Illumina MiSeq高通量測(cè)序技術(shù)研究原料乳冷藏過(guò)程中微生物群落演替規(guī)律

茍 萌，胡 婕，張彤彤，劇 檸

（寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院 銀川 750021）

原料乳豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及其偏中性的pH值，是微生物生長(zhǎng)的絕佳環(huán)境[1]。原料乳中的微生物可能來(lái)自牛棚、飼料、乳頭表面和頂端或乳制品設(shè)備的再污染[2]。這些微生物包括對(duì)乳及乳制品的感官與風(fēng)味有直接影響的乳球菌屬、乳酸桿菌屬和鏈球菌屬；對(duì)人體健康造成影響的李斯特菌屬、志賀氏菌屬和產(chǎn)生霉菌毒素的真菌等病原菌；以及對(duì)原料乳的腐敗造成影響的有害微生物，特別是假單胞桿菌屬及黃桿菌屬等嗜冷菌[3]。原料乳中的微生物群落結(jié)構(gòu)受地理環(huán)境、乳種類(lèi)、泌乳期及貯存條件的影響[3-7]。

原料乳擠出后因無(wú)法立刻投入生產(chǎn)鏈，故運(yùn)至工廠(chǎng)冷藏。全世界不同地區(qū)的生產(chǎn)商對(duì)原料乳加工前的儲(chǔ)藏時(shí)間（2～5 d）也不同[2]。冷藏雖能抑制大多數(shù)微生物的生長(zhǎng)，但嗜冷微生物如黃桿菌屬、假單胞桿菌屬仍持續(xù)生長(zhǎng)，它們產(chǎn)生的蛋白酶和脂肪酶作用于乳中蛋白質(zhì)和脂肪[8-10]，不僅導(dǎo)致原料乳的腐敗，而且在工業(yè)熱加工處理后仍保持活性，對(duì)加工后的乳及乳制品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、風(fēng)味及感官品質(zhì)產(chǎn)生影響，例如奶酪中產(chǎn)生苦味或UHT乳中產(chǎn)生凝膠與沉淀[4，5，11-12]。由于利用現(xiàn)有技術(shù)手段很難使這些微生物酶失活，因此降低它們?cè)谠先橹斜晃廴镜娘L(fēng)險(xiǎn)具有非常重要的意義。

近年來(lái)，有研究者針對(duì)某特定貯藏時(shí)間的原料乳中微生物的菌群多樣性進(jìn)行研究。然而，原料乳中的微生物隨著冷藏時(shí)間發(fā)生改變，嗜冷微生物分解乳成分的同時(shí)，乳環(huán)境也影響它的存在。了解生乳加工前其中微生物菌群隨冷藏時(shí)間的改變至關(guān)重要。

本研究利用高通量技術(shù)研究原料乳在4 ℃冷藏條件下微生物群落的演替規(guī)律，為原料乳冷藏期間品質(zhì)控制提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

原料乳，取自寧夏回族自治區(qū)銀川市某奶牛場(chǎng)乳罐。

1.2 主要儀器與試劑

DYY-6C 電泳儀，北京六一生物科技有限公司；C200 凝膠成像分析系統(tǒng)，北京百晶生物技術(shù)有限公司；核酸純度測(cè)定儀，德國(guó)TITERTEK BERTHOLD 公司。

食品DNA 提取試劑盒（DNeasyRPowerFood Microbial Kit），德國(guó)QIAGEN 公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集及處理 無(wú)菌采集新鮮牛乳。原料乳的體細(xì)胞數(shù)≤2.0×105細(xì)胞/mL，細(xì)菌總數(shù)<1.0×105CFU/mL。嚴(yán)格無(wú)菌采集乳罐原料乳樣品，裝入滅菌（121 ℃，15 min）的采樣瓶中，置放有冰袋的隔熱背包，2 h 內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。

將采集的樣品分裝后4 ℃保存。根據(jù)冷藏時(shí)間編號(hào)。0 h 開(kāi)始，乳罐中乳樣每24 h 取出1 次，直至細(xì)菌總數(shù)達(dá)到2×106CFU/mL。根據(jù)取出時(shí)間標(biāo)記為A1～A7。所有編號(hào)樣品取出后-20 ℃保存，以備細(xì)菌總DNA 的提取。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)樣品取3 個(gè)平行樣本。

