劉寰宇 王焱冰 楊濤 崔人勻 安炯俊 陳健 郝力爭 李忠

摘要 目的：探究芪甲扶正方治療肺腺癌相關性疲乏的作用機制。方法：基于中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP）、中醫(yī)藥綜合數據庫（TCMID）、Pubchem、Swiss Target Prediction等數據庫收集芪甲扶正方有效成分及作用靶點;通過GeneCards、OMIM等數據庫獲取“肺腺癌相關性疲乏”相關靶基因;將藥物靶點映射到疾病靶點集合上，獲取交集基因;使用String構建蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）網絡;通過Cytoscape構建藥物-成分-靶點調控網絡;利用DAVID數據庫對芪甲扶正方治療肺腺癌相關性疲乏的靶點進行基因本體（GO）富集分析和京都基因和基因組百科全書（KEGG）富集分析;運用Genebank數據庫分析交集基因的組織器官定位;利用AutoDock Vina_1.1.2分析主要活性成分和關鍵靶點的結合能力，并使用PYMOL軟件將對接結果進行可視化展示。結果：調控網絡共包含9味中藥、108種活性成分、87個靶基因;和CASP3、VEGFA、EGFR、MYC、IL-6;KEGG富集分析涉及PI3K-AKT、p53、TNF、MAPK、ErbB、Ras、FoxO等通路;關鍵基因主要分布在肺、紅細胞、T細胞、B細胞;分子對接結果表明EGFR與木犀草素、IL-6、MAKP3與β-谷甾醇、MAKP8與鞣花酸具有較強的結合能力。結論：芪甲扶正方活性成分鞣花酸、β-谷甾醇等，可能通過作用于EGFR、IL-6、MAKP3、MAKP8等靶點，進而通過調節(jié)PI3K-AKT通路發(fā)揮對肺腺癌相關性疲乏的治療作用。

關鍵詞 肺腺癌;癌因性疲乏;芪甲扶正方;網絡藥理學;分子對接;鞣花酸;IL6;PI3K-AKT

Abstract Objective：To explore the action mechanism of Qijia Fuzheng Formula in the treatment of fatigue-related lung adenocarcinoma.Methods：Based on databases such as TCMSP，TCMID，Pubchem，Swiss Target Prediction，etc.，the active ingredients and targets of Qijia Fuzheng Formula were collected; relevant target genes of “pulmonary adenocarcinoma-related fatigue” from databases such as GeneCards and OMIM were obtained; drug targets were mapped to diseases target set.The intersection genes on the target set were obtained; String was used to construct a protein-protein interaction（PPI） network; Cytoscape was used to construct a drug-component-target regulatory network;DAVID database was used to enrich（GO，KEGG） analysis of the targets of Qijiafuzheng Formula in the treatment of lung adenocarcinoma-related fatigue; Genebank database was used to analyze the tissue and organ location of intersection genes; AutoDock Vina_1.1.2 was used to analyze the main active ingredients and key binding ability of the target，and PYMOL was used software to visualize the docking results.Results：The drug-compound-target network consisted of 9 drugs，108 compounds and 87 targets; and CASP3，VEGFA，EGFR，MYC，IL-6; KEGG enrichment analysis involved PI3K-AKT，p53，TNF，MAPK，ErbB，Ras，FoxO and other pathways; key genes were mainly distributed in lungs，red blood cells，T cells，B cells; molecular docking results showed that EGFR and luteolin，IL-6，MAKP3 and β-sitosterol，MAKP8 and ellagic acid had strong binding ability.Conclusion：The active ingredients of Qijia Fuzheng Formula，such as ellagic acid and β-sitosterol，may act on EGFR，IL-6，MAKP3，MAKP8 and other targets，and then play a role in the treatment of lung adenocarcinoma-related fatigue by regulating the PI3K-AKT pathway effect.

