董璇 何珊 魏雨晴 張杰輝 陳夢璇 張斌

摘 要：本研究以肉桂精油、殼聚糖與葡萄籽提取物作為原料，基于響應面分析法得到湖羊肉復配保鮮劑最佳配方。在單因素實驗基礎上，以4℃條件下貯藏8d的湖羊肉感官評分和菌落總數(shù)構(gòu)建綜合評價模型，并通過Box-Behnken實驗設計優(yōu)化復配保鮮劑最佳配方。響應面優(yōu)化結(jié)果表明，肉桂精油體積濃度為0.12%、殼聚糖質(zhì)量濃度為12.42mg/mL、葡萄籽提取物質(zhì)量濃度為2.26mg/mL時湖羊肉綜合評價指標最好，其理論值為8.675，優(yōu)于其他實驗組。為驗證結(jié)果的可靠性，4℃條件下貯藏上述復配保鮮劑涂抹處理后的湖羊肉8d，結(jié)果表明，驗證值與理論值間的匹配度達98.61%，這表明Box-Behnken實驗對湖羊肉復合保鮮劑的配方進行優(yōu)化是可行的。

關鍵詞：湖羊肉;保鮮;響應面;肉桂精油;殼聚糖;葡萄籽提取物

中圖分類號：S872 ?文獻標識碼：A ?文章編號：1673-260X（2021）06-0038-07

湖羊是中國江浙兩省以及太湖流域等環(huán)境濕熱地區(qū)特有的綿羊品種，其體態(tài)豐滿，羊毛濃密，以風味鮮美、肉質(zhì)細嫩膻味輕、蛋白質(zhì)含量高、脂肪含量適中、凈肉率高而具有廣泛的受眾群體[1]。湖羊屠宰后按照加工方式的不同，可分為冷鮮肉、熱鮮肉和冷凍肉三類。其中，冷鮮湖羊肉在風味、營養(yǎng)價值、衛(wèi)生安全等方面更勝一籌。

當前文獻報道較多是通過添加食品保鮮劑和調(diào)節(jié)宰后胴體冷卻溫度的方法來延長冷鮮肉保鮮期，但因使用的規(guī)范性、地域的差異性以及能耗的成本等方面使得上述方法在實際應用中還存在一些問題[2]。生物保鮮劑是從動植物、微生物中提取或利用現(xiàn)代生物工程技術得到的保鮮劑，其安全、健康、高效等特點已成為食品保鮮領域研究的熱點[3]。據(jù)報道，殼聚糖[4，5]、溶菌酶[6]、天然香辛料提取物[7]、茶多酚[8]、乳酸鏈球菌素等[9]常用于肉類保鮮。

肉桂精油是一種安全的天然植物精油[10]。肉桂既是可食用香料又是一類天然的食品添加劑，在全球范圍內(nèi)被廣泛應用。從肉桂中提取的肉桂精油已經(jīng)得出具有很強的抗氧化和抗菌活性[11，12]。殼聚糖是一種含有游離的氨基和羥基的天然高分子聚合物，具有較好的成膜性能和抑菌效果。歐陽銳等[13]研究了生物可降解殼聚糖復合膜在雞胸肉保鮮中的應用，結(jié)果表明在3℃下，該復合膜保藏后的雞胸肉的揮發(fā)性鹽基氮值最低、pH值最小和感官評分最高，在第7天仍屬于次鮮肉，且相比空白組貨架期延長了2d。葡萄籽中含有大量的活性物質(zhì)，例如酚類化合物[14，15]、脂肪酸[16]、維生素以及植物甾醇[17]等，具有抗氧化、細胞周期調(diào)控[18，19]，消炎[20]、抑菌等[21]活性。葡萄籽提取物作為一種天然的生物保鮮劑，目前在食品保鮮中應用較少。

研究表明，相比于單一保鮮劑，復合天然保鮮劑對冷卻羊肉在貯藏期間各項指標的提升更為顯著[22]，如夏靜華[23]、施荷[24]、王正云[25]等發(fā)現(xiàn)復配保鮮劑處理后的冷鮮肉品質(zhì)優(yōu)于單一保鮮劑處理。目前鮮有文獻報道關于香辛料、殼聚糖、葡萄籽提取物等天然保鮮劑協(xié)同應用于冷鮮湖羊肉的研究。因此，本研究選取肉桂精油、殼聚糖、葡萄籽提取物3種天然保鮮劑，并基于Box-Behnken實驗設計優(yōu)化復配保鮮配方，旨在為天然復配保鮮劑的實際應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料和儀器

1.1.1 實驗材料

湖羊肉，由安徽恩遠冷鏈物流管理有限公司生產(chǎn);殼聚糖（含量99%，脫乙酰度≥90%），葡萄籽提取物（含量≥98%），由浙江一諾生物科技有限公司生產(chǎn);肉桂精油，來自蚌埠農(nóng)貿(mào)市場。以上材料均為食品級。銅綠假單胞菌瓊脂培養(yǎng)基，瓊脂培養(yǎng)基，馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基，由瑞楚生物科技（江蘇）有限公司生產(chǎn)。