1.3.2 DNA 提取檢測(cè) 對(duì)食品DNA 提取試劑盒提取DNA 的方法進(jìn)行改良。具體操作是：原料乳混勻后取10 mL，5 000×g、4 ℃離心10 min，去除上清液和脂肪。加入3 mL 無(wú)菌水，用渦旋混勻器混勻，5 000×g、4 ℃離心5 min，去除上清液和脂肪。加入2 mL PBS 緩沖液，混勻后吸取2 mL 菌液，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，在第（4）步（轉(zhuǎn)移重懸的細(xì)胞到PowerBead Tube 上）后，55 ℃水浴10 min，在第（19）步（在白色濾膜中加入100 μL EB 溶液，13 000×g 離心1 min）中加入80 μL EB 溶液。

將提取的DNA 用1.0%瓊脂糖凝膠電泳和核酸純度測(cè)定儀進(jìn)行濃度和純度檢測(cè)。所檢測(cè)DNA質(zhì)量濃度＞20 ng/L，OD260nm/OD280nm檢測(cè)范圍在1.8～2.0 之間的樣品為合格樣品。所有提取的DNA 樣品置-20 ℃冰箱凍存，送樣，備用。

1.3.3 PCR 擴(kuò)增及Illumina MiSeq 測(cè)序 選擇細(xì)菌的16S rRNA 基因的V4-V5 區(qū)作為目的擴(kuò)增段，將樣品統(tǒng)一稀釋到20.0 ng/L，使用引物515 F（GTGCCAGCMGCCGCGGTAA）和引物907 R（CCGTCAATTCMTTTRAGTTT）進(jìn)行擴(kuò)增[13]，添加Barcode 序列進(jìn)行引物區(qū)分。擴(kuò)增體系（25.0 L）：5×反應(yīng)緩沖液5.0 L，5×GC 緩沖液5.0 L，dNTP（2.5 mmol/L）2.0 L，正向引物（10 μmol/L）1.0 L，反向引物（10 μmol/L）1.0 L，DNA 模板2.0 L，dd H2O 8.7 L，Q5 高保真DNA 聚合酶0.3 L。擴(kuò)增程序：98 ℃預(yù)變性2 min，25 次循環(huán)（98 ℃變形15 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s），72 ℃延伸5 min。使用2.0 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物，采用AXYGEN 公司的凝膠回收試劑盒對(duì)目標(biāo)片段進(jìn)行切膠回收，將擴(kuò)增回收產(chǎn)物進(jìn)行熒光定量。制備測(cè)序文庫(kù)后，使用MiSeq 平臺(tái)測(cè)序儀進(jìn)行2×300 bp 雙端測(cè)序。PCR 擴(kuò)增、測(cè)序工作由上海派森諾公司完成。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理及分析

1.3.4.1 測(cè)序數(shù)據(jù)預(yù)處理及質(zhì)控 對(duì)于原始數(shù)據(jù)，利用Trimmomatic 軟件采用滑動(dòng)窗口法對(duì)FASTQ 格式的雙端序列逐一篩查過(guò)濾；根據(jù)重疊堿基，利用FLASH 軟件對(duì)通過(guò)質(zhì)量初篩的雙端序列配對(duì)連接，調(diào)整序列方向，最終獲得每個(gè)樣本的有效序列。

1.3.4.2 數(shù)據(jù)處理 對(duì)細(xì)菌的16S rRNA V4-V5區(qū)測(cè)序，利用軟件Uparse 7.0 進(jìn)行OTU 聚類(lèi)分析。按照97%相似性對(duì)非重復(fù)序列（不含單序列）進(jìn)行OTU 聚類(lèi)，在聚類(lèi)過(guò)程中去除嵌合體，得到OTU 的代表序列。對(duì)有效序列進(jìn)行去雜，并歸類(lèi)至OTU 代表序列，選出與代表序列相似性在97%以上的序列，生成OTU 表格。使用QIIME 軟件，參考Silva 數(shù)據(jù)庫(kù)，采用RDP classifier 貝葉斯算法對(duì)OTU 代表序列進(jìn)行分類(lèi)學(xué)分析，得到物種分類(lèi)信息。利用R 語(yǔ)言制作豐度等級(jí)曲線(xiàn)圖、稀釋曲線(xiàn)、Venn 圖、群落柱形圖。