Keywords Lung adenocarcinoma; Cancer related fatigue; Qijia Fuzheng Formula; Network pharmacology; Molecular docking; Luteolin; IL6; PI3K-AKT

中圖分類號：R285文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.11.008

癌癥相關性疲勞（Cancer Related Fatigue，CRF）是80%腫瘤患者正在或已經經歷過的虛弱癥狀[1]，具有多維度、多階段、不可緩解等特點，近年來隨著腫瘤治療理念由傳統的對抗治療到姑息治療理念的轉變，癌性疲乏已經引起越來越多腫瘤研究者的關注[2]。雖然國內外關于藥物干預癌性疲乏的臨床研究逐年增加，但目前尚無理想治療藥物[3-4]。正所謂“精氣奪則虛”，中醫(yī)將此種虛弱癥狀歸屬于“虛勞”辨治，提出其病機為“多臟腑虧損，氣血陰陽同虛”[5]，特點為“虛損勞衰不斷加重”，治當以扶正為主，祛邪為輔[6]，注重攻補兼施，調補脾腎[7]。

芪甲扶正方是遵《黃帝內經》“虛則補之”“勞者溫之”“損者益之”的治療思想組方而成，具有健脾益腎、固攝扶正的作用，由黃芪、鱉甲、烏梅、仙鶴草、瓦楞子、秦艽、半枝蓮、莪術、鼠婦等藥物組成，方中黃芪甘溫，中黃表白，白入肺，黃入脾，合治“脫力勞傷”之仙鶴草共為君以奏健中州之效，醋鱉甲咸寒入腎軟堅散結、破瘀通經，烏梅酸澀平入肝為臣，莪術、鼠婦、秦艽、半枝蓮、煅瓦楞子為佐，以奏健脾益腎、固攝扶正之效。已在臨床應用多年[8]。本團隊既往臨床研究表明，其能配合西醫(yī)基礎治療改善非小細胞肺癌患者尤其是肺腺癌患者乏力、氣短的癥狀[9]。雖然芪甲扶正方的臨床療效明確，但其具體的分子作用機制不清，有待進一步探索。

因此，本研究運用具有預測中藥復方干預疾病分子機制作用的網絡藥理學方法和具有預測復合物結合能作用的分子對接技術[10]，通過多種網絡數據庫，從多組分、多靶點整體分析并預測芪甲扶正方治療肺腺癌相關性疲乏的潛在藥理學機制，旨在初步闡釋芪甲扶正方治療肺腺癌相關性疲乏的作用機制。具體研究流程見圖1。

1 資料與方法

1.1 篩選芪甲扶正方活性成分并預測成分作用靶點

以“烏梅”“仙鶴草”“黃芪”“秦艽”“半枝蓮”“莪術”等芪甲扶正方所含中藥為關鍵詞，依次檢索中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）[11]收集藥物活性成分，并以藥物口服生物利用度大于等于30%和藥物相似性大于等于0.18為篩選閾值，進一步篩選有效活性成分;然后以中醫(yī)藥綜合數據庫（TCMID）（http：//www.megabionet.org/tcmid/）平臺檢索鱉甲活性成分;最后經Pubchem數據庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）獲得鼠婦、瓦楞子等藥物的活性成分[12-13]。

以上述有效成分為關鍵詞分別檢索TCMSP和有機小分子生物活性數據庫（Swiss Target Prediction）（http：//www.swisstargetprediction.ch/）[11]，獲取上述有效活性成分對應的作用靶點。

1.2 肺腺癌相關性疲乏靶點獲取

以“Cancer-related fatigue of lung adenocarcinoma”為關鍵詞，檢索GeneCards（http：//www.genecards.org/）、人類孟德爾遺傳綜合數據庫（Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM）（http：//www.omim.org/）等數據庫，將所得靶點合并去重后得到肺腺癌相關性疲乏的疾病靶點。

1.3 獲取藥物-疾病交集靶點

將芪甲扶正方活性成分作用靶點與肺腺癌相關性疲乏相關靶點進行映射，得到芪甲扶正方治療肺腺癌相關性疲乏的潛在靶點;將以上篩選出的靶標通過Uniprot（http：//www.uniprot.org/）數據庫轉換成對應的基因名，舍棄無法找到基因名的靶標。

