秦求思，李思敏，孟 粉，董 燁，毛海萍，張益奇，2，戴志遠，2*

（1浙江工商大學海洋食品研究院 杭州 310012 2浙江省水產(chǎn)品加工技術(shù)研究聯(lián)合重點實驗室 杭州 310012）

鷹爪蝦（Trachypenaeus curvirostris）俗稱厚殼蝦、雞爪蝦、沙蝦，隸屬對蝦科、鷹爪蝦屬，蝦體較粗短，甲殼很厚，主要產(chǎn)于黃海海域[1]。鷹爪蝦憑借著出肉率高、肉味鮮嫩、營養(yǎng)價值高等優(yōu)勢而暢銷中外。鷹爪蝦產(chǎn)量在眾多海捕蝦中位居第二，約43 萬t，占比22%以上[2-3]，有廣泛的消費市場[4-5]。海捕蝦目前大多以生鮮或凍品的形式銷售，其從海中被捕撈上岸至超市、菜市場銷售柜臺上，在這期間需要保持在低溫環(huán)境下，抑制海捕蝦的腐敗變質(zhì)，以保證海捕蝦的鮮度[6-9]，然而，由于物流鏈分為貯藏、運輸、銷售等不同環(huán)節(jié)，每部分物流鏈的溫度不同。有研究[10-11]顯示溫度波動會加速腐敗變質(zhì)速度，縮短海捕蝦在整個物流鏈中的貨架期，降低海捕蝦的經(jīng)濟價值。隨著國家對水產(chǎn)鮮度質(zhì)量要求越來越嚴格，如何有效檢測、控制水產(chǎn)品的鮮度變化情況，以及預測剩余貨架期，逐漸成為研究人員的關(guān)注熱點[12]。本試驗以鷹爪蝦為材料，通過模擬冷藏物流鏈與冷凍物流鏈，探究K 值、TVB-N 值、菌落總數(shù)等鮮度指標在溫度波動的冷鏈物流過程中隨物流時間推移的變化規(guī)律，建立對應(yīng)的動力學模型，為海捕蝦冷鏈物流條件下貨架期的預測提供理論依據(jù)，也為提高冷鏈物流中海捕蝦的鮮度提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

海捕鷹爪蝦（Trachypenaeus curvirostris），舟山市沈家門碼頭，系舟山海域的海捕蝦。

高氯酸、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、氯化鉀、腺苷三磷酸、氫氧化鈉、菌落計數(shù)培養(yǎng)基、氧化鎂、鹽酸，國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

落地式高速冷凍離心機、紫外分光光度計，美國Thermo 公司；高效液相色譜，沃特世科技（上海）有限公司；恒溫培養(yǎng)箱，德國BINDER 公司；BSA124S-CW 電子天平，賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；其它為實驗室常用儀器和設(shè)備。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品的處理 選取頭尾連接完整、大小相似的蝦體。用蒸餾水沖洗干凈，隨后用無菌紙吸去蝦體表面的水分，立即使用或放于-30 ℃的冰箱中保存。將處理好的鷹爪蝦分別置于-30，-18，0，4 ℃的冰箱內(nèi)，備用。

1.3.2 K 值的測定 根據(jù)Yokoyama 等[13]的方法進行修改，準確稱取攪碎后的蝦肉2.000 g 于50 mL 離心管中，加入10%高氯酸溶液5 mL，充分均質(zhì)后，于4 ℃，8 000 r/min 離心10 min，提取上層清。沉淀部分再加入5%高氯酸溶液5 mL，重復提取2 次并離心，合并上清液。用氫氧化鉀溶液調(diào)整上清液pH 值至6.4，放入冷藏室（4 ℃）中靜置30 min。濾紙過濾，將濾液轉(zhuǎn)移至50 mL 容量瓶中，用超純水定容至50 mL，用孔徑0.22 μm 的無機濾膜過濾，采用液相色譜測定，整個過程在0～4 ℃下操作。

