高糖-氧化應激相關信號通路對各系統(tǒng)疾病的影響

唐柳歡，袁 媛，2，崔校基，蔡 潔，梁 盈*

（1中南林業(yè)科技大學食品科學與工程學院 稻谷及副產物深加工國家工程實驗室 長沙 410004 2湖南中醫(yī)藥高等?？茖W校 湖南株洲 412012）

氧化應激是指在體外或體內有害因素刺激下，機體產生過量自由基，細胞內氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)失衡，氧自由基和相關代謝產物過量聚集，使細胞產生多種毒性作用的狀態(tài)[1]。引起氧化應激的外在因素包括自身不良的生活方式，如喝酒、吸煙、服用藥物等，環(huán)境中的污染物、重金屬或者石化制品也容易引起氧化應激；內在因素包括機體血糖調節(jié)失衡、血脂代謝紊亂、慢性或急性感染等[2]。引起機體各系統(tǒng)如循環(huán)系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)、神經系統(tǒng)等氧化應激的原因及其表現形式和發(fā)生機制不盡相同。在氧化應激狀態(tài)下，機體會積累過量的活性氧（Reactive oxygen species，ROS），造成蛋白質、核酸和脂質等生物分子損傷，進而導致糖尿病、心臟病、阿爾茲海默癥、帕金森病等疾病發(fā)生[3-5]。

據國際糖尿病聯(lián)盟報道，2019年全球約4.63億成人患有糖尿病，其中國內患病人數高達1.16億；2009—2019年，糖尿病患者人數增長了30%，預計到2045年，全球糖尿病患病人數可達7 億[6]。機體長期處于高血糖水平會導致廣泛的血管損傷，從而影響心臟、腎臟、眼睛和神經。糖尿病患者中，心血管疾病（Cardiovascular diseases，CVD）的患病概率比非糖尿病患者高出2～3 倍[7]；糖尿病腎?。―iabetic kidney disease，DKD）的患病率比非糖尿病患者高出10 倍；視網膜病變的患病率高達35%。由于患病率逐年增長，并且并發(fā)癥多、癥狀嚴重，糖尿病現已成為嚴重的公共健康問題。高糖飲食與糖尿病有密切聯(lián)系，構建高糖（High glucose，HG） 細胞及動物模型模擬體內高血糖環(huán)境，是研究糖尿病生理病理發(fā)生機制的有效途徑之一。目前大多數研究圍繞各種效應物對高糖引起的氧化損傷的保護作用展開，也有少部分研究探討效應物的作用機制，然而氧化應激相關信號通路的調控在其中的關鍵性作用甚少報道[8-14]。本課題組長期專注于研究氧化應激作用機制及其相關信號通路[15-18]，結合高糖氧化應激近5年來的研究成果，根據糖尿病及其在機體各系統(tǒng)中的并發(fā)癥損傷，篩選出與其密切相關的信號通路，并對這些通路進行分析比較，為研究高糖引起的氧化應激及其作用機制提供參考，也為氧化應激的靶向研究提供理論依據。

1 高糖引起氧化應激細胞研究類型的選擇

目前研究氧化應激的方法主要有細胞模型法、動物模型法和臨床試驗。生物體結構復雜，單一功效的效應物通常會引起機體其它連鎖反應。臨床試驗最能直觀反映出效應物的作用效果，是效應物實際應用必經之路，需要基于大量動物模型和細胞模型研究，并且要求試驗效果穩(wěn)定可靠、應用價值高，對前期的研究基礎要求很高。動物模型法能提供真實的體內環(huán)境，準確全面地反應出效應物的功效，然而也具有簡單化、不確定性因素多、試驗周期較長、指標模糊及物種間差異大等缺點。細胞模型法是利用應激源處理細胞構建模型，破壞細胞內原有正常的氧化還原狀態(tài)，通過產生損傷細胞的物質，損傷細胞的核酸、蛋白質、脂質等，模擬體內氧化應激的狀態(tài)[19]。進行氧化應激相關信號通路的研究，細胞模型必不可少。