1.4 構建芪甲扶正方治療肺腺癌相關性疲乏的PPI網絡并篩選重要靶點

使用STRING數據庫，將1.3收集的芪甲扶正方治療肺腺癌相關性疲乏的潛在靶點復制到Multiple proteins，物種來源選擇Homo sapiens，輸出tsv.結果;并使用Cytoscape軟件進行可視化，設置其中心靶點重要性優(yōu)于外周。

1.5 構建藥物-成分-靶點調控網絡

選取藥物、靶點、靶點相關的藥物活性成分輸入Cytoscape構建藥物-成分-靶點調控網絡并根據度值（degree）將活性成分和靶點進行排序。

1.6 藥物治療疾病組織器官定位

使用Genecard數據庫將各組織的靶基因分別與藥物疾病交集基因進行映射，以明確肺腺癌相關性疲乏基因的分布。

1.7 交集基因富集分析

研究使用DAVID數據庫（https：//david.ncifcrf.gov/）對上述所得交集靶基因進行基因本體（Gene Ontology，GO）和京都基因和基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析[14]。其中GO分析包括分子功能（Molecular Function，MF）、生物過程（Biological Process，BP）、細胞組成（Cellular Components，CC）。

1.8 分子對接

研究使用AutoDock Vina_1.1.2將前30個成分與前5個靶基因進行分子對接分析，驗證其相互作用活性。1）經TCMSP平臺下載前30個成分的（“mol2“格式）信息，依次為分子結構加氫原子（通過Open Babel），加電荷（選擇MMFF94力場）、能量最小化，將化合物轉化為PDBQT格式文件（通過AutoDcok Tools）。2）從PDB網站（http：//www.rcsb.org/）獲取前5個靶點蛋白。3）利用AutoDock Tools分離靶蛋白、相應配體，添加氫原子并計算電荷后導出PDBQT格式文件;并使用AutoDock Tools確定對接盒子的大小和中心，對接盒子的中心定義為蛋白晶體結構原配體的中心，大小包裹原配體所在活性位點關鍵殘基。4）最后使用Vina依次將活性成分與靶蛋白進行對接，提取對接打分，使用PyMol（V2.4.0）進行對接結果的可視化展示。

2 結果

2.1 藥物活性成分篩選和靶點預測結果

通過上述數據庫檢索芪甲扶正方中9味中藥所含的化合物后，根據OB和DL值共篩選出108個化合物，黃芪20個，烏梅8個，仙鶴草5個，秦艽2個，莪術3個，半枝蓮29個，鱉甲16個，瓦楞子7個，鼠婦34個;根據度值篩選出前30個活性成分，如表1;預測靶點5 132個。

2.2 疾病潛在基因靶點

檢索各數據庫合并去重后，共獲得與肺腺癌相關性疲乏相關靶點1 263個。

2.3 藥物治療疾病作用靶點集

將5 132個芪甲扶正方作用靶點與1 263個肺腺癌相關性疲乏關聯靶點進行映射，得到一個含87個基因的基因集合，可能是芪甲扶正方治療肺腺癌相關性疲乏的作用靶點。

2.4 芪甲扶正方治療肺腺癌相關性疲乏的PPI網絡及重要靶點 將上述所得87個交集靶點，導入STRING數據庫，得到一個包含1 179條邊，87個節(jié)點，平均度值為27.1的蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）網絡;下載PPI網絡、導入Cytoscape3.7.1后，通過Network analyzer功能對PPI網絡進行拓撲分析，最后根據度值篩選出CASP3、VEGFA、EGFR、MYC、IL-6、CCND1、ESR1、MAPK3、MAPL8、PTGS2等靶點，可能為藥物發(fā)揮作用的重要靶點，如圖2所示。

2.5 藥物-成分-靶點調控網絡 如圖3藥物-成分-靶點調控網絡所示，鼠婦、半枝蓮所含化合物最多，其次為黃芪、鱉甲、仙鶴草、烏梅;網絡中度值較高的前5個藥物成分槲皮素、山柰酚、黃芩苷、鞣花酸、異鼠李素，可能為發(fā)揮治療作用的關鍵成分。度值較高的前5個靶點CASP3、VEGFA、EGFR、MYC、IL-6，可能是發(fā)揮治療作用的重要靶點。

