田蕭羽，楊 爍，朱 彪，趙立升，李 琳，廖思達,4，溫 寧

1解放軍醫(yī)學(xué)院，北京 100853；2 解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心 口腔科，北京 100853；3 首都醫(yī)科大學(xué)附屬復(fù)興醫(yī)院 口腔科，北京 100038；4 解放軍總醫(yī)院 骨科研究所，北京 100853

牙周炎是一種與炎癥相關(guān)的牙周支持組織受累的口腔疾病，也是造成成人缺牙的首要原因[1]?，F(xiàn)有的治療手段(如使用植骨材料和引導(dǎo)組織再生術(shù)等)引導(dǎo)牙周再生的能力有限[2]。因此，如何有效實現(xiàn)牙周再生已經(jīng)成為當前牙周炎治療的重要挑戰(zhàn)。外泌體(exosome，Exo)是活細胞分泌的一種胞外囊泡。研究表明，外泌體具有與其來源細胞相似的生物學(xué)作用，可作為干細胞替代物用于組織再生[3]。牙周膜干細胞因擴增能力較弱、原代提取困難等因素限制了其作為外泌體來源細胞的應(yīng)用。臍帶間充質(zhì)干細胞(umbilical cord mesenchymal stem cells，UCMSCs)增殖能力強，是一種理想的組織工程種子細胞，被廣泛用于多種組織的再生修復(fù)當中。在牙周再生方面，研究表明UCMSCs能夠促進炎癥狀態(tài)下牙周軟硬組織的再生[4]。而作為干細胞旁分泌主要成分，UCMSCs 來源外泌體促進牙周再生的相關(guān)研究仍缺乏。牙周膜干細胞(periodontal ligament stem cells，PDLSCs)是促進牙周再生的關(guān)鍵細胞。研究表明，在炎癥微環(huán)境中PDLSCs 的生物活性受到抑制，是阻礙牙周再生的重要原因[5-7]。因此，本研究擬從hUCMSCs 來源外泌體在炎癥微環(huán)境中對PDLSCs的調(diào)控出發(fā)，探討其對PDLSCs 增殖和遷移能力的影響。

材料和方法

1主要材料、試劑與儀器 α-MEM 培養(yǎng)基(Gibco，美國)；PBS(Hyclone，美國)；胰酶(Sigma，美國)、Ⅰ型膠原酶(Sigma，美國)；胎牛血清(Gibco，美國)；成骨誘導(dǎo)液(賽業(yè)，中國)、成脂誘導(dǎo)液(賽業(yè)，中國)；Dil(碧云天，中國)；DAPI 染色液(碧云天，中國)；4%多聚甲醛(索萊寶、中國)；茜素紅染液(賽業(yè)，中國)；油紅O 染液(Sigma，美國)；Transwell 細胞小室(NEST，中國)；CCK-8 試劑盒(碧云天，中國)；蛋白裂解液(碧云天，中國)；BCA 蛋白定量試劑盒(Thermo Fisher，美國)；鼠抗人CD9 抗體(Abcam，美國)；鼠抗人CD63 抗體(Abcam，美國)；鼠抗人CD81抗體(Abcam，美國)；TNF-α(賽業(yè)，中國)；流式細胞儀(BD FACSCalibur 公司，美國)；透射電鏡(HITACHI，日本)；超速離心機(Beckman，美國)。

2人臍帶間充質(zhì)干細胞來源外泌體的提取和鑒定 hUCMSCs 來源于本課題前期提取并鑒定過的細胞[8]。培養(yǎng)P3～ P8 代hUCMSCs，當細胞融合率達到70%～80%時，除去培養(yǎng)基，加入去外泌體血清的α-MEM 培養(yǎng)基，連續(xù)培養(yǎng)48 h 后，收集上清液。上清液通過300 g 離心10 min 去除死細胞，繼續(xù)通過2 000 g 離心10 min，10 000 g 離心30 min 去除細胞碎片。離心后的上清用0.22 μm 濾膜過濾，通過超速離心機使用100 000 g 離心2 h，除去上清后獲得hUCMSCs 來源外泌體，PBS 沖洗后重懸，通過BCA 蛋白定量試劑盒進行蛋白定量，-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。檢測時用PBS 稀釋外泌體后取10 μL 于銅網(wǎng)上靜置5 min，之后進行磷鎢酸負染染色10 min，待干燥后通過透射電子顯微鏡進行觀察。用BCA 蛋白定量試劑盒對外泌體進行蛋白定量，對hUCMSCs 來源外泌體用Western-blot 檢測鑒定其表面標記蛋白CD81、CD63、CD9。

