口蹄疫A 型抗體檢測(cè)試劑盒的篩選

劉起濤 郭天準(zhǔn) 杜季梅 郭占達(dá)

1.申聯(lián)生物醫(yī)藥（上海）股份有限公司 200241

2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物疫病檢測(cè)中心 450002

口蹄疫（Foot and mouth disease，F(xiàn)MD）是一種高度傳染的病毒性動(dòng)物疫病，具有重大的政治經(jīng)濟(jì)影響力，該病可感染偶蹄動(dòng)物，包括豬、牛、綿羊和70 多種野生動(dòng)物，也能感染一些非偶蹄類動(dòng)物，如老鼠和大象。口蹄疫的發(fā)病特點(diǎn)是發(fā)熱、厭食、口腔和蹄部出現(xiàn)水泡等癥狀，也可能出現(xiàn)長(zhǎng)期無(wú)癥狀感染而散毒的情況。根據(jù)口蹄疫病毒結(jié)構(gòu)蛋白抗原性的差異，將口蹄疫病毒分為7 個(gè)血清型，分別是：O 型、A型、C 型、南非1 型（SAT-1）、南非2 型（SAT-2）、南非3型（SAT-3）和亞洲1 型（Asia 1），每個(gè)血清型還有一系列的血清亞型，不同血清型的口蹄疫病毒引起的臨床癥狀幾乎相同?？刂坪透谔阋叱杀靖甙呵也僮骼щy，大多數(shù)國(guó)家采取疫苗免疫的控制策略。我國(guó)從2001 年開(kāi)始口蹄疫疫苗的強(qiáng)制免疫，豬口蹄疫O 型疫苗已免疫接種近20 年，豬群中口蹄疫O 型抗體水平保持較好水平。農(nóng)業(yè)農(nóng)村部《2018年國(guó)家動(dòng)物疫病強(qiáng)制免疫計(jì)劃》中規(guī)定“各省根據(jù)評(píng)估結(jié)果自行確定是否對(duì)豬 A 型口蹄疫實(shí)施免疫”的免疫計(jì)劃。鑒于此，一些省份從2018 年開(kāi)始對(duì)豬進(jìn)行A 型口蹄疫疫苗的免疫接種，豬免疫口蹄疫疫苗之后28d 采集血清樣品進(jìn)行免疫效果評(píng)估，選用穩(wěn)定可靠的豬口蹄疫病毒A 型VP1 結(jié)構(gòu)蛋白抗體檢測(cè)試劑盒是評(píng)價(jià)疫苗免疫效果的關(guān)鍵所在。

本項(xiàng)研究從某省免疫豬口蹄疫O 型、A 型二價(jià)合成肽疫苗（多肽2700+2800+MM13）的9 個(gè)規(guī)?；i場(chǎng)，每場(chǎng)采集10 份血樣，共采集90 份血清樣品。血清樣品分別用購(gòu)買的3 種不同廠家生產(chǎn)的豬口蹄疫病毒A 型VP1 結(jié)構(gòu)蛋白抗體ELISA 檢測(cè)試劑盒（簡(jiǎn)稱試劑盒A、試劑盒B、試劑盒C），檢測(cè)豬口蹄疫病毒A 型抗體。本研究旨在比較市面上銷售的豬口蹄疫病毒A 型VP1 結(jié)構(gòu)蛋白抗體ELISA 檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)效果，篩選出能夠有效檢測(cè)免疫接種豬口蹄疫O 型、A 型二價(jià)合成肽疫苗（多肽2700+2800+MM13）后A 型抗體的豬口蹄疫病毒A 型VP1 結(jié)構(gòu)蛋白抗體的檢測(cè)試劑盒，進(jìn)而為評(píng)估豬群口蹄疫A 型抗體水平提供較好的檢測(cè)試劑盒參考。

1 材料和方法

1.1 儀器1510-03051 型全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀購(gòu)自Thermo 公司，THZ-98A 型恒振蕩器購(gòu)自上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.2 材料

1.2.1 試驗(yàn)疫苗豬口蹄疫O 型、A 型二價(jià)合成肽疫苗（多肽2700+2800+MM13），國(guó)內(nèi)某口蹄疫疫苗生產(chǎn)企業(yè)生產(chǎn)，批號(hào)：20191204。