機體的各個部位或系統(tǒng)均會發(fā)生氧化應激，根據研究目的挑選相應的細胞株建立模型，有助于研究應激源的損傷效果和作用機制，準確評價或篩選效應物[20]。糖尿病是一種嚴重的代謝綜合征，會導致多種心血管疾病和其它并發(fā)癥，高血糖癥即是糖尿病的明顯病癥。血管內皮細胞位于血管內表面，能直接與血液接觸，血液中的循環(huán)物質如血糖、血脂和炎癥因子容易造成內皮細胞損傷，而高血糖可引起內皮細胞損傷已被廣泛認可，因此，掌握高糖對內皮細胞的損傷機制對于預防糖尿病對機體的損傷具有重要意義。選用內皮細胞構建糖尿病模型，能直觀反應出高糖對細胞的損傷程度以及效應物在細胞內的代謝和利用情況，模擬生物體內氧化應激狀態(tài)，同時也有利于開展相關信號通路的研究。

糖尿病及其并發(fā)癥主要損傷人體的循環(huán)系統(tǒng)和泌尿系統(tǒng)，對神經系統(tǒng)的損傷也非常大，選擇合適的細胞株是構建高糖損傷細胞模型的關鍵，不同細胞功能各異，發(fā)生氧化應激后表現出的癥狀不盡相同，并且不同細胞對應激源及效應物的敏感程度也不同，需要根據所研究效應物的作用靶點和機制來選擇對應的細胞株，才能建立起準確對應生物體內環(huán)境的研究模型（表1）。

表1 高糖引起氧化應激常用的細胞模型及其應用Table 1 Common cell models of oxidative stress caused by high glucose and their applications

糖尿病及其并發(fā)癥中，高糖損傷的系統(tǒng)或器官位點不一，根據研究目的挑選相應系統(tǒng)或器官的細胞株建立高糖損傷模型，有助于開展相關研究。在糖尿病患者中，2 型糖尿病患者占總患病人數的90%[44]，而β 細胞功能障礙和胰島素抵抗是2型糖尿病及其血管并發(fā)癥病理生理學中最相關的2 種機制[45-48]。2 型糖尿病患者若持續(xù)處于高血糖水平狀態(tài)易誘發(fā)氧化應激，導致心血管損傷[49]，通常采用人臍靜脈內皮細胞[21]、人主動脈內皮細胞、大鼠血管內皮細胞和血管平滑肌細胞構建模型。血管內皮祖細胞參與損傷血管的修復，氧化應激反應會減少血管內皮祖細胞的生成，而血管內皮祖細胞的數量影響其對損傷血管的修復程度[24]，因此血管內皮祖細胞常被用作研究模型。在糖尿病的諸多并發(fā)癥中，心血管疾病是最主要的一種，2/3 以上糖尿病患者都伴隨有心血管疾病[50]，氧化還原失衡在心血管疾病中起著重要作用[51]。試驗材料常選擇大鼠心肌細胞或大鼠心臟成纖維細胞[30]，能相應地表征高糖對心血管細胞或心肌細胞氧化應激的影響[28]。紅細胞死亡是糖尿病另一并發(fā)癥，高糖誘導ROS 過量產生，改變血細胞代謝和生化功能，從而導致紅細胞死亡，在這類研究中，紅細胞作為研究對象是減輕高糖引起紅細胞死亡的有效途徑。

糖尿病有多種慢性微血管并發(fā)癥，DKD 是常見的一種[52]，在糖尿病的并發(fā)癥中占20%～35%[53]。在終末期腎臟疾病（End-stage renal disease，ESRD） 中，有80%的病例是由糖尿病、高血壓或兩者共同造成的[7]。高糖會導致內皮細胞出現功能障礙，腎小管上皮細胞出現空泡，腎小管發(fā)生纖維化并伴隨間質炎癥[54-55]，最終導致腎功能衰竭[56-58]。大鼠腎小球系膜細胞[34]、人腎小球系膜細胞[59]、人腎小管上皮細胞、大鼠腎小管導管上皮細胞和足細胞等常被用于構建糖尿病腎臟疾病研究模型。高糖刺激巨噬細胞后導致其趨化功能增強，增加促炎因子分泌，加速DKD 的進展，因此也常選取巨噬細胞作為研究DKD 的對象[38-39]。