供試菌：銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、大腸桿菌（ Escherichia coli）、酵母菌 （Saccharomyce），枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）均為本實驗所用菌種，培養(yǎng)條件如表1所示。

1.1.2 實驗儀器

AB323電子天平，由上海?？惦娮觾x器廠生產(chǎn);YX-24HDD手提式壓力蒸汽滅菌器，由江陰濱江醫(yī)療設備有限公司生產(chǎn);SW-CJ-2FD超凈工作臺，由上海力辰儀器科技有限公司生產(chǎn);HN-60BS電熱恒溫培養(yǎng)箱，由邦西儀器科技（上海）有限公司生產(chǎn);BCD-220WD11NY冰箱，由海信容聲（廣東）冰箱有限公司生產(chǎn)。

1.2 實驗方法

1.2.1 不同濃度下單一保鮮劑的抑菌效果

不同濃度保鮮劑的配制：配1.0mg/mL、5.0mg/mL、10.0mg/mL、15.0mg/mL、20.0mg/mL的殼聚糖溶液;0.5mg/mL、1.0mg/mL、2.0mg/mL、4.0mg/mL、8.0 mg/mL的葡萄籽提取物溶液;0.01%、0.1%、1%、2%、5%的肉桂精油溶液備用。

不同濃度下單一保鮮劑的抑菌效果：固體培養(yǎng)基活化菌種后，挑取單一菌落至相應的液體培養(yǎng)基中，直至菌數(shù)到106-107cfu/mL時停止培養(yǎng)，采用打孔法測不同濃度的單一保鮮劑對不同菌液的抑制效果。

最小抑菌濃度（minimal inhibitory concentra-tion，MIC）的測定：通過瓊脂打孔法測定肉桂精油、殼聚糖和葡萄籽提取物的抑菌圈，抑菌圈直徑≥7mm所對應的保鮮劑的濃度即為最小抑菌濃度[26]。

湖羊肉的處理方法：將樣品切成1cm×1cm×1cm小塊，涂抹保鮮劑后裝入無菌自封袋中，并在4℃條件下貯藏8d，對其感官評分和菌落總數(shù)進行測定。

菌落總數(shù)測定方法是按照國標方法GB4789—2016測定，實驗重復3次。感官檢驗參考Sombonpanyakul[27]和徐紅艷[28]等的方法。選擇已掌握感官評價基礎理論并且無感官缺陷的10名同學（5男5女），對在4℃條件下貯藏8d的湖羊肉色澤、氣味、彈性和組織狀態(tài)給出評分。

1.2.2 響應面優(yōu)化

在所選取的3種保鮮劑抑菌實驗的基礎上，以菌落總數(shù)和感官評價權(quán)重后的綜合得分為考察指標，以肉桂精油（A，%）、殼聚糖（B，mg/mL）、葡萄籽提取物（C，mg/mL）為自變量，設計三因素三水平響應面實驗，編碼因素及水平見表3所示。

以綜合評價指標為響應值[29]（依據(jù)參考文獻和實際情況按照綜合評價指標為：30%菌落總數(shù)加70%感官評價），用Design Expert 8.0.6軟件進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計處理，得出最佳工藝參數(shù)。

1.2.3 保鮮效果評價

為區(qū)分不同處理組的保鮮效果，將保鮮效果評價定義為：U={lg菌落總數(shù)（u1），感官評價（u2）}，結(jié)合第8d實驗結(jié)果，確定10分制的菌落總數(shù)和感官評價指標值得分標準[29]。

1.2.4 權(quán)重向量

微生物的生長是造成湖羊肉腐敗的主要因素，但在實際購買過程中，消費者則是通過感官判斷肉品是否新鮮，本文結(jié)合實際情況，設定權(quán)重集K= {0.3，0.7}，綜合得分P=UK=0.3u1+0.7u2[29]。

1.2.5 結(jié)果驗證

數(shù)據(jù)分析采用EXCEL軟件，結(jié)果以“平均數(shù)±標準差”的方式表示，圖形繪制使用Origin8.6軟件。在4℃條件下對Box-Behnken實驗設計優(yōu)化得到的復配保鮮劑最佳配方做三個平行樣貯藏8d的菌落總數(shù)和感官評分驗證。

2 結(jié)果與分析

2.1 單一保鮮劑的抑菌效果

2.1.1 不同體積濃度的肉桂精油對四種微生物抑菌效果

如圖1所示，隨著肉桂精油占比的升高，各菌株抑菌圈直徑變化較大，說明在一定范圍內(nèi)肉桂精油對這四株菌有抑制作用。其中，以銅綠假單胞菌抑菌圈直徑變化最為明顯，說明肉桂精油對銅綠假單胞菌的抑菌效果最好。當肉桂精油濃度為0.1%時，各菌株抑菌圈直徑均大于7mm。