2.6 組織器官定位分析結果 依次以Red blood cell、T cell、B cell、Mitochondria、lung、Adrenal gland、Spleen為關鍵詞查詢GeneCards數據庫，獲取相關組織器官靶基因后與藥物芪甲扶正方治療肺腺癌相關性疲乏的潛在基因進行映射，如圖4所示：芪甲扶正方治療肺腺癌相關性疲乏的87個潛在基因可全部作用于紅細胞、T細胞、B細胞，大部分作用于肺72個、腦36個、腎上腺30個，少數作用于線粒體6個、脾臟4個。

2.7 富集分析結果

2.7.1 GO富集分析結果 GO富集獲得BP條目278個、CC條目38個、MF條目80個（P<0.05），根據Count值分別篩選前10個條目，采用條形圖展示（圖5），BP主要表現為促進RNA聚合酶Ⅱ啟動子的轉錄、抑制凋亡、抑制藥物陽性反應、調控DNA轉錄模板化過程、正向調控細胞增殖、正向調控基因表達、脂多糖的反應、對有毒物質的反應、細胞衰老、雌二醇反應;CC富集在細胞（核、質、膜）、細胞液、細胞外間隙、胞質的核周圍區(qū)域、以及內質網和線粒體等細胞器;MF主要涉及蛋白結合、酶結合、轉錄因子活性、ATP結合、蛋白激酶活性等。提示芪甲扶正方可對多部位進行調控發(fā)揮作用。

2.7.2 KEGG富集分析結果 KEGG富集分析篩選出83條信號轉導通路，Count排序前10的通路見圖6，包括PI3K-AKT信號通路、p53信號通路、腫瘤壞死因子信號通路、催乳激素信號通路、HIF-1信號通路、甲狀腺激素信號通路、分裂原激活的蛋白激酶信號通路、ErbB信號通路、Ras信號通路、FoxO信號通路。

2.8 分子對接結果 根據度值排序的前30個成分與前5個基因結合能見表2。結合能較高的4個對接模式圖分別為A：MAKP8-鞣花酸，B：IL-6-β-谷甾醇，C：EGFR-木犀草素，D：EGFR-木犀草素。如圖7所示，圖中藍色實線：代表氫鍵、灰色虛線：代表疏水作用。

3 討論

3.1 芪甲扶正方所含關鍵活性成分

研究共獲得中藥活性成分108個，關鍵靶點87個，以黃芪、仙鶴草、鼠婦所含活性成分最多，以黃酮類為主，具有抗炎、抗腫瘤作用，將上述108個成分中度值較高的30個核心成分與重要靶點進行分子對接，其結果表明EGFR與木犀草素、IL-6、MAKP3與β-谷甾醇、MAKP8與鞣花酸具有相對高的結合能力，提示木犀草素、β-谷甾醇、鞣花酸可能為芪甲扶正方發(fā)揮治療作用的重要成分。以上成分可能通過抑制肺腺癌的增殖、阻滯細胞周期、促進肺腺癌的凋亡等抗腫瘤作用改善肺腺癌患者的疲乏情況。其中，木犀草素主要來源于仙鶴草，屬于黃酮類化合物，可抑制肺癌細胞的增殖[15]。鞣花酸主要來源于仙鶴草，屬于天然多酚化合物，能抑制乳腺癌[16]、黑色素瘤[17]、胃癌[18]，阻滯細胞周期、誘導細胞凋亡[19]、改善炎癥[20]，抑制線粒體呼吸和肺癌細胞增殖[20]。β-谷甾醇主要來源于秦艽和半枝蓮，為膳食植物甾醇，能預防多種腫瘤的發(fā)生和生長，通過阻滯肺癌A549細胞周期于G2/M期來抑制細胞增殖[21]，同時促進細胞凋亡[22]，發(fā)揮抗腫瘤作用。