高效液相色譜（HPLC）條件：色譜柱Sunfire C18（4.6 nm×150 nm），流動相為0.05 mol/L 磷酸氫二鉀和0.05 mol/L 磷酸二氫鉀（體積比1∶1）混合液，調(diào)pH 值至6.4，液相流速0.8 mL/min，柱溫35℃，紫外檢測波長254 nm，進樣量10 μL。根據(jù)標準品的保留時間定性，采用外標法定量。

1.3.3 揮發(fā)性鹽基氮（TVB-N）的測定 按照國標GB 5009.228-2016 的半微量定氮法[14]測定揮發(fā)性鹽基氮，結(jié)果以mgN/100g 蝦肉表示。

1.3.4 菌落總數(shù)的測定 參照國標GB 4789.2-2016 中的傾注平板法[15]測定菌落總數(shù)。

1.3.5 貨架期模型建立 將鷹爪蝦于4，0，-18，-30 ℃貯藏，每隔一段時間記錄海捕蝦的K 值、TVB-N 值、菌落總數(shù)鮮度指標，用于海捕蝦鮮度指標的動力學模型[16]分析。定期測定鮮度指標因子（所有測試至少3 個平行樣），得到不同貯藏溫度下的鮮度指標與貯藏時間（t）的變化曲線，經(jīng)過擬合分析得出海捕蝦的各項鮮度指標變化符合一級動力學公式：

式中，F(xiàn)（t）——某t 時刻下的某一鮮度指標數(shù)；F——貨架期末期時的某一鮮度指標數(shù)；F0——初始時的某一鮮度指標數(shù)；k——某一鮮度指標的反應(yīng)速率常數(shù)；t——貯藏時間（d）。

利用動力學方程式求得不同溫度貯藏下的速率常數(shù)k 之后，以lnk 為縱坐標，以1/T 為橫坐標，做出一條斜率為-Ea/R，截距為lnk0的直線圖，從而求得各項鮮度指標的活化能，以此建立貨架期模型。

式中，k——某T 溫度下的反應(yīng)速度常數(shù)；Ea——活化能（J/mol）；T——某時刻絕對溫度（K）；R——氣體常數(shù)，8.314 J/（mol·K）；k0和Ea——與試驗材料本身有關(guān)的常數(shù)。

將式（2）兩邊取對數(shù)，得式（3）：

將lnk 作為縱坐標，將1/T 作為橫坐標，可做出一條斜率為-Ea/R、截距為lnk0的各項鮮度指標的Arrhenius 直線圖，擬合分析得到各鮮度指標的回歸方程、k0、Ea、回歸系數(shù)R2。

將式（1）和式（3）聯(lián)立，解得恒溫條件下海捕蝦的貨架期（shelf-life）計算公式為：

式中，ln（F/F0）、k0、Ea、R——均為恒定數(shù)值，故貨架期tSL與溫度的倒數(shù)1/T 呈指數(shù)關(guān)系；F——貯藏第t 天的品質(zhì)指標；F0——初始品質(zhì)指標值；可將式（4）變形得到式（5）：

式中，a、b——特征常數(shù)；k0、Ea、R 可通過Arrhenius 方程[17]擬合求得。

根據(jù)食品TTT 理論[18]可知，食品在流通期間由于溫度、時間的改變造成鮮度降低是不可逆的、累積的[19]。因此可假設(shè)海捕蝦在某一物流溫度Tn條件下的貨架期為tSLn，在此物流溫度下的貯藏時間為t，那么在下一個物流溫度Tm下的剩余貨架期tR由式（6）表示：

1.3.6 剩余貨架期預測模型的可行性驗證

1.3.6.1 冷藏物流鏈 為模擬海捕蝦冷藏物流鏈的溫度變化，設(shè)定如下物流環(huán)節(jié)：貯藏中心冷庫的海捕蝦貯藏溫度為0 ℃，冷藏運輸設(shè)備箱體內(nèi)的運輸溫度為4 ℃，銷售終端為鋪冰銷售[20]。具體冷藏物流鏈模擬過程如圖1所示。