3人牙周膜干細胞的提取和鑒定 選取解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心口腔科患者因正畸拔除的健康前磨牙。無菌條件下用PBS 反復(fù)沖洗牙根表面，刮取根中1/3 的牙周膜組織，剪碎后用Ⅰ型膠原酶消化40～60 min，離心，去除上清，加入含10%胎牛血清的α-MEM 培養(yǎng)基重懸后接種于25T 培養(yǎng)瓶中，3～6 d 后有細胞爬出。胰酶消化細胞，接種于96 孔板中，隔天換液。7 d 后將具有克隆形成的細胞挑選出，標記為原代細胞并接種于培養(yǎng)瓶中，待細胞融合至80% 時，按照1∶2 比例傳代。取狀態(tài)良好的P3 代hPDLSCs 按照1 × 105/孔接種于6 孔板中，待細胞融合至60%～70%時去除原培養(yǎng)基更換為成骨誘導(dǎo)液或成脂誘導(dǎo)液，隔天換液，誘導(dǎo)21 d 后去除誘導(dǎo)液，PBS 沖洗2 次，4%多聚甲醛固定30 min 后分別進行茜素紅染色和油紅O 染色，染色5 min 后用PBS 洗去多余染色液于鏡下觀察拍照。取狀態(tài)良好的P3 代細胞用流式細胞儀檢測細胞的表面標志物CD90、CD73、CD29、CD105。

4hPDLSCs 對hUCMSCs 來源外泌體的攝取 收集Dil 標記后的hUCMSCs 上清，根據(jù)本文外泌體提取部分描述的方法提取外泌體，獲得外泌體即為Dil 標記的外泌體。將hPDLSCs 以1 × 105/皿的密度接種于激光共聚焦培養(yǎng)皿，培養(yǎng)24 h 后加入25 μg/mL Dil 標記的外泌體，繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后去除原培養(yǎng)基，PBS 沖洗后4% 多聚甲醛固定，DAPI 染色15 min，PBS 沖洗后于激光共聚焦顯微鏡下觀察拍照。

5CCK-8 檢測外泌體對hPDLSCs 增殖的影響實驗分組設(shè)置為對照組(hPDLSCs 培養(yǎng)于α-MEM培養(yǎng)基中)、炎癥組[hPDLSCs 培養(yǎng)于添加10 ng/mL腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)的α-MEM 培養(yǎng)基中]、炎癥+不同濃度外泌體(25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL)組。先前研究表明10 ng/mL TNF-α 可以在體外實驗中較好地模擬炎癥微環(huán)境[9]，本研究采用10 ng/mL TNF-α 構(gòu)建炎癥微環(huán)境，將hPDLSCs 以2×103/孔的密度接種于96 孔板中，每組設(shè)計3 個復(fù)孔連續(xù)培養(yǎng)，分別在0 d、1 d、3 d、5 d、7 d 按照CCK-8 試劑盒說明書加入CCK-8 液，孵育1 h 后于波長450 nm處檢測分光光度值。

6細胞劃痕實驗檢測外泌體對hPDLSCs 橫向遷移的影響 實驗分組設(shè)置為對照組、炎癥組、炎癥+不同濃度外泌體(25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL)組。將hPDLSCs 以1 × 105/孔接種于6 孔板中，待細胞融合至80%時去除原培養(yǎng)基更換為無血清培養(yǎng)基，用1 mL 槍頭于孔板底劃一道均勻橫線，分別于0 h、24 h 后在顯微鏡下觀察并測量劃痕寬度，計算各組細胞遷移率。

