）、槲皮素（quercetin）等。槲皮素為一種黃酮類化合物，具有抗炎、抗癌、抗氧化等多種生理功能［10］，流行病學(xué)報(bào)告顯示，攝入富含槲皮素的食物可降低消化道腫瘤如胃癌及結(jié)直腸癌的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)［11，12］；其抗結(jié)直腸癌的作用可通過多種途徑和機(jī)制發(fā)揮，Zhou等［13］通過定量蛋白組學(xué)分析方法發(fā)現(xiàn)槲皮素可通過干擾CCND1 基因表達(dá)、誘導(dǎo)細(xì)胞增殖G1期阻滯、誘導(dǎo)細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變等途徑在HepG2 細(xì)胞中發(fā)揮抗腫瘤活性。國(guó)外相關(guān)研究證實(shí)槲皮素作用于HT-29 結(jié)腸癌細(xì)胞后可提高p53 蛋白的表達(dá)水平，誘導(dǎo)HT-29 結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡［14］。山奈酚具有良好的抗腫瘤作用，研究證實(shí)山奈酚對(duì)HCT-116、HCT-15、SW480 等大腸癌細(xì)胞具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒性、抗氧化、抗增殖及凋亡作用［15］。β 谷甾醇具有抗腫瘤活性，研究表明其對(duì)乳腺癌、前列腺癌、及胰腺癌細(xì)胞均具有抑制作用［16-18］，β-谷甾醇還可減少結(jié)腸癌細(xì)胞PCNA 抗原的表達(dá)，通過清除活性氧誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞COLO320DM 凋亡，進(jìn)而抑制結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展［19］。

根據(jù)本研究結(jié)果，烏梅作用于結(jié)直腸癌的關(guān)鍵靶 點(diǎn) 包 括TP53、AKT1、MAPK8、JUN、MAPK1、TNF、EGF 等。其中TP53 是編碼p53 的抑癌基因，可由于基因缺失等因素引起失活，進(jìn)而使p53 蛋白功能受限，引起p53 通路功能紊亂，這種現(xiàn)象在人類腫瘤中常有出現(xiàn)，且在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中具有關(guān)鍵作用［20］，已有研究表明，TP53 的剪接突變與結(jié)直腸癌患者生存預(yù)后較差相關(guān)［21］。通過實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)在大鼠體內(nèi)聯(lián)合滅活TP53 和MIR34A 可增加IL6、PAI1 的水平，促進(jìn)致癌劑AOM 誘導(dǎo)的結(jié)直腸癌的發(fā)生以及腫瘤的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移［22］。AKT1 為AKT 的一個(gè)亞型，研究發(fā)現(xiàn)，p-Akt1 在腸道腫瘤部位陽性率明顯高于正常腸道黏膜組織［23］。AKT1 的磷酸化激活可介導(dǎo)FoxO 下調(diào)cyclin D1、cyclin D2表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞周期循環(huán)，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展；抑 制AKT1，則 有 較 強(qiáng) 的 抗 腫 瘤 作 用［24］。MAPK8 基因參與編碼JNK 蛋白激酶，該蛋白為MAPK 通路的一種亞家族，在大腸癌的發(fā)生發(fā)展中，MAPK 可調(diào)控大腸癌細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤細(xì)胞增 殖、侵 襲 與 轉(zhuǎn) 移［25］。c-jun 是JUN 基 因 的 一 種 蛋白，為結(jié)直腸癌的易感性基因，c-Jun 的表達(dá)與結(jié)直腸癌患者的生存預(yù)后相關(guān)［26］。表皮生長(zhǎng)因子EGF能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)其浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移，參與多種器官纖維化，研究表明，EGF 在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)明顯升高［27］。通過靶點(diǎn)預(yù)測(cè)，篩選出烏梅抗結(jié)直腸癌的主要靶點(diǎn)還有TNF、MAPK1、MYC、IL6、VEGFA、CCND1、CASP3 等基因，表明烏梅可通過多靶點(diǎn)抗結(jié)直腸癌。

本研究通過GO 富集分析和KEGG 通路富集分析發(fā)現(xiàn)，烏梅可能通過調(diào)控p53、HIF-1、TNF 等信號(hào)通路發(fā)揮抗結(jié)直腸癌的作用。抑癌基因p53 是一種公認(rèn)的與腫瘤清除過程相關(guān)的基因，通過p53 磷酸化可激活促凋亡基因的轉(zhuǎn)錄，誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮作用［28，29］。研究表明，p53 激活可通過上調(diào)CHOP 蛋白介導(dǎo)的DR4、DR5 的表達(dá)，增加促凋亡蛋白的表達(dá)和ROS 生成，從而增加TRAIL 介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡［30］。此外，Xu 等［31］研究發(fā)現(xiàn)FOXD 3 可與p53 結(jié)合，增強(qiáng)其表達(dá)能力，從而誘導(dǎo)結(jié)直腸癌腫瘤細(xì)胞凋亡。缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1 在低氧環(huán)境下表達(dá)增加，生成血管，提高能量代謝和氧運(yùn)輸，維持腫瘤細(xì)胞穩(wěn)定，從而使腫瘤細(xì)胞適應(yīng)缺氧［32］。相關(guān)研究表明［33-35］，HIF-1α 在結(jié)直腸癌局部和轉(zhuǎn)移瘤中均有較高的表達(dá)，阻斷HIF-α 通路可減少糖酵解相關(guān)酶GLUT-1 和LDH-A 的表達(dá)，減少腫瘤細(xì)胞分泌的乳酸含量，從而起到抑制腫瘤細(xì)胞的作用。TNF-α 為腫瘤壞死因子，由腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞分泌，可誘發(fā)慢性炎癥，從而促進(jìn)腫瘤的侵襲發(fā)展［36］。研究表明［37，38］，TNF-α 可激活NF-κB 及AP-1，進(jìn) 而 啟 動(dòng)IL-8 及MMPa 的 表 達(dá)，上 調(diào)CD44V6 與透明質(zhì)酸結(jié)合，促進(jìn)腫瘤定植。通過實(shí)驗(yàn)研究及臨床證據(jù)推測(cè)，以上信號(hào)通路可能在烏梅抗結(jié)直腸癌中發(fā)揮作用。

綜上，本文通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法發(fā)現(xiàn)烏梅中β-谷甾醇、山奈酚、槲皮素等多種成分可作用于TP53、AKT1、MAPK8、JUN、EGF 等靶點(diǎn)，通過調(diào)節(jié)p53、HIF-1、TNF 等信號(hào)通路來發(fā)揮抗結(jié)直腸癌的作用，為進(jìn)一步藥理研究及臨床應(yīng)用提供了一定的理論基礎(chǔ)，烏梅能否成為治療腫瘤的藥物，還需要更多相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究及理論探討以明確。