圖1 冷藏物流鏈過程中溫度變化情況模擬Fig.1 Simulated situations of temperature changes in cold chain logistics process

1.3.6.2 冷凍物流鏈 為模擬海捕蝦的冷凍物流鏈的溫度變化，設(shè)定物流鏈環(huán)節(jié)溫度如下：貯藏中心冷庫的海捕蝦貯藏溫度為-30 ℃，冷凍運輸車輛的箱體運輸溫度為-18 ℃，銷售終端為鋪冰銷售。具體冷凍物流鏈模擬過程如圖2所示。

圖2 冷凍物流鏈過程中溫度變化情況模擬Fig.2 Simulated situations of temperature changes in frozen chain logistics process

1.3.7 數(shù)據(jù)分析 鷹爪蝦平行取樣3 次進行各個含量的測定，試驗數(shù)據(jù)采用Origin 進行數(shù)據(jù)的處理和分析，測定結(jié)果用“平均值±標準偏差”表示，以P<0.05 為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 貯藏過程中鷹爪蝦鮮度指標的變化

如圖3a 所示，以K 值超過40%[21]作為海捕蝦的貨架期終點，鷹爪蝦在4 ℃貯藏期間的K 值均在第5 天接近40%，在第6 天超過40%，到達貨架期終點。在0 ℃貯藏期間鷹爪蝦的K 值均于第10天接近40%，在第12 天超過40%，達到貨架期終點。如圖3b 所示，鷹爪蝦在-18 ℃下的K 值變化情況相較于4 ℃和0 ℃的變化情況來說，鷹爪蝦在-18 ℃下K 值的變化緩慢。這可能是因為在-18℃的溫度條件下，海捕蝦內(nèi)的大部分水分處于結(jié)晶狀態(tài)，只有部分的游離水能被利用，并且低溫抑制了酶和微生物的活動[22]，從而使得K 值變化趨勢平緩。鷹爪蝦在第24 周時K 值達到32.9%，未到貨架期終點。鷹爪蝦在-30 ℃下的K 值變化情況見圖3b，相較于-18 ℃下K 值的變化情況來說，鷹爪蝦在-30 ℃下K 值的變化更趨緩慢。在第12周時K 值變化速度突然加快，這可能是因為微生物在此時新陳代謝活動開始變得活躍，腺苷三磷酸被大量分解。鷹爪蝦在第24 周時K 值達到18.27%，還未達貨架期終點。-18 ℃與-30 ℃的測定結(jié)果與楊金生等[23]的結(jié)果相似。

由圖3c 可知，在貯藏期間，鷹爪蝦的TVB-N值逐日增大，鮮度逐日降低。在4 ℃的貯藏后期，隨著微生物大幅度生長繁殖，蛋白質(zhì)不斷被降解，使得TVB-N 值增加速度加快[24]，參比上限標準，鷹爪蝦在第5 天時測得的TVB-N 值十分接近30 mg/g 這一上限，在第6 天時達到不能食用的判定終點。在0 ℃貯藏條件下，鷹爪蝦在第12 天時所測得的TVB-N 值達到了30 mg/100 g 不可食用上限。鷹爪蝦在-18 ℃的TVB-N 值的變化規(guī)律見圖3d。從圖中可知，在-18 ℃整個貯藏期間，鷹爪蝦的TVB-N 值上升平緩，在第24 周鷹爪蝦的TVB-N值為20.4 mg/100 g，對比30 mg/100 g 的上限，鷹爪蝦此貯藏過程中均未達到標準所規(guī)定的上限，測定結(jié)果與李秀霞等[25]的結(jié)果相近。相較于-18℃，在-30 ℃貯藏期間，鷹爪蝦的TVB-N 值上升更加平緩，貯藏測定末期TVB-N 值更低。在第24周時，鷹爪蝦的TVB-N 值為15.03 mg/100 g，在貯藏過程中未達到標準所規(guī)定的上限，所得的結(jié)果與相關(guān)文獻[26]相近。