7Transwell 實驗檢測外泌體對hPDLSCs 縱向遷移的影響 實驗分組設(shè)置為對照組、炎癥組、炎癥+不同濃度外泌體(25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL)組。將hPDLSCs 以1×105/孔接種于6 孔Transwell板上室，按照分組在下室加入無血清培養(yǎng)基、TNF-α 及不同濃度外泌體(25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL)。24 h 后DAPI 染液染色，使用棉簽擦除上室中未遷移的細胞，于熒光顯微鏡下觀察細胞穿過情況，計算細胞透過率。

8統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS19.0 軟件進行分析，數(shù)據(jù)以表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD 檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1hUCMSCs 來源外泌體的提取及鑒定 磷鎢酸溶液負染后于透射電子顯微鏡(TEM)下觀察外泌體形態(tài)，可見外泌體呈直徑約100 nm 的圓形或橢圓形結(jié)構(gòu)，包膜完整(圖1A)；Western-blot 檢測到外泌體表面蛋白CD81、CD63、CD9 表達陽性(圖1B)。以上結(jié)果表明成功獲取外泌體。

圖1 hUCMSCs 來源外泌體的鑒定 A：透射電子顯微鏡下結(jié)果；B：Western-blot 檢測外泌體相關(guān)蛋白CD9、CD63、CD81Fig.1 Identification of exosomes derived from hUCMSCs A:TEM results;B:Results of exosome surface proteins CD9,CD63 and CD81 were detected by Western-blot

2hPDLSCs 的分離及鑒定 于顯微鏡下觀察提取的hPDLSCs，可見細胞貼壁呈螺旋狀生長，形狀呈長條狀或紡錘狀，生長迅速(圖2A/B)。流式細胞儀結(jié)果顯示(圖2C)：陽性表達間充質(zhì)干細胞表面標志物CD90(99.10%)、CD73(97.96%)、CD29(98.8%)、CD105(97.64%)，陰性表達造血干細胞表面標志物CD31(2.84%)、CD34(1.74%)。以上結(jié)果表明hPDLSCs 分離培養(yǎng)成功。

圖2 hPDLSCs 的培養(yǎng)與鑒定 A：P0 代培養(yǎng)的hPDLSCs 形態(tài)觀察；B：P3 代培養(yǎng)的hPDLSCs 形態(tài)觀察 C:hPDLSCs 表面標志物鑒定Fig.2 Identification of hPDLSCs A:Morphological observation of hPDLSCs cultured in P0 generation;B:Morphological observation of hPDLSCs cultured in P3 generation;C:Identification of surface markers of hPDLSCs

3hPDLSCs 對hUCMSCs 來源外泌體的攝取 將外泌體與hPDLSCs 共培養(yǎng)24 h 后，激光共聚焦顯微鏡觀察可見，藍色標記的hPDLSCs 細胞核附近出現(xiàn)紅色熒光，表明外泌體與hPDLSCs 共培養(yǎng)后被hPDLSCs 成功攝取，且分布在細胞核周圍(圖3)。

圖3 hPDLSCs 細胞對hUCMSCs 來源外泌體的攝取觀察 (藍色為hPDLSCs 細胞核，紅色為外泌體)Fig.3 Observation on the uptake of exosomes derived from hUCMSCs by hPDLSCs (hPDLSCs nuclei are shown in blue and exosomes are shown in red)

4hUCMSCs 來源外泌體在炎癥微環(huán)境中對hPDLSCs 增殖的影響 通過CCK-8 實驗檢測在炎癥微環(huán)境中不同濃度外泌體對hPDLSCs 增殖的影響。結(jié)果顯示，在0～1 d 各組之間的細胞增殖情況無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。在3～7 d，TNF-α 的加入促進了細胞的增殖，TNF-α 組與對照組相比細胞增殖明顯(P＜0.05)。在3 d，與TNF-α 組相比，TNF-α+25 μg/mL 外泌體組和TNF-α+50 μg/mL 外泌體組均無明顯促增殖作用(P＞0.05)，但TNF-α +100 μg/mL 顯著促進細胞增殖(P＜0.05)。在5～7 d，與TNF-α 組相比，TNF-α+外泌體組均具有明顯的促增殖作用且呈濃度依賴性(P＜0.05)，其中TNF-α+100 μg/mL 外泌體組促增殖作用最佳(圖4)。