在糖尿病慢性微血管并發(fā)癥中，另一種最常見也是最主要的并發(fā)癥是糖尿病視網膜病變（Diabetic retinopathy，DR），2015年全球有1.45 億人患有DR，糖尿病患者中DR 的患病率高達35%，增生性視網膜病變患病率為7%[7]。大多數糖尿病患者失明與DR 有密切聯(lián)系[60]，常選取人視網膜內皮細胞、小鼠視網膜上皮細胞和視網膜神經節(jié)細胞作為研究對象，高糖改變了視網膜相關細胞的結構和功能，導致視野缺損，并最終導致失明[61]。由于高糖導致氧化或抗氧化防御系統(tǒng)能力降低，會觸發(fā)神經細胞死亡，引起神經病變，局部神經調節(jié)劑在介導或預防高糖引起的神經毒性中起著重要作用。鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤暴露于神經生長因子下時呈現神經元表型，能構成作為研究高糖水平引起不利神經元效應機制的模型[43]。人神經母細胞瘤細胞具有類似于正常神經細胞的生物學特性，也常被用于研究高糖誘導的神經毒性[42]。

2 高糖引起的氧化應激相關細胞信號通路

糖尿病與氧化應激的聯(lián)系非常密切，當機體處于氧化應激狀態(tài)時，自由基的含量會大幅增加，包括ROS 和活性氮自由基（Reactive nitrogen species，RNS）。自由基不僅對細胞產生直接損傷，還會調控多條信號通路，如核因子-κB（NF-κB），Kelch 樣環(huán)氧氯丙烷相關蛋白-1-核因子E2 相關因子2/抗氧化反應元件（Keap1-Nrf2/ARE），p38絲裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK），胎盤生長因子/細胞外調節(jié)蛋白激酶（PIGF/ERK），磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/AKT）等[62-64]，進而導致機體組織損傷。氧化應激調控的信號通路涉及多種生理病理反應，在應激反應過程中起著不可替代的作用，研究對應的細胞信號通路有助于探明效應物的作用機制及作用靶點。

2.1 高糖引起的氧化應激與NF-κB 信號通路的關系

眾多研究發(fā)現，NF-κB 信號通路在細胞氧化應激相關的心血管疾病中起著關鍵作用[65-67]，NFκB 信號傳導是調節(jié)ROS 產生和炎癥的經典途徑[68]。該途徑的激活可以增加ROS 的產生并加速氧化應激進程，進而引起內皮功能障礙。糖尿病患者細胞內生成的ROS 會通過信號傳導致使NFκB 解離，二聚體結構消失，NF-κB/p65 亞基被繼續(xù)修飾，并由細胞質進入細胞核，導致NF-κB 核轉位[69-71]。Fei 等[72]研究證實NF-κB 信號轉導途徑是高血糖引起內皮功能障礙的關鍵致病機制，高糖處理人臍靜脈內皮細胞后，激活了NF-κB 和MAPK 信號通路，并證明囊性纖維化跨膜電導調節(jié)劑通過抑制NF-κB 和MAPK 信號傳導，減輕高糖誘導的內皮細胞氧化應激和炎癥。

2.2 高糖引起的氧化應激與Keap1-Nrf2/ARE信號通路的關系

Nrf2 是一種轉錄因子，在穩(wěn)態(tài)條件下位于胞質溶膠中，在調控氧化應激保護性通路中發(fā)揮著重要作用。研究高糖引起的心血管疾病時，Keap1-Nrf2/ARE 信號通路也常被當做另一重點研究對象。在高糖刺激下，Keap1 啟動子發(fā)生甲基化，激活自身的轉錄，使得Nrf2 多泛素化，蛋白酶體降解減弱[73]，進而使得細胞核中Nrf2 的水平快速增加[74]，間接參與細胞抗氧化應激[75]。Zuo 等[76]研究發(fā)現，HG 誘導的足細胞損傷與DKD 的發(fā)病機制密切相關，含溴結構域蛋白4（BRD4）在HG 刺激后表達量顯著增加，抑制BRD4 會促進Nrf2 核易位并上調Nrf2 和ARE 的轉錄活性，進而減少HG 對足細胞的損傷，表明Nrf2/ARE 與DKD 的發(fā)病機制有關。