1.2.2 血清樣品從某省免疫接種豬口蹄疫O 型、A 型二價(jià)合成肽疫苗（多肽2700+2800+MM13）的9 個(gè)規(guī)模化豬場(chǎng)，每場(chǎng)采集10 份血樣，共采集90 份血樣（樣品編號(hào)為1-10、21-30、31-40、41-50、51-60、61-70、81-90）。

1.2.3 檢測(cè)試劑豬口蹄疫病毒A 型VP1 結(jié)構(gòu)蛋白抗體ELISA 檢測(cè)試劑盒，試劑盒A，某生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：20 200801；試劑盒B，某生物科技有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：614201110A；試劑盒C，某科技有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：200401。

1.3 方法

1.3.1 疫苗免疫接種選取60 日齡育肥豬，耳根后深層肌肉注射豬口蹄疫O 型、A 型二價(jià)合成肽疫苗（多肽2700+2800+MM13），每頭豬注射1mL。

1.3.2 血清樣品收集88 日齡時(shí)采用前腔靜脈采血方式采集血樣，采集的90 份血樣用低速冷凍離心機(jī)4℃、3000rpm離心5 分鐘，分離出血清，2～8℃冷藏保存。

1.3.3 抗體檢測(cè)使用3 種豬口蹄疫病毒A 型VP1 結(jié)構(gòu)蛋白抗體ELISA 檢測(cè)試劑盒分別進(jìn)行抗體檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果按照相應(yīng)說(shuō)明書(shū)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判定。

2 結(jié)果與分析

2.1 試劑盒檢測(cè)結(jié)果比較

2.1.1 試劑盒檢測(cè)抗體合格率3 種試劑盒的檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1，試劑盒A 和B 檢測(cè)的豬口蹄疫A 型抗體合格率分別為93.33%（84/90）、87.78%（79/90），試劑盒A 和B 檢測(cè)的抗體合格率基本一致，二者的敏感性較高。試劑盒C 檢測(cè)的豬口蹄疫A 型抗體合格率僅為25.56%（23/90），抗體合格率低，明顯低于試劑盒A 和B 的檢測(cè)結(jié)果。試劑盒C 敏感性較低可能是抗原反應(yīng)板中包被的抗原種類與疫苗抗原不同有關(guān)。

圖1 三種試劑盒檢測(cè)的豬口蹄疫A 型抗體合格率

2.1.2 試劑盒檢測(cè)符合率90 份血清樣品用3 種試劑盒檢測(cè)，試劑盒A 與B 檢測(cè)均為陽(yáng)性的血清有79 份、均為陰性的血清有6 份，試劑盒A 檢測(cè)為陽(yáng)性而試劑盒B 檢測(cè)為陰性的血清有5 份，即試劑盒A 與B 檢測(cè)結(jié)果相同的血清有85 份、檢測(cè)結(jié)果不同的血清有5份，二者的符合率為94.44%（85/90）；試劑盒A 與C 檢測(cè)均為陽(yáng)性的血清有23 份、均為陰性的血清有6 份，試劑盒A 檢測(cè)為陽(yáng)性而試劑盒C 檢測(cè)為陰性的血清有61 份，即試劑盒A 與C 檢測(cè)結(jié)果相同的血清有29 份、檢測(cè)結(jié)果不同的血清有61 份，二者的符合率為32.22%（29/90）；試劑盒B 與C 檢測(cè)均為陽(yáng)性的血清有23 份、均為陰性的血清有11 份，試劑盒B 檢測(cè)為陽(yáng)性而試劑盒C 檢測(cè)為陰性的血清有56 份，即試劑盒A 與C 檢測(cè)結(jié)果相同的血清有34 份、檢測(cè)結(jié)果不同的血清有56 份，二者的符合率為37.78%（34/90）。試劑盒A 與B 的檢測(cè)符合率較高，試劑盒A、B 與試劑盒C 的檢測(cè)符合率較低。

2.2 豬群中口蹄疫A 型抗體情況9 個(gè)規(guī)?；i場(chǎng)（場(chǎng)1～場(chǎng)9）的采樣豬群抗體合格率見(jiàn)表1。根據(jù)試劑盒A 與B 的檢測(cè)結(jié)果可以看出，場(chǎng)1、3、5、6、7、8、9 免疫后28d 抗體合格率均達(dá)到100%（10/10），豬群抗體水平高、疫苗免疫效果較好；場(chǎng)2 的A 型抗體合格率未達(dá)到國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)（70%以上）要求，需采取補(bǔ)免措施提高豬群抗體水平；場(chǎng)4 的A 型抗體合格率較好，個(gè)別豬只抗體不合格，需定期監(jiān)測(cè)豬群口蹄疫A 型抗體水平，發(fā)現(xiàn)口蹄疫抗體合格低時(shí)及時(shí)做好豬群口蹄疫疫苗的加強(qiáng)免疫。