2.1.2 不同濃度的殼聚糖對四種微生物抑菌效果

如圖2所示，隨著殼聚糖濃度升高，各菌株抑菌圈直徑均發(fā)生變化，說明殼聚糖對各菌株均有較好的抑制作用，但濃度不同，抑制效果最佳的菌株也不同。當殼聚糖濃度在10mg/ml時，各菌株抑菌圈直徑均大于7mm。

2.1.3 不同濃度葡萄籽提取物對四種微生物抑菌效果

如圖3所示，隨著葡萄籽提取物濃度的升高，除銅綠假單胞菌的抑菌圈不變外，枯草芽孢桿菌、大腸桿菌和酵母菌的抑菌圈直徑均在增加，可見葡萄籽提取物對銅綠假單胞菌以外的3種菌落均有抑制效果。當葡萄籽提取物濃度為2.0mg/mL時，枯草芽孢桿菌、大腸桿菌和酵母菌的抑菌圈直徑均大于7mm。

2.2 響應面優(yōu)化結(jié)果

2.2.1 二次響應面回歸模型的建立與分析

基于單因素抑菌實驗的結(jié)果，以菌落總數(shù)和感官評價權(quán)重后的綜合得分為考察指標，以肉桂精油（A，%）、殼聚糖（B，mg/mL）、葡萄籽提取物（C，mg/mL）為自變量，通過響應面實驗設計優(yōu)化得到復配保鮮劑最佳配方，結(jié)果見表5。

基于Design Expert 8.0.6軟件對實驗結(jié)果進行回歸擬合及方差分析，綜合得分（P）對肉桂精油（A）、殼聚糖（B）和葡萄籽提取物（C）的回歸模型如下。

P=+8.53+0.45A+0.20B-0.065C-0.10AB+0.093AC+0.30BC-0.46A2-0.24B2-0.24C2

方差分析結(jié)果由表可知，回歸模型極顯著，失擬項不顯著，說明該模型與實驗擬合較好。模型的R2Adj=0.9237，R2=0.9666，可以較好地說明肉桂精油、殼聚糖和葡萄籽提取物對綜合得分的影響;由系數(shù)檢驗可知，一次項A和B、二次項A2、B2、C2以及交互項BC均極顯著，肉桂精油、殼聚糖和葡萄籽提取物對湖羊肉的綜合得分影響順序為：肉桂精油（A）>殼聚糖（B）>葡萄籽提取物（C）。

2.2.2 兩因素交互作用分析

根據(jù)回歸方程作3D曲面圖，考察其形狀與顏色變化，分析肉桂精油、殼聚糖、葡萄籽提取物對于響應值的影響。

由圖4-a可知，肉桂精油A和殼聚糖B兩因子交互作用不顯著。當肉桂精油的添加濃度在0.05%-0.1%范圍內(nèi)時，殼聚糖濃度在5-10mg/mL范圍內(nèi)，綜合評價指標得分逐漸增大，直到肉桂精油的添加量為0.1%、殼聚糖的添加量為10mg/mL時，綜合評價指標得分達到最高。繼續(xù)加大肉桂精油和殼聚糖的濃度，則會使得綜合評價指標得分降低。

由圖4-b可知，肉桂精油A和葡萄籽提取物C兩因子交互作用不顯著。當肉桂精油的添加濃度在0.05%-0.1%范圍內(nèi)，葡萄籽提取物濃度在1-2mg/mL范圍內(nèi)，綜合評價指標得分逐漸增大，直到肉桂精油的添加量為0.1%，葡萄籽提取物的濃度為2mg/mL時，綜合評價指標得分達到最高。繼續(xù)加大肉桂精油和葡萄籽提取物的濃度，則會使得綜合評價指標得分降低。

由圖4-c可知，殼聚糖B和葡萄籽提取物C兩因子交互作用極顯著。當殼聚糖的添加濃度在5-10mg/mL范圍內(nèi)，葡萄籽提取物濃度在1-2mg/mL范圍內(nèi)，綜合評價指標得分逐漸增大，直到殼聚糖的添加量為10mg/mL，葡萄籽提取物的濃度為2mg/mL時，綜合評價指標得分達到最高。繼續(xù)加大殼聚糖和葡萄籽提取物的濃度，則會使得綜合評價指標得分降低。

2.2.3 最佳配方的確定和驗證

在單因素實驗基礎上，通過Box-Behnken實驗設計優(yōu)化得到復配保鮮劑的最佳配方為：肉桂精油0.12%、殼聚糖12.42mg/mL、葡萄籽提取物2.26mg/mL，綜合得分理論值為8.675，為檢驗響應曲面法優(yōu)化結(jié)果的可靠性，在4℃條件下對Box-Behnken實驗設計優(yōu)化得到的復配保鮮劑最佳配方做三個平行樣貯藏8d的菌落總數(shù)和感官評分的綜合得分驗證，得到其實際值為8.554。這說明該模型對湖羊肉復合保鮮劑的配方進行優(yōu)化是可行的，得到的工藝參數(shù)具有實際應用價值。

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