海捕蝦的初始微生物含量受海域環(huán)境的影響，海捕蝦被捕死后，其體表附著活躍生長繁殖的微生物是造成蝦品質(zhì)改變的重要原因之一；隨著微生物的生命活動開始活躍，蝦內(nèi)的大分子物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、糖類、脂質(zhì)等被分解成醛、酮、醇、氨基酸、組胺等小分子產(chǎn)物，使得蝦在貯藏后期出現(xiàn)腐敗變質(zhì)，產(chǎn)生酸臭味；因此，蝦體內(nèi)微生物的含量，即菌落總數(shù)，能及時的反映蝦的品質(zhì)[27-29]。由圖3e可知，4 ℃貯藏時鷹爪蝦在第5 天時菌落總數(shù)超過了6 lg（CFU/g），結(jié)合K 值和TVB-N 值的測定結(jié)果，認為鷹爪蝦的貨架期均為5 d。當溫度為0 ℃時，鷹爪蝦在第10 天時，菌落總數(shù)超過了6 lg（CFU/g），結(jié)合K 值和TVB-N 值的測定結(jié)果，認為在0 ℃條件下鷹爪蝦的貨架期為10 d。由圖3f可知，在-18 ℃和-30 ℃下，雖然菌落總數(shù)整體上呈增加趨勢，但由于低溫影響了微生物的生命活動及酶解作用，菌落總數(shù)的增加速度受到了抑制[30]。貯藏第24 周時，-18 ℃鷹爪蝦的菌落總數(shù)為5.91 lg（CFU/g）；-30 ℃的鷹爪蝦的菌落總數(shù)為4.82 lg（CFU/g）。結(jié)合K 值和TVB-N 值的測定結(jié)果，此時-18 ℃和-30 ℃下，鷹爪蝦均未到貨架期終點，說明低溫更易蝦的貯藏。

圖3 不同貯藏溫度下鷹爪蝦K 值、TVB-N 和菌落總數(shù)的變化Fig.3 Changes in K value，TVB-N，and TVC of shrimps at different storage temperatures

2.2 貨架期模型的建立

將蝦于4，0，-18，-30 ℃貯藏，每隔一段時間記錄蝦的K 值、TVB-N 值、菌落總數(shù)等鮮度指標，用于海捕蝦鮮度指標的動力學模型分析。在食品加工貯藏過程中，食品的鮮度指標（A）變化均遵循動力學規(guī)律[31]，通過能級函數(shù)分析選用不同的鮮度函數(shù)表達式（Quality function），一般來說，零級動力學模型為A=A0+kt，一級動力學模型為A=A0ekt，式中，t——時間；A——t 時刻的鮮度；A0——初始時刻的鮮度。本試驗根據(jù)鷹爪蝦的鮮度指標變化參數(shù)，采用Origin 8.6 對其進行擬合分析，得到速率常數(shù)和決定系數(shù)，結(jié)果見表1，R2值越大說明擬合度越高，由表1可知，不同貯藏溫度下K 值的回歸系數(shù)分別為0.9626，0.9417，0.9567，0.9720；TVB-N 值的回歸系數(shù)分別為0.9897，0.9828，0.9846，0.9579；菌落總數(shù)的回歸系數(shù)分別為0.9860，0.9676，0.9893，0.9839；各個鮮度指標的一級回歸方程的R2都大于0.9，且一級回歸方程的∑R2大于零級回歸方程的∑R2，綜合考慮，鷹爪蝦的各項鮮度指標變化符合一級動力學方程。

表1 鷹爪蝦于不同貯藏溫度的鮮度指標變化的動力學模型參數(shù)Table 1 Kinetics model in freshness index of Trachypenaeus curvirostris at different storage temperatures

