祁永華，吳 迪，張晏航，吳鵬程，張 寧

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué) 佳木斯學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007；2.東北林業(yè)大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040）

皮膚光老化主要機(jī)制為中波紫外線（UVB）穿透皮膚表皮層，導(dǎo)致皮膚內(nèi)活性氧（ROS）的過量產(chǎn)生[1]，而ROS 可誘導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）活性增加，破壞細(xì)胞外基質(zhì)，導(dǎo)致皺紋等皮膚老化癥狀的出現(xiàn)[ 7]。

楮實(shí)子化學(xué)成分主要包括生物堿、氨基酸、多糖等[2]。具有抗衰老、抗氧化等藥理作用[3,4]。為了了解楮實(shí)子多糖的抗氧化活性，有必要確定合理可行的提取工藝。本研究以正交試驗(yàn)確定多糖的最佳提取工藝后，采用UVB 輻射人皮膚成纖維細(xì)胞復(fù)制光老化模型，研究楮實(shí)子多糖的抗氧化活性，為楮實(shí)子多糖在抗皮膚光老化方面提供實(shí)驗(yàn)支持。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 藥品與試劑

人皮膚成纖維細(xì)胞（ESF-1，北京協(xié)和細(xì)胞資源中心）；楮實(shí)子（批號(hào)：191003 購自佳木斯市百盛藥材公司，經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)陳效忠教授鑒定為桑科植物構(gòu)樹Broussoneria papyrifera（L.）Vent.的干燥成熟果實(shí)）；D-無水葡萄糖對照品（批號(hào)：110833-201205，中國食品藥品檢定研究院）；DMEM 培養(yǎng)液、胰蛋白酶、PBS，Gibco 公司；胎牛血清、二甲基亞砜、MTT，Sigma 公司。

1.2 主要儀器

YT-SY96 型酶標(biāo)儀（上海熱電儀器有限公司）；8-5K 型離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；FZ-A 型紫外線輻照計(jì)（北京師范大學(xué)光電儀器廠）；IX-71-21PH 型Olympus 倒置顯微鏡（日本Olympus 公司）；MS-500E 型半自動(dòng)生化分析儀（四川美生公司）。

1.3 楮實(shí)子多糖提取工藝

1.3.1 楮實(shí)子多糖的提取 楮實(shí)子干燥后粉碎，稱取50g，加入750mL 蒸餾水，浸泡120min，置于水浴鍋中升溫至80℃，趁熱過濾，濾液濃縮至50mL，待冷卻后按照醇沉比1∶4 加入無水乙醇，放置過夜，離心，收集沉淀，用無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌，即得楮實(shí)子粗多糖。

1.3.2 楮實(shí)子多糖含量測定 準(zhǔn)確稱取葡萄糖對照品0.15g，定容至100mL 容量瓶中，制成濃度為1.5mg·mL-1的儲(chǔ)備液。取儲(chǔ)備液適量，配制成0.02、0.04、0.06、0.08、0.10mg·mL-1的濃度梯度，并分別加入1mL 苯酚和5mL H2SO4后混勻，于沸水浴中加熱10min，冷卻至室溫，測定吸光度（490nm），分別以濃度和吸光度為橫、縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為Y=6.550X+0.0423（r=0.9997），線性范圍為0～0.10mg·mL-1。取楮實(shí)子多糖提取液0.5mL，用2mL水稀釋，量取稀釋液1mL，加入1mL 苯酚和5mL H2SO4后混勻，于沸水浴中加熱10min，冷卻至室溫，測定吸光度并計(jì)算楮實(shí)子多糖含量。

1.3.3 單因素試驗(yàn)優(yōu)化楮實(shí)子多糖提取工藝

（1）提取溫度與楮實(shí)子多糖含量的關(guān)系 按照“1.3.1”項(xiàng)下的方法提取多糖、“1.3.2”項(xiàng)下的方法測定多糖含量，其他條件不變，比較在40、60、80、100℃的多糖含量，每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3 次。

