包淋斌，龔劍明，姚利平

（1.廣昌縣畜牧獸醫(yī)局，江西撫州 344900；2.濂溪區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村局）

?？谔阋呤怯煽谔阋卟《緦僖鸬囊环N烈性的傳染病，主要特征為口、蹄部出現(xiàn)水皰，該病發(fā)病快、傳染性強(qiáng)、死亡率高，對(duì)肉牛養(yǎng)殖危害非常大，嚴(yán)重影響肉牛養(yǎng)殖場(chǎng)戶的生產(chǎn)效益[1～3]?？谔阋卟《緸闊o囊膜的RNA病毒，變異頻率很高，致使流行毒和疫苗毒種間存在抗原差異，當(dāng)差異到一定程度，會(huì)降低疫苗的免疫效果[4～5]。?？谔阋逧LISA試驗(yàn)法是口蹄疫免疫抗體檢測(cè)中最為常用、最廣泛、最便捷的一種，具有簡便、快速、靈敏、載體易于標(biāo)準(zhǔn)化等特點(diǎn)，是當(dāng)前基層動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)口蹄疫最常用的方法。該方法是利用抗原和抗體相結(jié)原理，將抗體吸附在固相載體表面，通過酶標(biāo)儀吸光強(qiáng)弱，來鑒定的血清中O型口蹄疫抗體水平，判斷肉牛群體的免疫效果[6～7]。本文旨在通過競(jìng)爭ELISA法對(duì)牛O型口蹄疫抗體進(jìn)行試驗(yàn)監(jiān)測(cè),為掌握廣昌縣范圍內(nèi)肉牛養(yǎng)殖場(chǎng)O型口蹄疫免疫效果情況，為科學(xué)防控O型口蹄疫提供參考依據(jù)。

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試劑盒?？谝卟】贵w檢測(cè)試劑盒由深圳真瑞生物科技有限公司提供（含對(duì)照組：陰性對(duì)照組為沒有抗體試驗(yàn)用試劑液，陽性對(duì)照為有抗體試驗(yàn)用試劑液）。

1.1.2 血清。用采血管采集全縣6個(gè)已注射O型口蹄疫疫苗的肉牛養(yǎng)殖場(chǎng)牛血樣共60份，用2 000r/min離心5min，倒出上清血清，裝于1.5mLPE試管中，放于冰箱冷凍，保存?zhèn)溆?，血清清亮，無溶血。

1.1.3 洗滌液的準(zhǔn)備。濃縮洗滌液使用前應(yīng)恢復(fù)至室溫，如有鹽結(jié)晶，搖動(dòng)使結(jié)晶的巖溶解，然后用蒸餾水或去離子水作10倍稀釋。稀釋好的洗滌液可在4℃存放一周左右。

1.1.4 試驗(yàn)器材。1mL、100uL移液槍及槍頭,普通離心機(jī)、微型振蕩器、燒杯、酶標(biāo)儀等試驗(yàn)用器材，并做好滅菌消毒工作。

1.2 試驗(yàn)方法

試驗(yàn)設(shè)計(jì)6個(gè)試驗(yàn)組和陰陽對(duì)照組，每個(gè)組設(shè)置10個(gè)重復(fù)。

2 試驗(yàn)步驟

將待檢板條按20uL/孔加入樣本稀釋液和對(duì)照組；每孔加酶標(biāo)記物60uL，輕微震蕩混勻，蓋上封板膜，置37℃溫育45min；小心揭開封板膜，甩掉板孔中的溶液，使用工作濃度洗滌液每孔加250uL，后甩去孔內(nèi)液體，以上步驟重復(fù)4～6次，最后在干凈吸水紙上拍干；每孔加顯色液100uL，混勻，蓋上封板膜37℃閉光顯色15min；再次小心揭開封板膜，每孔加終止液50uL，使反應(yīng)終止，10min內(nèi)在調(diào)試好酶標(biāo)儀上（酶標(biāo)儀使用450nm，并630nm作參比波長）測(cè)定吸光度OD值。

3 計(jì)算方法及結(jié)果判定

3.1 計(jì)算方法

PI（阻斷率）=（1-（樣品OD值/陰性O(shè)D均值））×100%（陰性O(shè)D均值為取10個(gè)重復(fù)樣平均值）

3.2 試驗(yàn)成立條件

陰性對(duì)照（N）OD值＞0.5，同時(shí)陽性對(duì)照（P）阻斷率＞45%。

3.3 陰陽性判：

PI（阻斷率）＞45%則判斷為陽性；PI（阻斷率）≤45%則判斷為陰性。液相阻斷ELISA檢測(cè)抗體效價(jià)與本試劑盒檢測(cè)PI值得對(duì)應(yīng)關(guān)系詳見表1。

表1 液相阻斷ELISA檢測(cè)抗體效價(jià)與本試劑盒檢測(cè)PI值得對(duì)應(yīng)關(guān)系

4 試驗(yàn)注意事項(xiàng)

試劑盒使用前各試劑應(yīng)平衡至室溫，應(yīng)將試劑盒各組份放置室溫至少1h以上；使用前應(yīng)搖勻，使用后放回2℃～8℃；不同品種、不同批號(hào)試劑盒的試劑組份不得混用，使用試劑時(shí)應(yīng)防止試劑污染。

顯色液和終止液對(duì)皮膚和眼可能有刺激性，使用時(shí)應(yīng)注意防護(hù)；TMB（顯色液）不要暴露于強(qiáng)光和避免接觸氧化劑；檢測(cè)板拆封后應(yīng)避免受潮或沾水（未用完的抗原被板加干燥劑放于自封袋中，并盡快置于2℃～8℃）。

所有廢棄物在丟棄之前應(yīng)合理處理以免污染；嚴(yán)格遵守操作說明可以獲得最好的結(jié)果。操作過程中移液、定時(shí)和洗滌等的全部過程必須精確；抗原包被板為一次性用品，不得重復(fù)使用。

5 試驗(yàn)結(jié)果

試驗(yàn)結(jié)果見表2，經(jīng)檢測(cè)陰性對(duì)照OD均值＞0.5，陽性對(duì)照PI（阻斷率）＞45%，符合試驗(yàn)要求，試驗(yàn)成立；6個(gè)肉牛養(yǎng)殖場(chǎng)血清樣全部檢測(cè)為陽性；PI（阻斷率）都高于90%以上，說明牛型O口蹄疫抗體水平很高，免疫效果良好。

表2 試驗(yàn)檢測(cè)6個(gè)肉牛養(yǎng)殖場(chǎng)結(jié)果

6 討論

接種疫苗是預(yù)防口蹄疫的唯一有效方法。免疫接種口蹄疫疫苗目的是保護(hù)易感牛，提高免疫水平，降低口蹄疫感染流行風(fēng)險(xiǎn)，降低養(yǎng)殖成本，提高養(yǎng)殖效益[8]?？谔阋咭呙缃臃N應(yīng)根據(jù)當(dāng)?shù)匾咔檫x擇疫苗種類、劑量與次數(shù)，一般口蹄疫疫苗接種應(yīng)保證每年2～3次[9]。牛血采樣時(shí)間過早或過晚都可影響檢測(cè)結(jié)果。初步試驗(yàn)表明，6個(gè)肉牛養(yǎng)殖場(chǎng)牛O型口蹄疫免疫效果良好。但目前檢測(cè)樣本量太少，為全面掌握全縣的疫情情況，還需要擴(kuò)大檢測(cè)范圍和加大樣本數(shù)量。