3.2 芪甲扶正方潛在的關鍵靶點分析

PPI網絡結果提示芪甲扶正方調節(jié)的靶蛋白與肺腺癌相關性疲乏相關的靶蛋白間具有復雜的相互作用關系;將調控網絡中靶點中以度值排序，初步分析前5個重要靶點多對細胞凋亡、炎癥、免疫等腫瘤相關的經典表型具有調節(jié)作用，其中caspase-3是執(zhí)行細胞凋亡的蛋白酶[23];EGFR是一種酪氨酸激酶受體，其過表達或突變與細胞增殖有關[24]，Landi等[25]的研究表明IL-7，IL-16和VEGF-A的減少可能與慢性疲勞綜合征有關;進一步分析發(fā)現，以上靶點可能通過調節(jié)炎癥表型發(fā)揮作用，這與既往研究報道指出的炎癥介質失調學說提出的炎癥介質表達增加在腫瘤患者疲乏的發(fā)生機制中起著重要作用的觀點相一致[26]，Rich等[27]的研究表明癌癥患者的疲勞癥狀、不良生命質量和治療結果均與腫瘤或宿主產生的炎癥介質有關，如IL-6、IL-1β、IL-10以及TNF-α等，其中IL-6研究的最為廣泛，如Wu等[28]的研究發(fā)現圍手術期胃腺癌患者疲乏評分與血漿IL-6的水平正相關。Inagaki等[29]亦得出IL-6可能在晚期癌癥患者的疲勞中發(fā)揮作用的結論?？偨Y可發(fā)現腫瘤、炎癥、腫瘤相關性疲乏三者之間相互影響，其中炎癥在腫瘤過程中發(fā)揮的作用已有總結[30]，而炎癥和腫瘤相關性疲乏之間的關系將是我們后續(xù)研究關注的重點。

3.3 芪甲扶正方治療肺腺癌相關性疲乏的潛在機制分析

GO富集分析結果表明，芪甲扶正方可作用于多個細胞組分，能多形式地調節(jié)細胞周期、抑制細胞凋亡生物進程，在肺腺癌相關性疲乏的炎癥、增殖等表型中起到保護作用;對交集基因進行組織定位分析發(fā)現，87個基因主要分布于紅細胞、T、B淋巴細胞、肺，也涉及腎上腺、脾、線粒體等部位，提示芪甲扶正方是通過多部位發(fā)揮治療作用。

KEGG通路富集分析結果表明，芪甲扶正方主要是通過PI3K-AKT信號通路發(fā)揮對肺腺癌相關性疲乏的治療作用的，該研究中有2種方式可激活該通路，一種是細胞外以IL-6為主的細胞因子與細胞膜上的IL-6受體結合，激活JAK，進而激活PI3K-AKT。另一種方式是直接被生長因子受體EGFR激活，該通路被激活后下游可與mTOR、P53、NF-κB、MAPK、VEGF等多條信號通路發(fā)生交互作用，從而調節(jié)蛋白合成、糖代謝、細胞增殖、DNA損傷、細胞循環(huán)、增殖、生存等多個表型[31]，這與一項人參皂苷通過激活PI3K-AKT抗老年大鼠疲勞綜合征的研究結論一致[32];腫瘤壞死因子通路主要是由核因子κB途徑和MAPK級聯，介導凋亡或壞死[33];FoxO信號轉導通路中，IL-6可與STAT3結合介導FOXO家族的磷酸化，進而調節(jié)自噬和免疫[34-35]。以上通路既有各自的特點也存在著明顯的交互作用，這與中醫(yī)整體觀念具有相似性。在后續(xù)研究中，我們將圍繞本研究得出的結論進行體內外實驗，以彌補本研究的缺陷和不足，從而為芪甲扶正方治療癌因性疲乏的深入研究提供科學依據。

4 結論

本研究預測芪甲扶正方的多種成分如木犀草素、β-谷甾醇、鞣花酸等可能通過作用于肺、T、B淋巴細胞、紅細胞等部位的IL-16、EGFR、MAKP3、MAKP8等靶點，調節(jié)以PI3K-AKT為主的多條凋亡相關的信號轉導通路，促進肺腺癌細胞凋亡從而發(fā)揮對肺腺癌相關性疲乏的治療作用。

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（2020-08-13收稿 責任編輯：馬雪玲，徐穎）