運 行，魏 鈺，魏 民

解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心 骨科，北京 100853

骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA) 作為常見的退行性疾病，以軟骨退變?yōu)樘卣鞅憩F(xiàn)[1]。當(dāng)關(guān)節(jié)軟骨中的唯一細(xì)胞群——軟骨細(xì)胞受損時，其分泌的細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM) 代謝 紊亂，導(dǎo)致關(guān)節(jié)內(nèi)穩(wěn)態(tài)失衡，最終發(fā)展為OA。線粒體自噬可清除去極化或受損的線粒體，保護(hù)細(xì)胞，是維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的主要機(jī)制[2]。當(dāng)線粒體自噬受損時，損傷線粒體堆積在胞質(zhì)內(nèi)，促進(jìn)胞內(nèi)炎性反應(yīng)，進(jìn)一步導(dǎo)致軟骨細(xì)胞死亡，ECM 降解，造成OA。瘦素是由脂肪、軟骨等組織產(chǎn)生、ob基因表達(dá)的肽類激素[3]。既往研究表明，瘦素主要通過促進(jìn)軟骨細(xì)胞的分解代謝起到推動OA 發(fā)展的作用。但瘦素是否通過干預(yù)軟骨細(xì)胞線粒體自噬過程促進(jìn)細(xì)胞分解代謝目前未見報道。因此，本研究使用瘦素干預(yù)OA 軟骨細(xì)胞，分別從mRNA及蛋白水平檢測自噬相關(guān)因子的表達(dá)變化規(guī)律，從而探索瘦素在線粒體自噬調(diào)節(jié)中的作用及其與軟骨細(xì)胞退變的關(guān)系。

材料和方法

1標(biāo)本來源 軟骨組織標(biāo)本均來源于解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心骨科因重度OA 行全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)患者的廢棄軟骨組織。納入標(biāo)準(zhǔn)：1)符合骨關(guān)節(jié)炎臨床表現(xiàn)、影像學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)；2)否認(rèn)其他疾患。排除標(biāo)準(zhǔn)：1)既往關(guān)節(jié)感染病史；2)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎病史；3)術(shù)前傳染病篩查乙肝、梅毒等陽性。取材位置分別位于脛骨平臺內(nèi)外側(cè)，共14 例，其中男性4 例，女性10 例，年齡(60.6±4.26)歲。原發(fā)性O(shè)A 的診斷標(biāo)準(zhǔn)參照美國風(fēng)濕病學(xué)會膝OA 診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]。本研究獲得解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，并征得患者術(shù)前知情同意。

2主要試劑和抗體 α-MEM 培養(yǎng)基、Ⅱ型膠原酶、HBSS 緩沖液、胎牛血清(Gibco)、GAPDH 單克隆抗體、Parkin 單克隆抗體、LC3A 單克隆抗體、LC3B 單克隆抗體、MMP-13 單克隆抗體(Abcam)、PBS 緩沖液(Corning)；重組人瘦素(菲恩生物科技公司)；總RNA 提取試劑盒、通用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(翊圣生物公司)；Realtime PCR 熒光定量試劑盒、膜封閉液、SDS-PAGE 試劑盒(索萊寶公司)等。

3OA 原代軟骨細(xì)胞的分離培養(yǎng)與干預(yù) 于全膝置換術(shù)中取下廢棄的人脛骨平臺軟骨，無菌低溫保存。在超凈工作臺內(nèi)，采用無菌眼科剪將軟骨片剪碎成1 mm3的小軟骨塊，加入8 倍體積的0.2%Ⅱ型膠原酶、2 倍體積的HSBB 液(含Ca2+)，37℃消化2 h，離心5 min，棄上清。底部沉淀使用含20% FBS 軟骨細(xì)胞培養(yǎng)基混勻，接種至75 mL 培養(yǎng)瓶中，置于37℃恒溫、5% CO2體積分?jǐn)?shù)及飽和濕度的孵箱中培養(yǎng)10 d，定期更換培養(yǎng)液。取生長狀態(tài)良好的OA 原代細(xì)胞懸液以5×105/mL 的細(xì)胞密度接種于大號培養(yǎng)皿中，37℃、5% CO2孵育箱培養(yǎng)，每2 d 換液1 次，待細(xì)胞鋪滿70% 皿底后，更換為無血清的α-MEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，使細(xì)胞周期相對同步化。將軟骨細(xì)胞隨機(jī)分為瘦素低濃度組(10 ng/mL)、瘦素高濃度組(100 ng/mL)以及空白對照組，瘦素原液稀釋為工作液后采用移液槍分別加入細(xì)胞培養(yǎng)基中，輕晃搖勻。

4Parkin、LC3A、LC3B 和MMP13 基因表達(dá)檢測 6 孔板培養(yǎng)軟骨細(xì)胞，待細(xì)胞融合率達(dá)30%～40%時，采用Total RNA Extraction Kit 試劑盒提取細(xì)胞RNA，核酸蛋白分析儀檢測RNA 含量與純度，1%瓊脂糖凝膠電泳確定RNA 片段的完整性。采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA。按照PCR 試劑盒說明書進(jìn)行Parkin、LC3 和MMP13 mRNA 的檢測。采 用ACTB(β-Actin) 為內(nèi)參基因。利用2-ΔΔCT法分析相應(yīng)基因表達(dá)，實驗重復(fù)3 次，取均值。

