曾曉希 冉 松 譚 琴

徐 鴻 張遠科 陳啟明

馬 靚

湖南工業(yè)大學

生命科學與化學學院

湖南 株洲 412007

1 研究背景

隨著造紙技術(shù)與產(chǎn)業(yè)的不斷發(fā)展，造紙原料供應緊缺的問題在世界范圍內(nèi)日益嚴重[1]。為解決造紙原料缺乏和造紙工業(yè)產(chǎn)生的環(huán)境問題，需要盡快調(diào)整造紙原料結(jié)構(gòu)，加大對非木材纖維原料利用的研究[2]。目前，韌皮纖維類的非木材長纖維原料由于其纖維細長且柔韌、生長周期短、適應性好等優(yōu)點，具有良好的應用前景。但在制漿造紙工藝中，植物纖維原料含有大量多糖膠狀物質(zhì)，其纖維長且堅韌不易斷，使其在造紙和紡織方面的應用受到了限制。為了解決這一問題，需要對植物纖維原料進行脫膠預處理，即對原料進行膠質(zhì)去除，并使植物纖維的束纖維或者單纖維相互分離[3-4]。傳統(tǒng)的脫膠工藝設計采用燒堿蒸煮的化學法，但這種方法對環(huán)境污染嚴重、耗能高、處理后的纖維有不同程度的損傷，這些均與日益完善的現(xiàn)代工業(yè)發(fā)展要求不符[5-7]。隨著大量研究人員的不斷努力，生物預處理技術(shù)不斷完善，這些技術(shù)主要利用微生物代謝物中產(chǎn)生對應的酶來分解植物韌皮部纖維中的果膠、半纖維素等物質(zhì)，整個反應條件溫和、能耗低、符合綠色環(huán)保發(fā)展的要求且不會破壞纖維素結(jié)構(gòu)[8-12]。生物預處理方式一般主要包括生物酶法和生物菌法，兩者的關鍵都在于對微生物的篩選和特性研究[4,10,13]。目前針對此類目標微生物，一般有兩種方法，一是利用果膠作為營養(yǎng)物質(zhì)配制培養(yǎng)基；二是采用植物纖維如劍麻葉、苧麻粉、大麻莖等為原料直接篩選的方法，利用該方法可以篩選出以底物為營養(yǎng)物質(zhì)，并能分解果膠、半纖維素等成分代謝物的各類微生物。但在處理過程中，能分解纖維素的微生物會對麻類的纖維品質(zhì)造成一定的影響和破壞，所以通過這種方法篩選出的微生物是否可以應用還有待考究[9,14-15]。

已有研究表明微生物應用于生物預處理方法是可行的，如Bajpai.P等[16]利用Ceriporiopsis subvernispora對麥草進行預處理，然后再進行制漿，處理后的實驗組木素含量達到和對照組的相同時，可節(jié)約30 kg堿，且污水的化學需氧量（chemical oxygen demand，COD）負荷比也更低，成本大幅降低。脫膠菌B.Subtilis A2-5以及一種產(chǎn)生韌皮纖維脫膠酶的菌株B.Subtilis No.13，對植物纖維原料的脫膠有一定的效果，但它從斜面菌種到二級種子罐需要培養(yǎng)16～28 h，發(fā)酵至產(chǎn)酶需要12～18 h，且脫膠酶液還需要適當處理后才能對原麻脫膠，菌株培養(yǎng)周期長且脫膠時間較長的缺點難以解決，阻礙了它在脫膠領域的應用[17-18]。為此，本研究擬以麻類纖維為實驗材料，通過篩選一種高效的脫膠菌株，對原變種生苧麻進行脫膠，以期為植物纖維原料的預處理提供新方法和技術(shù)參考。

2 實驗

2.1 材料

2.1.1 菌種來源

將腐爛菜樣（包括青菜、番茄、白菜和胡蘿卜等多種腐爛蔬菜）加入無菌水振蕩，從振蕩后的溶液中篩選菌種。

2.1.2 試劑和樣品

磷酸氫二鉀（K2HPO4·3H2O）、氯化銨（NH4Cl）、測序試劑BigDye Terminator v3.1均為市售分析純；蛋白胨、牛肉膏為生物試劑；苧麻（Boehmeria nivea(L.) Gaudich）。

2.1.3 培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)基：將5 g生苧麻剪成1 cm左右的小段，加入適量水加熱，待水沸騰后，降成小火熬煮；當水中苧麻變軟，溶液逐漸由澄清變成棕黃色后，將苧麻撈出；在溶液中加入0.3 g牛肉膏、1 g蛋白胨、0.5 g NaCl，再將該溶液加水混勻定容到100 mL，在pH自然狀態(tài)，采用高壓蒸汽滅菌20 min。

