基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究人參防治創(chuàng)傷性應(yīng)激障礙藥效成分及作用靶點(diǎn)

王中立，干麗君，劉秀秀，李秀麗，易本誼

(九江學(xué)院護(hù)理學(xué)院，江西 九江 332000)

創(chuàng)傷性應(yīng)激障礙(post-traumatic stress disorder，PTSD)指經(jīng)歷超出承受能力的應(yīng)激事件后，出現(xiàn)以對(duì)相似應(yīng)激敏感性增高、睡夢(mèng)回顧應(yīng)激事件和焦慮為主要臨床表現(xiàn)的神經(jīng)精神疾病。由于社會(huì)生活模式轉(zhuǎn)變，生活工作壓力增加，應(yīng)激事件暴露機(jī)率增高，同時(shí)醫(yī)療系統(tǒng)對(duì)神經(jīng)精神疾病的重視及診斷標(biāo)準(zhǔn)的進(jìn)步，臨床上PTSD的發(fā)病人數(shù)逐年增多[1]。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，全球10%的人口經(jīng)歷過(guò)足以導(dǎo)致PTSD發(fā)病的應(yīng)激事件，其中60%的應(yīng)激事件經(jīng)歷者最終發(fā)展成為PTSD患者，一旦發(fā)病預(yù)后極差[2]。

PTSD的治療目前臨床主要采用心理疏導(dǎo)聯(lián)合藥物治療的方式，而臨床療效不能令人滿意，尤其在藥物治療領(lǐng)域。目前，治療PTSD的藥物中僅5-羥色胺再攝取抑制藥物被美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局認(rèn)可，然而通過(guò)大數(shù)據(jù)分析得到療效不確切的結(jié)論[3]。因此，尋找治療PTSD的有效藥物成為醫(yī)藥工作者一項(xiàng)重要的研究任務(wù)。

中醫(yī)學(xué)雖未有“創(chuàng)傷性應(yīng)激障礙”之病名，根據(jù)其臨床特征可將其歸屬于情志病范疇。中醫(yī)藥治療情志病具有自身的特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì)。臨床前研究通過(guò)對(duì)治療情志病常用中藥進(jìn)行篩選實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)了補(bǔ)氣類中藥防治PTSD的有效性，其中代表藥物為人參[4]。為了進(jìn)一步深入研究人參發(fā)揮藥理作用的機(jī)制，從而更好的應(yīng)用于臨床治療當(dāng)中，本文應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對(duì)人參有效成分、作用靶點(diǎn)以及可調(diào)控的病理生理過(guò)程進(jìn)行研究分析，為實(shí)證人參防治PTSD的研究提供線索和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)資料人參成分?jǐn)?shù)據(jù)來(lái)源于TCMSP數(shù)據(jù)分析平臺(tái)(http://tcmspw.com/index.php)，并根據(jù)中藥藥理學(xué)研究規(guī)范篩選潛在的有效成分作為研究對(duì)象[5]。篩選主要通過(guò)生物利用度和類藥性兩個(gè)指標(biāo)進(jìn)行，從而確定本研究的藥用成分(具體見(jiàn)研究結(jié)果1)。根據(jù)藥物成分獲得藥物的作用靶點(diǎn)信息，該數(shù)據(jù)同樣來(lái)源于TCMSP平臺(tái)。創(chuàng)傷性應(yīng)激障礙相關(guān)基因數(shù)據(jù)來(lái)源于Gene Card(https://www.genecards.org/)和OMIM(https://omim.org/)數(shù)據(jù)庫(kù)。將兩數(shù)據(jù)庫(kù)結(jié)果綜合去重后獲得疾病相關(guān)基因。

1.2 研究方法分析獲得人參有效成分中最有利于作為藥物應(yīng)用的有效成分，篩選條件為生物利用度≥30%，類藥性≥0.18。根據(jù)所篩選有效成分于數(shù)據(jù)庫(kù)中下載相應(yīng)作用位點(diǎn)。藥物作用位點(diǎn)與疾病相關(guān)基因做交集獲得藥物治療疾病潛在的作用靶點(diǎn)。分別對(duì)藥物治療疾病的作用靶點(diǎn)進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)互作分析(PPI)、基因本體論富集分析(GO)和信號(hào)通路富集分析(KEGG)，從而獲得潛在作用靶點(diǎn)中的核心靶點(diǎn)(對(duì)于功能的影響權(quán)重最大，處于PPI網(wǎng)絡(luò)中心)，了解靶點(diǎn)基因的主要生物學(xué)功能以及通過(guò)什么途徑發(fā)揮具體的生物學(xué)作用。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理基因注釋、分類及取交集應(yīng)用Perl計(jì)算機(jī)語(yǔ)言完成。藥物成分-疾病相關(guān)基因網(wǎng)絡(luò)圖應(yīng)用cytoscape軟件完成。蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)研究通過(guò)STRING(https://string-db.org/)。基因本體論富集分析、信號(hào)通路富集分析應(yīng)用R計(jì)算機(jī)語(yǔ)言完成。