由圖3結(jié)合表1可知，海捕蝦在不同貯藏溫度下貯藏過程中K 值與貯藏時間均呈顯著正相關(guān)（P<0.05），在4 ℃時，鷹爪蝦K 值YK1與貯藏時間X 的線性關(guān)系為YK1=7.93071X-3.23071（R=0.9466）。在0 ℃時，鷹爪蝦K 值YK2與貯藏時間的線性關(guān)系為YK2=3.65536X-1.975（R=0.9538）。對-18 ℃下海捕蝦的K 值和貯藏時間X 進行線性相關(guān)性分析，得出鷹爪蝦K 值YK3與貯藏時間X 的線性關(guān)系為YK3=0.18599X-0.785（R=0.9665）。-30 ℃貯藏溫度下鷹爪蝦K 值YK4與貯藏時間X的線性關(guān)系為YK4=0.10343X-0.3025（R=0.9235）。

除此之外，不同貯藏溫度下海捕蝦的TVB-N含量YTVB-N與貯藏時間X 有顯著相關(guān)（P<0.05），且為正相關(guān)性。在4 ℃貯藏過程中，鷹爪蝦TVB-N值YTVB-N1與時間X 的線性方程為YTVB-N1=5.28893X+2.49464（R=0.91561）。當貯藏溫度為0 ℃時，鷹爪蝦TVB-N 值YTVB-N2與時間X 的線性方程為YTVB-N2=2.38804X+3.61321（R=0.9521）。在-18 ℃下，鷹爪蝦TVB-N 值YTVB-N3與時間X 的線性方程為YTVB-N3=0.08421X+5.12357（R=0.9506）。對-30 ℃貯藏中的海捕蝦的TVB-N 含量與貯藏時間進行線性相關(guān)性分析，分別得到了鷹爪蝦TVBN 值YTVB-N4與時間X 的線性方程為YTVB-N4=0.04676X+5.66929（R=0.8885）。

從整個貯藏期間來看，對貯藏時間和海捕蝦菌落總數(shù)兩者進行線性相關(guān)性分析，貯藏時間和海捕蝦菌落總數(shù)之間存在顯著正相關(guān)性，得出當溫度為4 ℃時，鷹爪蝦菌落總數(shù)YTVC1和時間X 之間的一次線性方程為YTVC1=0.61429X+3.32143（R=0.9855）。當溫度為0 ℃時，鷹爪蝦菌落總數(shù)YTVC2和時間X 之間的一次線性方程為YTVC2=0.32589X+3.11893（R=0.9137）。當貯藏溫度降至-18 ℃時，鷹爪蝦菌落總數(shù)YTVC3和時間X 之間的一次線性方程為YTVC3=0.01489X+3.3325（R=0.9747）。當貯藏溫度達到-30 ℃時，鷹爪蝦菌落總數(shù)YTVC4和時間X 之間的一次線性方程為YTVC4=0.00801X+3.42429（R=0.9771）。

經(jīng)表1的擬合分析得到速率常數(shù)k，結(jié)合Arrhenius 方程（2）能較好地反映食品的鮮度變化速率，將其與動力學方程式結(jié)合并運用于食品腐敗變質(zhì)速度的研究，利用動力學方程式求得不同貯藏溫度下k0、Ea、回歸系數(shù)R2，見表2。從表2可知，各項鮮度指標的擬合度都較好，R2都高于0.9，與相關(guān)研究具有統(tǒng)一性[32-33]。這說明各項指標的速率常數(shù)k 和阿倫尼烏斯公式擬合程度較好，能反映出海捕蝦在不同貯藏溫度下鮮度指標反應(yīng)速率常數(shù)k 隨著溫度變化的情況。

表2 鷹爪蝦鮮度指標在不同貯藏溫度下Arrhenius方程擬合結(jié)果Table 2 Quality index of Trachypenaeus curvirostris on the Arrhenius equation fitting results at different temperatures

根據(jù)食品TTT 理論可知，食品在流通期間由于溫度、時間的改變造成鮮度降低是不可逆的、累積的。將式（5）帶入式（6）中，可得到本試驗中以各項指標為判定指標下的海捕蝦剩余貨架期預測模型，對于鷹爪蝦來說，以各項鮮度指標作為判斷指標，所得的鮮度指標與時間之間的方程如式（7）～（9）：