通過(guò)SAS 8.1 軟件分析數(shù)據(jù)，使用最低顯著差異（LSD）方法以0.05 水平進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取DNA 的質(zhì)量

21 個(gè)樣本提取均采用試劑盒改良法，所提樣本DNA 濃度范圍在30.3～71.9 ng/L，OD260nm/OD280nm為1.7～2.3，均滿(mǎn)足后續(xù)試驗(yàn)要求。

2.2 OTU 基本情況

21 個(gè)原料乳樣本中共產(chǎn)生665 619 個(gè)原始reads，平均每個(gè)樣本22 011 個(gè)reads。通過(guò)對(duì)原序列的質(zhì)量控制，共獲得462 231 個(gè)平均長(zhǎng)度411 bp 的高質(zhì)量序列，用于后續(xù)分析。按97%的序列相似度進(jìn)行OTU 劃分，共聚成673 個(gè)OTU。豐度曲線(xiàn)反映樣品中所含物種豐富度和均勻程度，由圖1可知，樣本間重復(fù)效果較好。A1 的曲線(xiàn)平坦且下降緩慢，說(shuō)明原料乳的初始微生物物種組成較豐富且均勻，A2～A7 曲線(xiàn)跨度較小，下降陡峭，說(shuō)明OTU 之間豐度差異大，均勻度低，物種組成比較單一，且優(yōu)勢(shì)物種明顯。

圖1 相對(duì)豐度曲線(xiàn)Fig.1 The curve of relative abundance

2.3 Alpha 多樣性分析

稀釋曲線(xiàn)（Rarefaction curve）是利用各樣本在不同測(cè)序深度時(shí)的微生物Alpha 多樣性指數(shù)構(gòu)建，以此反映各樣本在不同測(cè)序數(shù)據(jù)量時(shí)的微生物多樣性，也可以用來(lái)說(shuō)明樣本的測(cè)序數(shù)據(jù)量是否合理[14]。由圖2可知，隨著序列數(shù)的增加，稀釋曲線(xiàn)趨于平緩，說(shuō)明試驗(yàn)的測(cè)序深度反映樣品中細(xì)菌的群落信息。

圖2 稀釋曲線(xiàn)Fig.2 Rarefaction curve

從Alpha 多樣性指數(shù)（表1）可知，每個(gè)樣品的覆蓋率（Coverage）都在99%以上，說(shuō)明測(cè)序深度基本覆蓋所有細(xì)菌，測(cè)序結(jié)果能夠反映每個(gè)樣品中微生物的真實(shí)情況。在4 ℃冷藏期內(nèi)，原料乳的Shannon 指數(shù)、Ace 指數(shù)和Chao 1 指數(shù)總體下降，與OTU 結(jié)果相似，說(shuō)明罐內(nèi)原料乳微生物種群多樣性隨冷藏時(shí)間的延長(zhǎng)而下降。

表1 Alpha 多樣性指數(shù)Table 1 Alpha diversity indices

2.4 原料乳樣品微生物群落組成及變化規(guī)律

2.4.1 Venn 圖分析 Venn 圖可用于統(tǒng)計(jì)多組或多個(gè)樣本中所共有和獨(dú)有的物種數(shù)目，可比較直觀(guān)地表現(xiàn)環(huán)境樣本的物種組成相似性及重疊情況[15]。選用相似水平為97%的OTU，統(tǒng)計(jì)各組樣本中共有和獨(dú)有OTU 數(shù)目。圖3可知，冷藏過(guò)程中各樣本共有OTU 數(shù)為29。冷藏初期原料乳中微生物特有OTU 個(gè)數(shù)最多，為157。冷藏過(guò)程中隨時(shí)間的變化乳中微生物OUT 數(shù)目也發(fā)生變化，特有OTU 數(shù)均小于10，表明在4 ℃下，隨著冷藏時(shí)間的延長(zhǎng)，原料乳中未有新細(xì)菌出現(xiàn)。