2 結(jié)果

2.1 人參有效成分、作用靶點(diǎn)及疾病相關(guān)基因檢索根據(jù)研究方法中的篩選規(guī)則對(duì)人參有效成分進(jìn)行收集整理，數(shù)據(jù)來(lái)源TCMSP平臺(tái)，具體納入研究成分見(jiàn)Tab 1。藥物作用靶點(diǎn)及PTSD發(fā)病相關(guān)基因的具體內(nèi)容由數(shù)據(jù)庫(kù)平臺(tái)提供。

Tab 1 Overview of bioavailability and medicinal propertiesof ginseng components included in study

2.2 人參防治PTSD作用靶點(diǎn)預(yù)測(cè)人參藥用成分作用位點(diǎn)與PTSD發(fā)病相關(guān)基因做交集獲得人參防治PTSD作用靶點(diǎn)。共得到16個(gè)相交的基因，如Fig 2,分別是ADRB2、NR3C2、SLC6A2、SLC6A3、MAOB、MAOA、SLC6A4、OPRM1、PRKCA、HTR3A、NOS2、ACHE、HMOX1、IL1B、IFNG、ADCYAP1。

Fig 1 Network pharmacological analysis of targets of ginseng inprevention and treatment of traumatic stress disorder

Fig 2 Venn map of ginseng target for preventing PTSD

2.3 人參作用靶點(diǎn)與PTSD相關(guān)基因網(wǎng)絡(luò)關(guān)系通過(guò)藥物靶點(diǎn)與疾病相關(guān)基因的相交所獲得的信息，反向得到人參防治PTSD的有效成分，即藥物成分的作用位點(diǎn)與疾病相關(guān)基因相重合，這樣就形成了藥物成分-成分靶點(diǎn)-疾病基因的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控信息。根據(jù)研究方法中的預(yù)設(shè)條件共得到11種人參的藥用成分與PTSD發(fā)病密切相關(guān)的16個(gè)基因(見(jiàn)結(jié)果2.2)具有藥物靶點(diǎn)相互作用關(guān)系。11種人參藥用成分包括高麗槐素、吉九里香堿、人參皂苷Rh4、人參皂苷Rh2、灌木遠(yuǎn)志酮A、鄰苯二甲酸二異辛酯、脫氧三尖杉酯堿、β-谷甾醇、阿樸天仙子堿、豆甾醇和山奈酚。

2.4 人參藥物成分防治PTSD作用靶點(diǎn)相互作用分析根據(jù)人參防治PTSD靶點(diǎn)基因獲得所對(duì)應(yīng)的編碼蛋白，應(yīng)用String軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)相互作用分析，得到靶點(diǎn)蛋白之間的相互關(guān)系，同時(shí)分析獲得核心基因即網(wǎng)絡(luò)最中心的蛋白質(zhì)(與其他蛋白質(zhì)作用最廣泛，node值最大)，見(jiàn)Fig 3。

Fig 3 Results of PPI network analysis of targetsof ginseng in prevention and treatment of PTSD

2.5 人參藥物成分防治PTSD作用靶點(diǎn)基因本體論富集分析應(yīng)用GO富集分析的方法探討人參防治PTSD靶點(diǎn)基因在生理功能的富集情況，具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的前10位GO功能如Tab 2和Fig 4。結(jié)果顯示：靶點(diǎn)基因主要富集在離子通道和神經(jīng)遞質(zhì)兩大功能上。

Tab 2 Enrichment analysis of target genes ofginseng for prevention and treatment of PTSD

Fig 4 Results of GO enrichment analysis of targetsof ginseng in prevention and treatment of PTSD

2.6 人參藥物成分防治PTSD作用靶點(diǎn)基因信號(hào)通路富集分析應(yīng)用KEGG信號(hào)通路富集分析的方法探討人參防治PTSD靶點(diǎn)基因富集在那些信號(hào)通路上發(fā)揮作用，具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的前10位KEGG信號(hào)通路如Tab 3和Fig 5。結(jié)果顯示：靶點(diǎn)基因主要富集在單胺類神經(jīng)遞質(zhì)和突觸囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的信號(hào)通路上。

Fig 5 Results of KEGG enrichment analysis oftargets of ginseng in prevention and treatment of PTSD

Tab 3 Enrichment analysis of KEGG pathway ofginseng target for prevention and treatment of PTSD