圖4 hUCMSCs 來源外泌體在炎癥微環(huán)境中對hPDLSCs 增殖的影響 (aP＜0.05，vs control；bP＜0.05，vs TNF-α；cP＜0.05，vs TNF-α +25 μg/mL Exo；dP＜0.05，vs TNF-α+50 μg/mL Exo)Fig.4 Effects of exosomes derived from hUCMSCs on hPDLSCs proliferation in the inflammatory microenvironment (aP＜0.05,vs control;bP＜0.05,vs TNF-α;cP＜0.05,vs TNF-α+25 μg/mL Exo;dP＜0.05,vs TNF-α+50 μg/mL Exo)

5hUCMSCs 來源外泌體在炎癥微環(huán)境中對hPDLSCs 橫向遷移的影響 劃痕實驗顯示，在加入TNF-α 及不同濃度外泌體24 h 后，細胞發(fā)生了不同程度的橫向遷移。其中TNF-α 組與對照組相比，遷移程度無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)，表明加入TNF-α 未明顯促進細胞的橫向遷移。在TNF-α 培養(yǎng)條件下，TNF-α+外泌體組與TNF-α 組遷移程度差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，且外泌體濃度越高，細胞遷移程度越明顯(P＜0.05)，證明在炎癥微環(huán)境下hUCMSCs 來源外泌體以濃度依賴的方式促進了hPDLSCs 的橫向遷移。見圖5。

圖5 hUCMSCs 來源外泌體對hPDLSCs 橫向遷移的影響 A:劃痕實驗鏡下觀察 B:劃痕實驗定量結(jié)果(aP＜0.05,vs control group;bP＜0.05,vs TNF-α group;cP＜0.05,vs TNF-α+25 μg/mL Exo group;dP＜0.05,vs TNF-α+50 μg/mL Exo group)Fig.5 Effect of exosomes from hUCMSCs on lateral migration of hPDLSCs A:Observation under the microscope of the scratch test;B:Quantitative results of the scratch test (aP＜0.05,vs control group;bP＜0.05,vs TNF-α group;cP＜0.05,vs TNF-α+25 μg/mL Exo group;dP＜0.05,vs TNF-α+50 μg/mL Exo group)

6hUCMSCs 來源外泌體在炎癥微環(huán)境中對hPDLSCs 縱向遷移的影響 Transwell 實驗結(jié)果顯示，熒光顯微鏡下可見對照組發(fā)生縱向遷移細胞量最少，加入TNF-α 后，縱向遷移細胞數(shù)目增加(P＜0.05)。與25 μg/mL 和50 μg/mL 外泌體組相比，100 μg/mL 外泌體組促遷移作用最為明顯(P＜0.05)。Transwell 實驗表明hUCMSCs 來源外泌體促進了炎癥微環(huán)境下hPDLSCs 的縱向遷移。見圖6。

圖6 hUCMSCs 來源外泌體對hPDLSCs 縱向遷移的影響 A:Transwell 實驗鏡下觀察；B:Transwell 實驗定量結(jié)果(aP＜0.05,vs control group;bP＜0.05,vs TNF-α group;cP＜0.05,vs TNF-α+25 μg/ mL Exo group;dP＜0.05,vs TNF-α+50 μg/ mL Exo group)Fig.6 Influence of exosome from hUCMSCs on longitudinal migration of hPDLSCs A:Observation under the microscope of Transwell test;B:Quantitative results of Transwell test (aP＜0.05,vs control group;bP＜0.05,vs TNF-α group;cP＜0.05,vs TNF-α+25 μg/ mL Exo group;dP＜0.05,vs TNF-α+50 μg/ mL Exo group)