（2）提取次數(shù)與楮實(shí)子多糖含量的關(guān)系 按照“1.3.1”項(xiàng)下的方法提取多糖、“1.3.2”項(xiàng)下的方法測定多糖含量，其他條件不變，比較提取1、2、3、4 次的多糖含量，提取次數(shù)兩次或超過兩次的提取液需合并濾液后再濃縮至50mL，每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3 次。

（3）料液比與楮實(shí)子多糖含量的關(guān)系 按照“1.3.1”項(xiàng)下的方法提取多糖、“1.3.2”項(xiàng)下的方法測定多糖含量，其他條件不變，比較料液比為1 號(hào)（1∶10）、2 號(hào)（1∶15）、3 號(hào)（1∶20）、4 號(hào)（1∶25）、5 號(hào)（1∶30）對楮實(shí)子多糖含量的影響，每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3.4 楮實(shí)子多糖提取工藝優(yōu)化的正交試驗(yàn) 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，試驗(yàn)以提取溫度、提取次數(shù)和料液比例為考察因素，設(shè)置每個(gè)因素3 個(gè)水平，采用四因素三水平正交試驗(yàn)表（L9（34））設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，以多糖含量為指標(biāo)篩選最佳工藝。見表1。

表1 L9（34）正交試驗(yàn)因素水平表Tab.1 Factors and levels of L9（34）orthogonal test

1.3.5 多糖提取工藝的驗(yàn)證試驗(yàn) 按照正交試驗(yàn)篩選的最佳試驗(yàn)條件，重復(fù)進(jìn)行3 次試驗(yàn)，測定楮實(shí)子多糖含量，評價(jià)優(yōu)化后工藝的合理性。

1.4 楮實(shí)子多糖抗皮膚光老化能力

1.4.1 光老化模型建立 將處于對數(shù)生長期的ESF-1 用0.25%胰酶消化后接種于96 孔板，培養(yǎng)24h。待細(xì)胞全部貼壁后移除培養(yǎng)液，每孔加入100μL PBS 緩沖液，置于強(qiáng)度為70mJ·cm-2的中波紫外光下進(jìn)行照射，用紫外線強(qiáng)度檢測儀監(jiān)測強(qiáng)度，空白組不予照射。各試驗(yàn)組移除PBS 緩沖液后，按試驗(yàn)分組加入相應(yīng)DMEM 培養(yǎng)液或含藥DMEM 培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

1.4.2 試驗(yàn)分組 將處于對數(shù)生長期的ESF-1 接種于96 孔板，分為空白組、模型組、維生素E 組（陽性組）、給藥組，各組均設(shè)5 個(gè)復(fù)孔?？瞻捉M給予DMEM 培養(yǎng)48h，模型組、維生素E 組、給藥組于70mJ·cm-2的UVB 照射后，分別給予DMEM 培養(yǎng)液、含維生素E 500μg·mL-1DMEM 培養(yǎng)液、含楮實(shí)子多糖500μg·mL-1DMEM 培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

1.4.3 指標(biāo)測定 取各組細(xì)胞上清液，按照SOD、MDA、GSH-PX 試劑盒說明書進(jìn)行操作，分別測定其指標(biāo)變化，以考察楮實(shí)子多糖抗UVB 所致細(xì)胞氧化損傷。

1.4.4 數(shù)據(jù)處理 采用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。兩組間比較用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)，P<0.05 說明差異有顯著性意義。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 提取溫度的影響

圖1 為提取溫度與楮實(shí)子多糖含量的關(guān)系圖。

圖1 提取溫度與楮實(shí)子多糖含量的關(guān)系Fig.1 Relationship between extraction temperature and content of Fructus Broussonetiae polysaccharides

由圖1 可見，隨著提取溫度的升高，楮實(shí)子多糖含量亦隨之增高，表明升高溫度有利于楮實(shí)子多糖的提取，然而當(dāng)溫度升至80℃后含量曲線接近與橫軸平行，表明隨溫度升高楮實(shí)子多糖含量無明顯變化，因此，選擇優(yōu)化溫度范圍為70～90℃。

2.1.2 提取次數(shù)的影響

圖2 為提取次數(shù)與楮實(shí)子多糖含量關(guān)系圖。

圖2 提取次數(shù)與楮實(shí)子多糖含量的關(guān)系Fig.2 Relationship between extraction times and content of Fructus Broussonetiae polysaccharides