初篩培養(yǎng)基：將8 g生苧麻按照富集培養(yǎng)基中的方法處理；將苧麻撈出，加入0.03 g K2HPO4、0.05 g NH4Cl、2 g瓊脂，將該溶液加水混勻定容到100 mL，在pH自然狀態(tài)，采用高壓蒸汽滅菌20 min。

純化培養(yǎng)基：將0.3 g牛肉膏、1 g蛋白胨、0.5 g NaCl、2 g瓊脂，加水混勻?qū)⑷芤憾ㄈ莸?00 mL，將pH調(diào)至7.0，采用高壓蒸汽滅菌20 min。

復篩培養(yǎng)基：加入0.03 g K2HPO4、0.05 g NH4Cl，將該溶液加水混勻定容到100 mL，然后加入10 g生苧麻，在pH自然狀態(tài)，采用高壓蒸汽滅菌20 min。

2.2 實驗方法

2.2.1 脫膠菌株的富集馴化

在裝有20 mL無菌水的200 mL三角瓶中加入1 g腐爛菜樣，同時加入適量無菌玻璃珠，在轉(zhuǎn)速150 r/min的搖床中搖動20 min，盡量使其混合均勻。移取振蕩后的溶液10 mL，在100 mL液體培養(yǎng)基中進行接種，然后在轉(zhuǎn)速170 r/min、溫度35 ℃的條件下培養(yǎng)48 h。

2.2.2 脫膠菌株的篩選

首先稀釋上述富集馴化后的混合物，在以苧麻汁為唯一營養(yǎng)物質(zhì)的培養(yǎng)基平板上進行涂布，在35 ℃的條件下培養(yǎng)48 h。若產(chǎn)生水溶圈，則在周圍挑取菌種，將其置于肉湯培養(yǎng)基平板上進行平板劃線，然后置于35 ℃條件下培養(yǎng)48 h，此操作重復3次以上，直至連續(xù)多次觀察到形態(tài)單一的菌體。將上述菌株接種于以苧麻為營養(yǎng)物質(zhì)的復篩培養(yǎng)基中，在35 ℃、轉(zhuǎn)速180 r/min條件下培養(yǎng)24 h，對復篩培養(yǎng)基中的苧麻進行脫膠率檢測，超過80%則認為脫膠能力顯著，然后從篩選出的菌株中挑取效率最好的一株作為最優(yōu)的目的菌株。

2.2.3 菌株的鑒定

1）形態(tài)特征觀察。利用菌株在不同的固體培養(yǎng)基的平皿上會有不同形態(tài)的特點，涂布菌株后在28℃的條件下培養(yǎng)48 h，然后對菌落的特點進行觀察。參考中華根瘤菌的篩選方法，取培養(yǎng)至對數(shù)生長期的細菌，對其分別進行革蘭氏染色、抗酸染色、莢膜染色、芽孢染色和鞭毛染色[19]。在掃描電子顯微鏡下察看各個細菌形態(tài)的大小和特點。

2）菌株的各項生理生化鑒定根據(jù)《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》的相應說明進行選擇[8]。

2.2.4 16S rDNA的序列分析

參考中華根瘤菌的篩選鑒定[19]，對目的菌株進行16S rDNA分子鑒定。首先，提取目的菌株的基因組，取生長至對數(shù)期的菌液，離心后加入RNase和溶菌酶，混和均勻后置于水浴中；在上述樣品中加入蛋白酶K和十二烷基硫酸鈉（C12H25SO4Na，sodium dodecyl sulfate，SDS），混合均勻；再在混合液中加入十六烷基三甲基溴化銨（C16H33(CH3)3NBr，Hexadecyl trimethyl ammonium bromide，CTAB）和 NaCl，水浴操作后加入等體積的氯仿/異戊醇，混合均勻后進行離心，棄除沉淀，將上清液移入干凈離心管中并加入與上清液等體積的酚/氯仿/異戊醇，再進行離心，棄除沉淀，取上清液；然后加入異丙醇，混合均勻直至DNA沉淀下來，短時間靜置后離心，棄上清液，留沉淀；然后用體積分數(shù)為70%乙醇將沉淀洗數(shù)次，放置片刻使乙醇揮發(fā)后加入40 μL ddH2O溶解DNA。最后進行瓊脂糖凝膠電泳實驗，觀察分析電泳結(jié)果。然后對目的菌株進行16S rDNA的擴增，使用16S rDNA 的通用引物 63f:5′-CAGGCCTAACACATGCAAGTC-3′和1387r:5′- GGGCGGAGTGTACAAGGC-3′作為引物。配置50 μL的PCR（polymerase chain reaction）反應體系，設置PCR的反應條件參考中華根瘤菌NL的鑒定[19]。獲得的PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳實驗，剩余PCR產(chǎn)物回收后委托上海生物工程有限公司測序，獲得菌株的16S rDNA序列后上傳至GenBank數(shù)據(jù)庫，與全部序列進行對照以確定其菌屬，并使用系統(tǒng)發(fā)育樹軟件MEGA-X構(gòu)建發(fā)育樹。