表1 豬場(chǎng)口蹄疫A 型抗體合格率

3 結(jié)論與討論

口蹄疫是一種嚴(yán)重危害畜牧業(yè)健康發(fā)展的高度傳染性的動(dòng)物疫病，我國(guó)從2001 年開(kāi)始對(duì)豬進(jìn)行口蹄疫O 型疫苗的強(qiáng)制免疫，檢測(cè)口蹄疫病毒O 型抗體的試劑盒種類和方法已經(jīng)成熟。2018 年開(kāi)始，一些省份開(kāi)始對(duì)豬進(jìn)行口蹄疫A 型疫苗的強(qiáng)制免疫，疫苗免疫后與之配套的豬口蹄疫A 型抗體檢測(cè)試劑盒尚處于開(kāi)發(fā)研究階段。

本研究分析比較3 種檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)效果。試劑盒A 與B 檢測(cè)的A 型抗體合格率分別為93.33%、87.78%，與李偉等檢測(cè)的首免豬口蹄疫O 型、A 型二價(jià)合成肽疫苗后30d；楊虹等檢測(cè)的免疫接種豬口蹄疫O 型、A 型二價(jià)合成肽疫苗后28dA 型抗體合格率一致。試劑盒A 與B 檢測(cè)結(jié)果的符合率較高，表明這兩種試劑盒可用于豬口蹄疫O 型、A 型二價(jià)合成肽疫苗免疫效果評(píng)估。試劑盒C 檢測(cè)的A 型抗體合格率僅為25.56%，與試劑盒A 和B 的檢測(cè)符合率較低，不適用于豬口蹄疫O 型、A 型二價(jià)合成肽疫苗免疫效果評(píng)價(jià)，這可能與抗原反應(yīng)板包被的VP1 結(jié)構(gòu)蛋白特異性抗原有關(guān)。豬口蹄疫O 型、A 型二價(jià)合成肽疫苗（多肽2700+2800+MM13）含有2 個(gè)O 型抗原、1 個(gè)A 型抗原，免疫接種后O 型抗原對(duì)豬只產(chǎn)生的免疫反應(yīng)比A 型抗原更強(qiáng)烈。因此，7 個(gè)豬場(chǎng)豬群中A 型抗體合格率較高，也意味著豬群O 型抗體合格率較好。9 個(gè)規(guī)模豬場(chǎng)中場(chǎng)1、3、5、6、7、8、9 免疫后28d 抗體合格率達(dá)到100%，表明這7 個(gè)豬場(chǎng)豬群口蹄疫疫苗免疫效果較好，豬群的抗體整齊度較高，能為育肥豬生長(zhǎng)周期內(nèi)提供抗口蹄疫感染的良好保護(hù)。場(chǎng)2 檢測(cè)的A型抗體合格率低于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，一方面的原因可能與疫苗注射時(shí)操作不當(dāng)導(dǎo)致進(jìn)入豬體頸部深層肌肉的疫苗量不夠；另一方面的原因可能是存在母源抗體干擾，導(dǎo)致免疫后一部分疫苗抗原被豬體內(nèi)的母源抗體中和，兩種原因?qū)е麓碳へi只產(chǎn)生的免疫反應(yīng)需要的抗原量不足，豬體產(chǎn)生的抗體水平較低。

本研究通過(guò)3 種不同的豬口蹄疫病毒A 型VP1 結(jié)構(gòu)蛋白抗體的檢測(cè)試劑盒對(duì)免疫28d 后的血清樣品進(jìn)行豬口蹄疫病毒A 型抗體的檢測(cè)，篩選出2 種能夠用于評(píng)估豬口蹄疫O型、A 型二價(jià)合成肽疫苗（多肽2700+2800+MM13）免疫效果的試劑盒，對(duì)豬場(chǎng)進(jìn)行口蹄疫病毒A 型抗體的免疫效果評(píng)價(jià)提供了檢測(cè)試劑盒的參考。