由圖2 可見，隨提取次數(shù)增加，多糖含量先大幅度增加后小幅度下降，原因?yàn)樘崛〈螖?shù)增加，提取液的量增加，濃縮時(shí)間延長，使少量植物多糖降解。當(dāng)提取次數(shù)為2 次時(shí)，楮實(shí)子多糖含量最高，因此，選擇優(yōu)化提取次數(shù)為1～3 次。

2.1.3 料液比的影響

圖3 為料液比與楮實(shí)子多糖含量的關(guān)系圖。

圖3 料液比與楮實(shí)子多糖含量的關(guān)系Fig.3 Relationship between solid-liquid ratio and content of Fructus Broussonetiae polysaccharides

由圖3 可見，料液比對多糖含量的影響呈先升高后小幅降低的趨勢，雖然料液比例1∶30 比1∶25提取的含量有所降低，但楮實(shí)子多糖含量仍高于料液比1∶20，其中料液比為1∶25 時(shí)效果最好，因此，選擇優(yōu)化范圍為1∶20～1∶30 設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)。

2.2 多糖提取工藝優(yōu)化的正交試驗(yàn)

表2 為正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果。

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果（n=3）Tab.2 Design and result of orthogonal experiment

由表2 可見，極差分析結(jié)果表明因素影響的次序?yàn)锳>C>B，說明提取溫度是影響多糖提取的主要影響因素，最優(yōu)組合為A2B2C3。

方差分析結(jié)果見表3。

表3 方差分析結(jié)果Tab.3 Result of analysis of variance

溫度對多糖提取效果有極顯著影響，料液比對多糖提取效果有顯著性影響，提取次數(shù)對多糖提取效果無顯著影響。最終確定的最佳工藝為提取溫度80℃，提取次數(shù)2 次，料液比1∶25。

2.3 多糖提取工藝的驗(yàn)證試驗(yàn)

按照最優(yōu)組合平行制備的3 批樣品多糖含量分別為：10.35%，10.69%，10.27%，RSD<3，表明工藝合理、可行，重復(fù)性好。

2.4 楮實(shí)子多糖對SOD、MDA、GSH-PX 水平的影響

由圖4 可見，與空白對照組比較，模型組SOD、GSH-PX 水平顯著下降，MDA 水平顯著升高（P<0.05），表明光老化模型復(fù)制成功。與模型組比較，維生素E組與楮實(shí)子多糖組SOD、GSH-PX 水平明顯升高（P<0.05），MDA 水平明顯降低（P<0.05），表明楮實(shí)子多糖有抗UVB 致皮膚成纖維細(xì)胞氧化損傷作用。

圖4 楮實(shí)子多糖對皮膚成纖維細(xì)胞SOD、MDA、GSH-PX水平的影響Fig.4 Fructus Broussonetiae polysaccharides effect on level of SOD、MDA、GSH-PX

3 結(jié)論

本研究通過單因素試驗(yàn)考察了楮實(shí)子多糖提取溫度、提取次數(shù)及料液比對多糖含量的影響，確定了適宜范圍，采用L9（34）正交試驗(yàn)法對多糖的提取方法進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳提取溫度為80℃，提取次數(shù)為2 次，料液比為1∶25，多糖平均含量為10.44%，提示優(yōu)化后的多糖提取工藝合理可行。

人皮膚長期處于UVB 照射下，細(xì)胞內(nèi)ROS 水平顯著升高，引發(fā)脂質(zhì)過氧化及DNA 損傷[6]。正常情況下，SOD、GSH-PX、維生素E 等抗氧化劑對ROS 有清除能力，過量的ROS 能使機(jī)體自身抗氧化防御系統(tǒng)失衡，細(xì)胞遭受氧化應(yīng)激損傷，MDA 含量升高，最終導(dǎo)致皮膚光老化。本研究通過皮膚成纖維細(xì)胞復(fù)制光老化模型，對楮實(shí)子多糖的抗氧化活性進(jìn)行了研究，初步證明了楮實(shí)子多糖的體外抗氧化活性，有用于抗老化中藥化妝品領(lǐng)域的潛力。