K 值貨架期預測模型為：

TVB-N 貨架期預測模型為：

菌落總數(shù)的貨架期預測模型為：

式中，Tn——某一物流溫度（℃）；tSLn——某一物流溫度下貨架期（d）；t——此物流溫度下的貯藏時間（d）；tR——在下一個物流溫度Tm下的剩余貨架期（d）。

2.3 剩余貨架期預測模型的可行性驗證

2.3.1 冷藏物流鏈下的剩余貨架期預測模型的有效性驗證 將各項鮮度指標超過腐敗時，作為貨架期終點，根據(jù)上述各項指標的貨架期預測公式求得各貨架期預測值，并與實測值相比較，驗證冷藏物流鏈下，海捕蝦各項指標預測值與實測值的差異。表3是在冷藏模擬物流鏈下，以K 值、TVBN 值和菌落總數(shù)作為判斷貨架期的依據(jù)，計算鷹爪蝦貨架期的預測值，與實測值相比較，并綜合分析確定鷹爪蝦的最終貨架期。

表3結(jié)果表明，在冷藏物流鏈中，鷹爪蝦的最終貨架期為7.2 d。驗證結(jié)果表明，本研究所得鷹爪蝦的變溫貨架期預測模型所獲得的貨架期準確率較高，預測值與實測值的相對誤差的絕對值不超過5%，因此借助本模型以K 值、TVB-N 值和菌落總數(shù)為評判指標可以較好地預測冷藏鏈下鷹爪蝦的鮮度變化情況和貨架期。

表3 海捕蝦在冷藏物流鏈下貨架期的預測值與實測值Table 3 The predicted value and the measured value shelf-life of shrimps in cold chain logistics process

2.3.2 冷凍物流鏈下的剩余貨架期預測模型的有效性驗證 將各項鮮度指標超過腐敗時作為貨架期終點，根據(jù)上述各項指標的貨架期預測公式求得相應(yīng)的預測值，并與實測值相比較驗證。表4列出在冷凍模擬物流鏈下，以K 值、TVB-N 值和菌落總數(shù)為判斷貨架期的依據(jù)，通過對比鷹爪蝦貨架期的預測值與實測值，確定海捕蝦的最終貨架期。表4結(jié)果表明，在冷凍物流鏈中，鷹爪蝦的最終貨架期為31.2 d。本研究所得的海捕蝦的變溫貨架期預測模型所獲得的貨架期準確率較高，兩者相對誤差的絕對值不超過5%，因此借助本模型以K 值、TVB-N 值和菌落總數(shù)為評判指標可以較好地預測冷凍物流鏈下鷹爪蝦的鮮度變化情況和貨架期。

表4 海捕蝦在冷凍物流鏈下貨架期的預測值與實測值Table 4 The predicted value and the measured value shelf-life of shrimps in frozen chain logistics process

3 結(jié)論

為實時監(jiān)測鷹爪蝦的鮮度指標變化和貨架期，本研究依據(jù)鷹爪蝦在不同溫度貯藏過程的鮮度指標：K 值、TVB-N 值、菌落總數(shù)的變化情況，再根據(jù)動力學模型與Arrhenius 方程結(jié)合構(gòu)建貨架期預測模型。結(jié)果顯示鷹爪蝦在貯藏過程中，K值、TVB-N 值和菌落總數(shù)3 項鮮度指標隨著溫度的降低，各指標的變化幅度越小，且其變化規(guī)律均符合一級動力學，反應(yīng)速率隨貯藏溫度的升高均不斷加快。本研究所建立的以K 值、TVB-N 值和菌落總數(shù)指標的貨架期模型經(jīng)驗證，相關(guān)性系數(shù)均大于0.9，且對應(yīng)貨架期的相對誤差小，因此可以為變溫冷鏈物流中實時監(jiān)測海捕蝦新鮮度的變化提供參考，并對海捕蝦在物流運輸、市場銷售過程中鮮度的控制提供理論參考技術(shù)。