2.2.5 菌株的脫膠率檢測

活化菌種備用，將300 mL自來水和30 g經(jīng)過預處理的生苧麻在錐形瓶中混合，然后取15 mL菌液接種，在35 ℃、轉(zhuǎn)速170 r/min條件下培養(yǎng)8 h，然后檢測脫膠率。對照組為不接種目標菌株，但需要完成同樣的處理步驟。脫膠率（Gr）公式為

Gr=1-G1/G0，

式中G0為對照組的含膠率，

G1為實驗組的含膠率[13]。

2.2.6 菌株的發(fā)酵條件優(yōu)化

影響RJ6菌株發(fā)酵生長水平較為顯著的因素有培養(yǎng)溫度、pH值，轉(zhuǎn)速和接種量[20]。對上述因素分別進行單因素實驗，以菌體數(shù)量水平為考察指標，探究其對發(fā)酵培養(yǎng)基中菌株生長水平的影響。

3 結(jié)果與分析

3.1 脫膠菌株的篩選

用經(jīng)過純化后的單一菌株進行脫膠實驗，將純化后的菌種接種到復篩培養(yǎng)基中，然后通過檢測培養(yǎng)基中苧麻的含膠率計算每一種菌株的脫膠率。對脫膠率達80%以上的菌株進行篩選，然后將其中效果最優(yōu)的，即脫膠率達到91%的菌株命名為RJ6。后續(xù)實驗對象選擇RJ6。

3.2 RJ6菌株的形態(tài)特征觀察

固體培養(yǎng)基的平皿培養(yǎng)特征如圖1所示。固體培養(yǎng)基平皿培養(yǎng)的菌株生長較快，菌落呈乳白色的圓狀，邊緣圓潤，輕微隆起，質(zhì)地不透明但其表面呈光滑狀且有光澤，培養(yǎng)36 h后菌落直徑達3～5 mm。

圖1 菌株RJ6的形態(tài)特征照片F(xiàn)ig.1 Morphological characteristics photograph of strain RJ6

RJ6在電子顯微鏡下的個體形態(tài)如圖2所示。

圖2 菌株RJ6的SEM照片F(xiàn)ig.2 SEM photograph of strain RJ6

從圖2的EMS圖像可以看出，菌株RJ6整體呈短桿狀，兩頭鈍圓，大小為（0.4～0.5）μm ×（1.1～1.8）μm，革蘭氏染色結(jié)果為陰性，存在鞭毛結(jié)構(gòu)，沒有芽孢，不產(chǎn)生色素。

3.3 RJ6菌株的生理生化鑒定

脫膠菌株RJ6的生理生化鑒定結(jié)果如表1所示。

表1 RJ6菌株的生理生化鑒定Table 1 Physiological and biochemical identification of RJ6 strain

從表1的鑒定結(jié)果可以得到：V-P測定結(jié)果為陽性，甲基紅實驗結(jié)果為陰性，說明該菌株可以分解葡萄糖生成丙酮酸；淀粉水解、果膠水解實驗結(jié)果為陽性，纖維素分解實驗為陰性，證明該菌株可以不分解纖維素但分解果膠；葡萄糖利用、乳酸利用、蔗糖利用和麥芽糖利用實驗結(jié)果都為陽性，說明上述物質(zhì)皆可以作為唯一碳源使其生長繁殖；在其他生理以及生化指標檢測中，該菌株能接觸酶，丙二酸利用和檸檬酸鹽利用實驗結(jié)果為陽性，可分解明膠液化，無脲酶活性，不產(chǎn)生熒光色素。

3.4 RJ6 的 16S rDNA 分析

將RJ6的16S rDNA序列上傳至GenBank數(shù)據(jù)庫中進行序列對比，登錄號為DQ124677。在GenBank數(shù)據(jù)庫中選擇同源性高的序列，經(jīng)由序列同源性分析，結(jié)果表明RJ6與GenBank中的歐文氏菌屬（Erwinia.sp）的同源性最高，大于99%。歐文氏菌屬中分出4個屬，其中與RJ6關系密切的是果膠桿菌屬（Pectobacterium.sp）。利用系統(tǒng)發(fā)育樹軟件MEGA-X構(gòu)建發(fā)育樹，如圖3所示。圖3所示的菌株RJ6生長發(fā)育樹也證明了上述結(jié)論。再將菌株形態(tài)結(jié)果、生理生化鑒定結(jié)果、序列比對結(jié)果和發(fā)育樹構(gòu)建結(jié)果綜合得出RJ6屬于果膠桿菌屬（Pectobacterium.sp）。