圖3 基于OTU 水平的Venn 圖Fig.3 Venn diagram based on OTU

2.4.2 菌群門(mén)水平多樣性及演替規(guī)律分析 利用ILLumina MiSeq 測(cè)序平臺(tái)研究原料乳的微生物及其4 ℃冷藏6 d 的菌群變化。整個(gè)冷藏過(guò)程中，在所有樣本中共檢出14 個(gè)菌門(mén)，261 個(gè)菌屬。在門(mén)水平上，原料乳中存在的主要細(xì)菌菌門(mén)有變形菌門(mén)（Proteobacteria）、厚壁菌門(mén)（Firmicutes）、擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）和放線(xiàn)菌門(mén)（Actinobacteria），其變化規(guī)律及相對(duì)豐度占比見(jiàn)圖4和表2。其中，放線(xiàn)菌門(mén)占比最高，相對(duì)豐度高于50%。這與張敏等[16]、Li 等[2]、Kim 等[3]、Weber 等[17]的研究結(jié)果一致，說(shuō)明原料乳中的微生物受奶牛品種、地理環(huán)境及冷藏時(shí)間的影響，變形菌門(mén)是原料乳中主要的細(xì)菌菌門(mén)。

表2 原料乳冷藏過(guò)程中門(mén)水平上的菌群組成及豐度Table 2 Species composition and abundance map at phylum level in raw milk

圖4 原料乳冷藏過(guò)程中門(mén)水平上的菌群分布Fig.4 The flora distribution in raw milk at phylum level

在檢出的細(xì)菌門(mén)中，變形菌門(mén)的占比在冷藏1 d 后顯著增加（P<0.05），之后持續(xù)降低，直至冷藏結(jié)束，相對(duì)豐度從起初的87.00%（A1）降至38.33%（A7），變化顯著（P<0.05）。冷藏2 d，厚壁菌門(mén)占比顯著減少（P<0.05），從起初的6.44%減至1.3%，隨后逐漸增加，冷藏6 d 后成為優(yōu)勢(shì)菌門(mén)，相對(duì)豐度達(dá)到53.72%（A7）。擬桿菌門(mén)在冷藏過(guò)程中相對(duì)豐度呈先增后降的趨勢(shì)。冷藏3 d 時(shí)，擬桿菌門(mén)從起初的3.33%增到30.60%（A3）；隨后逐漸降低為7.84%（A7）。此時(shí)，原料乳中最主要的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌由變形菌門(mén)轉(zhuǎn)變?yōu)楹癖诰T(mén)。值得注意的是，Li 等[2]的研究表明，原料乳在1～4 ℃冷藏24 h 后，其優(yōu)勢(shì)菌門(mén)由變形菌門(mén)轉(zhuǎn)變?yōu)楹癖诰T(mén)，72 h 后，變形菌門(mén)成為優(yōu)勢(shì)菌門(mén)。而本試驗(yàn)顯示：3 d 內(nèi)，原料乳中厚壁菌門(mén)占比雖有所上升，但變形菌門(mén)仍是主要優(yōu)勢(shì)菌門(mén)，直至冷藏6 d，優(yōu)勢(shì)菌門(mén)才轉(zhuǎn)變?yōu)楹癖诰T(mén)。出現(xiàn)這種差異的原因可能是由于Li等[2]用原料乳為水牛乳，其中營(yíng)養(yǎng)成分與本試驗(yàn)用的牛乳有很大不同，從而造成初始微生物狀態(tài)存在差異。此外，冷藏過(guò)程中微生物變化又受乳環(huán)境影響，導(dǎo)致最終微生物群落演替產(chǎn)生差異。

2.4.3 菌群屬水平多樣性及演替規(guī)律分析 在屬水平上，從原料乳中檢出的主要菌屬為不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）、乳球菌屬（Lactococcus）、黃桿菌屬（Flavobacterium）和假單胞菌屬（Pseudomonas），且各菌屬相對(duì)豐度隨冷藏時(shí)間發(fā)生變化（見(jiàn)圖5和表3）。此結(jié)果與于國(guó)萍等[18]、Neubeck等[19]的研究報(bào)道一致。此外，Kim 等[3]、Doyle 等[6]研究發(fā)現(xiàn)原料乳中存在彎曲桿菌屬及糞腸球菌屬，而在本試驗(yàn)中未檢出。

表3 樣本冷藏過(guò)程中屬水平上的菌群組成及豐度Table 3 Species composition and abundance map at genus level in raw milk