2.3 高糖引起的氧化應激與p38 MAPK 信號通路的關系

DKD 的發(fā)病機制與多條信號通路有關，在這些相關的通路中，p38 MAPK 信號通路起著關鍵作用[77]，主要與細胞凋亡相關，常被用于研究高糖引起的DKD 等相關機制的靶途徑。磷酸化p38 MAPK 對細胞增殖、生長和分化有促進作用[78-79]。高糖引起細胞氧化應激，激活p38 MAPK 通路，引起一系列反應如腎小球硬化，激活后的p38 MAPK 通路又反過來加重氧化應激狀態(tài)。姚新明等[34]用高糖培養(yǎng)大鼠腎小球系膜細胞，發(fā)現高糖引起腎小球系膜細胞氧化應激，也導致磷酸化p38 MAPK 的蛋白質水平比正常狀態(tài)高，而這些變化可以被p38 MAPK 抑制劑和抗氧化劑減輕；表明該細胞中p38 MAPK 通路被高糖激活，同時p38 MAPK 的活化又會反過來加重氧化應激的程度，導致氧化損傷。其它相關研究也證明高糖通過介導p38 MAPK 途徑引起氧化應激，如Wang等[37]研究發(fā)現HG 通過AMPK / p38 MAPK 途徑引起氧化應激，誘導大鼠腎小管導管上皮細胞凋亡。在DR 的相關研究中，效應物通過抑制p38 的活化調節(jié)MAPK 信號通路，達到抑制氧化應激的效果[8]。

2.4 高糖引起的氧化應激與PIGF/ERK 信號通路的關系

高糖誘導的DR 發(fā)病機制中，PIGF/ERK 信號通路起關鍵作用[80]，促血管生成和炎癥因子上調，如血管內皮生長因子（Vascular endothelial growth factor ，VEGF）[41]。HG 刺激細胞后，VEGF-A 和PIGF 與受體VEGFR1 結合導致p38 MAPK 及ERK 1/2 的激活和磷酸化，MAPK 反過來可以影響VEGF 水平，引起ERK 途徑下游的炎癥因子TNF-α 表達量上升。同時ERK 途徑可通過調節(jié)NF-κB 依賴性基因表達影響NF-κB 的活化。Lazzara 等[41]發(fā)現PIGF 抑制劑可緩解高糖引起的DR，表明PIGF 是治療糖尿病性視網膜病變的選擇性靶標。

2.5 高糖引起的氧化應激與PI3K/AKT 信號通路的關系

PI3K/AKT 通路在細胞中普遍存在，內皮細胞處于氧化應激狀態(tài)時引起的衰老等病癥都與PI3K/AKT 信號傳導途徑密切相關[81]。胰島素主要通過PI3K/AKT 信號通路介導的葡萄糖穩(wěn)態(tài)和脂質代謝等細胞關鍵生理過程調控血糖水平[82]。PI3K/AKT 信號通路被激活后，誘導P53 蛋白表達水平升高，進而參與細胞衰老和凋亡[83]。除了這些重要的細胞因子外，與AKT 相關的抗凋亡基因Bcl-xl，能促進AKT 磷酸化，進而保護內皮細胞[84]。Zhang 等[85]研究發(fā)現，高糖誘導細胞凋亡后，AKT 的磷酸化會被高糖抑制，從而抑制下游相關因子的功能，降低細胞抵御氧化應激的能力[39，86-87]。

2.6 高糖引起的氧化應激與線粒體相關信號通路的關系

線粒體是細胞產生能量的重要部位，同時也是ROS 產生的重要場所。ROS 的濃度處于正常范圍時，能調節(jié)細胞增殖、分化和激素合成。當機體處于高糖引起的氧化應激狀態(tài)時，過量的ROS 會加速蛋白質、脂質和DNA 等分子氧化，導致線粒體功能障礙。Fan 等[88]的研究發(fā)現，在足細胞中通過Sirt6 質粒轉染，激活了AMPK 通路，顯著改善高糖誘導的足細胞損傷和線粒體功能障礙。Raj等[89]研究表明，SERCA 途徑的細胞內鈣超負荷和線粒體完整性的改變是高糖引起氧化應激的主要原因。Abuarab 等[90]研究表明，高糖誘導的ROS 激活了TRPM2 通路，從而觸發(fā)溶酶體膜通透性改變和Zn2+介導的線粒體裂變。