圖3 菌株RJ6的生長發(fā)育樹Fig.3 Growth and development tree of strain RJ6

3.5 菌株的脫膠率測定

根據(jù)國家標準GB 5889—1986中公布的苧麻含膠率測定方法，測定對照組的含膠率（G0）和實驗組的含膠率（G1）。然后計算實驗初篩得到的菌株的脫膠率，其中脫膠率最高的菌株為RJ6，其結(jié)果為G0=21.67%，G1=1.95%，脫膠率為91.0%。

將RJ6與湖南師范大學、山東大學和陳其國等篩選出的B.Subtilis A2-5、B.Subtilis No.13和M1脫膠菌株的培養(yǎng)時間、開始產(chǎn)酶時間和脫膠效果進行對比[17-18,21]，結(jié)果如表2所示。

表2 RJ6與已發(fā)表菌株的脫膠性能對比Table 2 Comparison of degumming performance between RJ6 and published strains

從表2的對比結(jié)果可以看出，B.Subtilis A2-5、B.Subtilis No.13菌株的脫膠率高，但培養(yǎng)周期和開始產(chǎn)酶時間長且脫膠酶液還需要進行處理，而M1脫膠菌株培養(yǎng)周期長，脫膠率低。本研究篩選出的目標菌株RJ6在接種到苧麻上后進行恒溫振蕩8 h，菌株進入對數(shù)生長期，開始大量產(chǎn)生脫膠酶，測定其脫膠率可高達91%以上，相比于其他菌株生長周期短，脫膠酶產(chǎn)生的時間快，脫膠率高，整體的脫膠性能良好，且處理后的纖維分散度高，不傷纖維，對生物脫膠領域有著積極的促進作用。

3.6 菌株的發(fā)酵條件優(yōu)化

通過測定在不同條件下的菌體數(shù)量水平，對菌株的發(fā)酵條件進行優(yōu)化。脫膠菌株RJ6的發(fā)酵條件優(yōu)化結(jié)果如圖4所示，實驗分別對不同轉(zhuǎn)速、接種量、溫度和起始pH下的細菌生長水平進行了測定。

圖4 RJ6的條件優(yōu)化結(jié)果Fig.4 Condition optimization results of RJ6

由圖4可知，轉(zhuǎn)速在100～160 r/min的范圍內(nèi)菌體數(shù)量隨著轉(zhuǎn)速的增大而增大，且在160 r/min達到最大值，超過160 r/min后緩慢下降。接種量對菌體數(shù)量的影響表現(xiàn)在隨著接種量的增大緩慢增大，但在5%～15%接種量的范圍內(nèi)相差不大，均維持在一個較高水平，其中5%接種量為最佳。溫度對菌種數(shù)量的影響顯著，總體趨勢是隨著溫度的增大先增加再減小，35～37 ℃為適宜溫度，37 ℃為最佳溫度。起始pH的影響需要保持在中性效果最佳，偏酸和偏堿都會影響菌株的生長水平，起始pH 7.0為最佳。綜上所述，RJ6菌株在轉(zhuǎn)速為160 r/min、接種量5%、溫度37 ℃和起始pH 7.0的條件下保持一個最佳的發(fā)酵水平。

4 結(jié)論

本研究從腐爛菜堆中篩選得到一株對苧麻具有高效脫膠作用且不損傷苧麻纖維素成分的菌株RJ6。該菌是革蘭氏陰性桿菌，有鞭毛結(jié)構(gòu)，沒有內(nèi)生芽孢，通過對該菌株進行形態(tài)觀察、生理生化鑒定和16S rDNA鑒定，可將該菌鑒定為果膠桿菌（Pectobacterium.sp），菌落呈乳白色圓狀，表面光滑且有光澤，細菌個體形態(tài)呈短桿狀，兩頭鈍圓，大小為（0.4～0.5）μm×（1.1～1.8）μm。通過對 RJ6菌株發(fā)酵水平條件進行優(yōu)化，在轉(zhuǎn)速160 r/min、接種量5%、溫度37 ℃和起始pH 7.0的條件下RJ6菌株保持一個高水平的發(fā)酵。將菌株RJ6在接種到苧麻上后在優(yōu)化的條件下培養(yǎng)8 h，可達90%以上的脫膠率。本研究所篩的脫膠菌株RJ6具有生長培養(yǎng)周期短，產(chǎn)生脫膠酶的時間快，脫膠率高的優(yōu)點，將該脫膠菌應用于苧麻的脫膠處理上，以使苧麻在造紙行業(yè)及紡織工業(yè)中發(fā)揮更大的作用。