討論

間充質(zhì)干細胞來源外泌體是間充質(zhì)干細胞發(fā)揮生物學(xué)功能的重要途徑，與間充質(zhì)干細胞相比，外泌體無倫理學(xué)限制，無免疫排斥反應(yīng)，無突變致瘤風(fēng)險，在使用過程中不易阻塞血管且易于保存[10]，因此，近年來外泌體作為干細胞的替代物，越來越多應(yīng)用于再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域[11]。

hUCMSCs 因具有取材無創(chuàng)、便于體外分離培養(yǎng)等優(yōu)勢，成為外泌體的理想來源。多項研究已表明，hUCMSCs 來源外泌體在治療腦卒中[11]、皮膚損傷[12]、腦損傷等疾病時均展現(xiàn)出了廣闊的應(yīng)用前景。這為hUCMSCs 來源外泌體應(yīng)用于牙周再生提供了潛在的可能。目前已經(jīng)有不少研究探究外泌體對hPDLSCs 的影響，但關(guān)注于炎癥微環(huán)境中外泌體對hPDLSCs 影響的研究還很缺乏，炎癥微環(huán)境中外泌體對hPDLSCs 是否有促增殖促遷移作用尚不明確。

本研究通過超速離心法成功提取hUCMSCs外泌體，透射電鏡下觀察外泌體為直徑約100 nm的橢圓形，陽性表達特異性表面標志物CD9、CD63、CD81，提取結(jié)果與Hu 等[13]和Zhao 等[14]的結(jié)果相似。通過酶解法提取hPDLSCs，細胞呈長梭形，陽性表達間充質(zhì)干細胞表面標志物CD90、CD73、CD29、CD105，陰性表達造血干細胞表面標志物CD31、CD34，符合hPDLSCs 特征[15]。

本研究發(fā)現(xiàn)在炎癥微環(huán)境中hUCMSCs 來源外泌體可以為hPDLSCs 所攝取，在24 h 后可以在hPDLSCs 細胞核周圍檢測到大量紅色熒光，這與Li 等[16]研究顯示的共培養(yǎng)24 h 后熒光信號強烈一致，為后續(xù)實驗奠定了基礎(chǔ)。

本研究外泌體濃度為25 μg/mL、50 μg/mL 和100 μg/mL。在現(xiàn)有研究中，外泌體的濃度不盡相同。Wang 等[17]研究發(fā)現(xiàn)人脫落乳牙來源外泌體促 進hPDLSCs 增殖的起效濃度為25 μg/mL；Zhao 等[18]的研究顯示，人羊膜干細胞來源的外泌體(濃度為25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL)可以促進成纖維細胞的增殖與遷移且呈濃度依賴方式。CCK-8 實驗的觀察時間為3 d～7 d，與細胞種類、接種密度、實驗設(shè)計等多因素相關(guān)。本研究中觀察時間設(shè)定為7 d，有助于闡明在較長時間范圍內(nèi)外泌體對hPDLSCs 增殖的影響，與現(xiàn)有相關(guān)研究時間設(shè)定一致[19]。本研究CCK-8 結(jié)果表明在炎癥微環(huán)境中0～ 1 d 外泌體促增殖效果不明顯，共培養(yǎng)3 d 后外泌體可以顯著促進hPDLSCs 的增殖，且呈劑量依賴性。外泌體的促增殖作用已經(jīng)在很多研究中得到證實[20]。本研究在此基礎(chǔ)上證明在炎癥微環(huán)境中外泌體仍具有顯著的促增殖作用，但其機制尚不明確。Lv 等[21]通過體外實驗提示這種促增殖作用可能通過促進DNA 合成及加速細胞周期來實現(xiàn)的，但相關(guān)機制還需進一步研究。

本研究證實hUCMSCs 來源外泌體在炎癥微環(huán)境中可以促進hPDLSCs 遷移，包括橫向遷移和縱向遷移，其促遷移作用隨外泌體濃度升高而增強?，F(xiàn)已有多項研究表明外泌體可以促進成纖維細胞、血管內(nèi)皮細胞等多種細胞的遷移活動[22-23]，但在炎癥微環(huán)境下外泌體是否具有相同作用還缺乏相關(guān)研究。本研究證明在炎癥微環(huán)境下外泌體同樣具有促遷移作用。

綜上，本研究證明了hUCMSCs 來源外泌體在體外炎癥微環(huán)境中可以促進hPDLSCs 增殖和遷移，但對相關(guān)機制缺乏深入了解，在體內(nèi)實驗中hUCMSCs 來源外泌體能否促進hPDLSCs 的增殖和遷移進而促進牙周再生還需要后續(xù)研究。