圖5 原料乳冷藏過(guò)程中屬水平上的菌群分布Fig.5 The flora distribution at genus level in raw milk during cold storage

冷藏5 d 內(nèi)，原料乳中的菌屬以不動(dòng)桿菌屬為主，占細(xì)菌總數(shù)的50%以上。最初，不動(dòng)桿菌屬占比81.69%（A1），然后顯著增至93.56%（A2，P<0.05），又逐漸降到55.30%（A4），第4 天時(shí)升至57.25%（A5），之后突然降至37.02%（A7），變化顯著（P<0.05）。乳球菌屬初期含量?jī)H為1.45%（A1），稍下降后從第2 天開(kāi)始逐步上升，至冷藏末期升至53.34%（A7）。黃桿菌屬的相對(duì)豐度從冷藏初期的1.15%增至第3 天的30.56%后下降，直至冷藏末期其豐度降為7.82%，期間變化顯著（P<0.05）。而假單胞菌屬的變化呈現(xiàn)先下降后上升再下降的趨勢(shì)。相對(duì)豐度最高時(shí)在第2 天，為6.40%（A3），冷藏末期僅占0.18%（A7，P<0.05）。可見(jiàn)，整個(gè)冷藏過(guò)程中，優(yōu)勢(shì)菌屬?gòu)牟粍?dòng)桿菌屬逐漸轉(zhuǎn)化為乳球菌屬。群落組成分析表明，冷藏過(guò)程中，原料乳微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯而復(fù)雜的變化。Li 等[2]報(bào)道，原料乳中初始優(yōu)勢(shì)菌屬為鏈球菌屬，72 h 后轉(zhuǎn)變?yōu)榧賳伟鷮?，同時(shí)不動(dòng)桿菌屬的相對(duì)豐度也有所升高。而本試驗(yàn)中，乳球菌屬、黃桿菌屬和假單胞菌屬3 種優(yōu)勢(shì)菌屬在3 d 內(nèi)的占比有所增加，而不動(dòng)桿菌屬始終是這個(gè)階段的優(yōu)勢(shì)菌屬。

先前的研究顯示原料乳是一個(gè)復(fù)雜的體系，其中微生物的多樣性取決于泌乳期、儲(chǔ)存時(shí)間、環(huán)境、溫度、季節(jié)以及初始微生物群落。一些特有菌屬的出現(xiàn)與這些因素密不可分。假單胞菌屬、黃桿菌屬及部分不動(dòng)桿菌屬所產(chǎn)生的蛋白酶和脂肪酶導(dǎo)致原料乳的腐敗。而導(dǎo)致其腐敗的關(guān)鍵菌屬不僅與嗜冷微生物（如假單胞菌屬）有關(guān)，也與這些特有菌屬有關(guān)。雖然各研究中均能檢測(cè)到一些常見(jiàn)嗜冷菌的存在與變化，但是不同原料乳的微生物組成與變化趨勢(shì)在多種因素的影響下并不完全一致。本試驗(yàn)僅研究特定原料乳冷藏過(guò)程中的微生物，而對(duì)牛乳體細(xì)胞數(shù)、原料乳初始微生物含量及原料乳營(yíng)養(yǎng)成分等因素與冷藏過(guò)程中微生物變化間的關(guān)系還有待更深入的研究。此外，本試驗(yàn)中還存在部分未知菌，它們占比雖不大，但與原料乳的品質(zhì)變化也可能相關(guān)。這些未知菌需采用其它方法確定名稱(chēng)。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)對(duì)4 ℃冷藏6 d 期間原料乳中的細(xì)菌群落變化進(jìn)行研究。通過(guò)高通量測(cè)序，對(duì)不同階段原料乳中存在的微生物進(jìn)行門(mén)水平和屬水平表征。原料乳冷藏初始階段其菌群多樣性最為豐富，隨冷藏時(shí)間的延長(zhǎng)群菌豐富度減少。同時(shí)優(yōu)勢(shì)菌屬——不動(dòng)桿菌屬、乳球菌屬、黃桿菌屬和假單胞菌屬隨時(shí)間的變化而改變。了解原料乳中微生物群落演替有助于揭示原料乳品質(zhì)變化的原因。本研究結(jié)果為原料乳的冷藏提供技術(shù)依據(jù)。