3 討論

隨著大數(shù)據(jù)時(shí)代的到來(lái)，生物信息學(xué)被運(yùn)用于生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域中是一個(gè)必然的趨勢(shì)，體現(xiàn)在中藥的研究中就是網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)。本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對(duì)人參防治PTSD的藥物有效成分及靶點(diǎn)進(jìn)行了研究。研究結(jié)果顯示，人參所包含的11種有效成分分別作用于16個(gè)與PTSD發(fā)病密切相關(guān)的靶點(diǎn)基因，具有潛在的預(yù)防和治療PTSD的作用。進(jìn)一步對(duì)16個(gè)靶點(diǎn)基因進(jìn)行生物功能(GO)和信號(hào)通路(KEGG)分析，了解到人參通過(guò)調(diào)節(jié)5-羥色胺能突觸、兒茶酚胺能突觸和突觸小泡轉(zhuǎn)運(yùn)功能等途徑發(fā)揮防治PTSD的藥理學(xué)作用。其中最為關(guān)鍵的基因通過(guò)蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)(PPI)被發(fā)現(xiàn)，分別是5-羥色胺受體3A、單胺氧化酶A、腎上腺受體β2受體處于PPI網(wǎng)絡(luò)核心部位，可以作為重要靶點(diǎn)基因進(jìn)行驗(yàn)證研究。從人參有效藥用成分角度出發(fā)，研究結(jié)果顯示：人參有效成分中β-谷甾醇(beta-sitosterol)、豆甾醇(stigmasterol)、山奈酚(kaempferol)、阿樸天仙子堿(aposiopolamine)對(duì)神經(jīng)遞質(zhì)(包括5-羥色胺和單胺類神經(jīng)遞質(zhì))的轉(zhuǎn)運(yùn)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)水平及相對(duì)應(yīng)的受體具有調(diào)節(jié)作用。而吉九里香堿(girinimbin)、鄰苯二甲酸二異辛酯(diop)和灌木遠(yuǎn)志酮 A(frutinone A)在PTSD的防治過(guò)程中主要通過(guò)作用于β2腎上腺素能受體發(fā)揮作用。因此，人參可以通過(guò)調(diào)控單胺類神經(jīng)遞質(zhì)代謝，改變相關(guān)受體活性發(fā)揮防治PTSD的藥理學(xué)作用。

關(guān)于人參預(yù)防和治療神經(jīng)精神疾病的臨床前研究近年來(lái)被廣泛報(bào)道，其中也包括人參防治PTSD的文獻(xiàn)報(bào)道[6-8]。本課題組前期工作在C57BL/6N小鼠上發(fā)現(xiàn)人參水煎液可以逆轉(zhuǎn)由高皮質(zhì)酮血癥導(dǎo)致的行為異常，并進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)這一藥理作用可能通過(guò)神經(jīng)可塑性機(jī)制發(fā)揮作用，如興奮性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)、突觸可塑性、膠質(zhì)細(xì)胞功能異常等[9-10]。Gao等[11]應(yīng)用人參有效成分人參皂苷Rg2在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中獲得了相同的研究結(jié)果。以上臨床前研究與本文所獲得的研究結(jié)果相一致，都反映了人參具有防治PTSD的藥理作用，并且PTSD發(fā)病與神經(jīng)遞質(zhì)和突觸功能異常相關(guān)。臨床研究中通過(guò)對(duì)PTSD患者的辨證論治發(fā)現(xiàn)，有相當(dāng)一部分患者表現(xiàn)為本虛標(biāo)實(shí)，尤其對(duì)于患病時(shí)間較久的患者心膽氣虛和“恐傷腎”導(dǎo)致的腎氣虛為主要證型，臨床治療中采用補(bǔ)氣類中藥進(jìn)行治療取得較好的治療效果[12-15]。通過(guò)本次網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究能夠?yàn)槠涮峁┈F(xiàn)代藥理學(xué)基礎(chǔ)數(shù)據(jù)的支持。

本研究的意義在于：首先，研究結(jié)果從另一角度證實(shí)人參具有防治PTSD的藥理作用；其次，能夠解釋人參防治PTSD的不同機(jī)制出現(xiàn)的原因，是由于多成分多靶點(diǎn)所造成。最后，通過(guò)藥物靶點(diǎn)基因的綜合分析獲得了PTSD相關(guān)病理生理機(jī)制的信息，從這一角度出發(fā)可以進(jìn)一步闡述PTSD發(fā)生發(fā)展的神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制，這也是神經(jīng)藥理學(xué)重要的工作之一。然而，基于目前已知人參防治PTSD的文獻(xiàn)，本次網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究結(jié)果并沒(méi)有涵蓋所有已經(jīng)被報(bào)道的人參藥用成分與作用靶點(diǎn)。造成這一情況的原因：一方面由于藥物成分入選的條件是根據(jù)中藥藥理學(xué)通行的研究經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行主觀設(shè)定與真實(shí)情況存在一定差異，可能導(dǎo)致具有潛在良好藥效的成分未入選。另一方面，大量相關(guān)研究?jī)H僅停留在改善PTSD模型動(dòng)物功能表型這一水平，而沒(méi)有涉及到作用靶點(diǎn)這一藥理學(xué)關(guān)鍵問(wèn)題。因此，本研究的結(jié)果可能隨著相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)的不斷完善和研究方法的不但進(jìn)步發(fā)生變化。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究方法本質(zhì)上是基于數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)已有研究的總結(jié)歸納以及對(duì)具有潛在研究意義的工作預(yù)測(cè)，所以研究得到預(yù)測(cè)結(jié)果必須通過(guò)科學(xué)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行驗(yàn)證。

綜上所述，本研究結(jié)果為進(jìn)一步研究人參防治PTSD提供了依據(jù)和方向，尤其對(duì)人參有效成分治療本病的研究提供了備選成分和藥物靶標(biāo)，兩者相結(jié)合進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證可能獲得有意義的科學(xué)成果。