2.7 高糖引起的新型氧化應激信號通路

目前對于高糖引起的氧化應激在各系統(tǒng)疾病中的研究均是圍繞上述幾條常見的細胞氧化應激信號通路展開的，近幾年一些新型的氧化應激信號通路也隨著研究的深入逐漸被研究者們發(fā)現，如Batchuluun[91]研究發(fā)現，高糖暴露導致PKCβ2易位和內源性PKC 磷酸化、p47 phox 易位和還原型輔酶Ⅱ（NADPH）氧化酶激活，并導致細胞內二酰甘油（DAG）水平和AMPK 磷酸化水平升高，效應物二甲雙胍和利拉蘆肽通過抑制PKC-NADPH氧化酶途徑改善高糖誘導的氧化應激。Ying[92]發(fā)現激素FGF21 可能通過CaMKK2/AMPKα 介導的氧化應激抑制和eNOS 激活，改善1 型和2 型糖尿病小鼠的主動脈擴張。激素FGF21 與受體FGFR結合可以增強CAMKK2 和AMPKα 活性，AMPKα可上調CAT、NRF-2 和HO-1 的表達，增強eNOS的活性，從而減輕高糖引起的氧化應激。Ren 等[93]發(fā)現，高糖可抑制SIRT1 和AMPKα 的活性，導致FoxO1 活性增強，引起氧化應激，二甲雙胍通過調節(jié)AMPK/SIRT1-FoxO1 途徑，改善大鼠系膜細胞的氧化應激，從而延緩DKD 的發(fā)展。Li 等[94]發(fā)現高糖處理使大鼠心肌細胞中磷酸化的轉錄激活因子3（p-STAT3）與轉錄激活因子3（STAT3）的比值變大，HIF-1α 蛋白表達水平上調，表明高糖誘導了STAT3/HIF-1α 途徑的激活。

3 高糖引起的氧化應激相關信號通路及其相互關系

近幾年隨著研究技術的發(fā)展，關于各系統(tǒng)疾病中高糖引起的氧化應激相關信號通路的研究，在廣度和深度上逐步提升，本文總結了近5年來相關通路的文獻報道，并比較各通路在機體不同系統(tǒng)中的研究比重（圖1）。

圖1 高糖引起的氧化應激相關信號通路近5年文章發(fā)表數Fig.1 The number of articles on high glucose-induced oxidative stress-related signaling pathways published in the recent five years

當人體空腹血糖大于或等于7.0 mmol/L 時，可診斷為糖尿病。餐后血糖升高為正常的血糖波動，非糖尿病患者在餐后一段時間內因胰島素的調節(jié)會恢復到正常血糖水平，而糖尿病患者調節(jié)機制受阻，致使血糖濃度持續(xù)偏高，影響著人體各個系統(tǒng)。高糖的作用機制錯綜復雜，介導的各信號通路之間既有各自特有的作用機制，又相互影響。高糖能直接作用于PIGF/ERK 通路，引起炎癥因子VEGF 上調并且與受體結合，導致ERK1/2 激活和下游炎癥因子TNF-α 表達量上升，從而引起炎癥；同時VEGF 上調也導致p38 MAPK 活化和磷酸化，與高糖引起的過量ROS 共同作用，促進p38 MAPK 磷酸化和入核，引起氧化應激；MAPK也能影響VEGF 水平，進一步導致TNF-α 表達量上升；而ERK1/2 能影響NF-κB 的活化，協(xié)同ROS 導致NF-κB 解離，NF-κB/p65 亞基入核。高糖刺激后Nrf2 從Keap1 上解離，ROS 導致的IKKα/β 被激活，IκB 磷酸化，同樣會促進Nrf2 從Keap1 上解離，解離后Nrf2 入核，在核中與ARE結合，打破細胞穩(wěn)態(tài)。高糖抑制AKT 的磷酸化，促進Nrf2 入核和HO-1 的活化，進而引起氧化應激（圖2）。

圖2 高糖引起的氧化應激相關信號通路之間的關系Fig.2 Relationship between oxidative stress-related signaling pathways caused by high glucose

4 小結

隨著研究不斷深入，高糖引起的氧化應激涉及的相關信號通路逐漸被發(fā)現，如STAT3/HIF-1α、CaMKK2/AMPKα 等。氧化應激狀態(tài)在不同系統(tǒng)中所涉及的調控通路不同，而各通路間又有交互作用，因此尋找到各系統(tǒng)對應的靶通路及靶位點，進而對氧化應激過程進行精準調控是抑制氧化應激的有效途徑。在眾多相關研究中，由于效應物、細胞類型以及驗證的信號通路具有多樣性，對這些研究進行綜合性報道意義重大。本文對目前的相關研究進行總結，歸納出高糖構建氧化應激模型中常用的細胞類型，統(tǒng)計出各通路的研究側重點并總結出各通路間的交互作用，為后續(xù)的深入研究和探究新效應物在抑制高糖引起的氧化應激中的作用機制提供理論參考。