5Parkin、LC3A、LC3B 和MMP13 蛋白表達(dá)檢測 于瘦素干預(yù)24 h 后，檢測線粒體自噬蛋白表達(dá)量。步驟如下：將培養(yǎng)液吸出，4℃預(yù)冷PBS 漂洗兩遍，加入200 μL RIPA 蛋白抽提試劑(50 mmol/L Tris-HCl(pH 7.4)，150 mmol/L NaCl，1% NP-40，0.1% SDS)和蛋白酶抑制劑Protease inhibitor cocktail(Roche)，冰上孵育20 min 后，離心機(jī)1 200 r/min(4℃)離心20 min，取上清。95℃變性5 min。每組蛋白上樣量為15 μg/孔，15% SDS-PAGE 電泳分離。之后采用恒定電流將目的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，轉(zhuǎn)膜時間約90 min。將PVDF 膜完全浸沒于5% BSA-TBST 中，水平搖床輕搖1 h。1%BSA/5% milk 稀釋一抗，4℃水平搖床孵育過夜。次日，使用TBST 洗膜3 次，每次5 min 30 s。Milk Blocking Buffer 稀釋二抗，山羊抗兔，山羊抗鼠IgG(H+L) HRP 1∶5 000，室溫孵育50 min。TBST洗膜4 次，每次5 min。ECL 滴加到膜的蛋白面，反應(yīng)3 min 30 s；膠片曝光10 s～5 min(曝光時間隨不同光強(qiáng)度而調(diào)整)，顯影2 min，定影。應(yīng)用Image J 軟件掃描測定灰度值。

6JC-1 染色測定OA 軟骨細(xì)胞線粒體膜電位 JC-1是一種廣泛使用的小分子線粒體膜電位探針，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位處于高水平狀態(tài)時，JC-1 探針大多聚集在線粒體的基質(zhì)中以聚合物形式存在，此時主要產(chǎn)生紅色熒光；當(dāng)線粒體膜電位下降偏低時，JC-1 主要為單體狀態(tài)而產(chǎn)生綠色熒光，紅/綠熒光強(qiáng)度比值降低。在共聚焦小皿中接種OA 細(xì)胞后，在37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。取適量JC-1 DMSO 儲存液轉(zhuǎn)移至微型管中后，加入適量的培養(yǎng)基立即吹打10 次混勻后配置成工作液加入培養(yǎng)皿中。在37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30～60 min。除去上清液，用HBSS 洗滌細(xì)胞2 次。加入Imaging Buffer Solution 后在共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞線粒體紅綠熒光強(qiáng)弱變化，應(yīng)用Image J 軟件定量分析紅綠熒光比例。

7統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，所有數(shù)據(jù)以表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，多重比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1Parkin、LC3A、LC3B 和MMP13 基因表達(dá)結(jié)果 瘦素干預(yù)OA 軟骨細(xì)胞后24 h，實驗組軟骨細(xì)胞內(nèi)自噬相關(guān)基因Parkin、LC3A 及LC3B 表達(dá)量低于對照組，其中Parkin 與LC3A 基因表達(dá)量較對照組呈下降趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義；LC3B表達(dá)明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)；MMP13表達(dá)高于空白對照組(P＜0.01)(圖1)。

圖1 不同濃度瘦素組干預(yù)人OA 軟骨細(xì)胞24 h 后不同基因表達(dá)量(aP＜0.01，vs control group)Fig.1 Expression of genes in human OA chondrocytes treated with different concentrations of leptin for 24 hours (aP＜0.01,vs control group)

2Parkin、LC3A、LC3B 和MMP13 蛋白表達(dá)結(jié)果 瘦素干預(yù)正常軟骨細(xì)胞24 h 后，低濃度組與高濃度組軟骨細(xì)胞內(nèi)自噬相關(guān)蛋白Parkin 和LC3B表達(dá)量低于空白對照組(P＜0.05)；LC3A 表達(dá)量低于空白對照組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義；隨著瘦素濃度的增加，兩個濃度組MMP13 表達(dá)量均逐漸增加，兩組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(圖2，圖3)。

圖2 不同濃度瘦素組干預(yù)24 h 后OA 軟骨細(xì)胞線粒體自噬相關(guān)蛋白表達(dá)條帶Fig.2 Expression of mitophagy related proteins in OA chondrocytes after 24 hours of intervention with different concentrations of leptin

圖3 不同濃度瘦素組干預(yù)OA 軟骨細(xì)胞后線粒體自噬相關(guān)蛋白表達(dá)(aP＜0.01 vs control group,bP＜0.05 vs control group)Fig.3 Expression of mitophagy-related proteins in OA chondrocytes treated with different concentrations of leptin (aP＜0.01 vs control group,bP＜0.05 vs control group)

3OA 軟骨細(xì)胞JC-1 探針觀察及熒光強(qiáng)度測定 本研究中，OA 軟骨細(xì)胞紅綠熒光比值為1.36，瘦素干預(yù)后高、低濃度瘦素組紅綠熒光比值均明顯下降(P＜0.05)(圖4、圖5)。

圖4 共聚焦顯微鏡觀察瘦素干預(yù)后線粒體膜電位的變化Fig.4 Changes of mitochondrial membrane potential after leptin intervention observed by confocal microscope

圖5 不同濃度瘦素組干預(yù)OA 軟骨細(xì)胞后熒光變化定量分析(aP＜0.01 vs control group)Fig.5 Quantitative analysis of fluorescence changes after intervention in OA chondrocytes (aP＜0.01 vs control group)

討論

OA 是最常見的關(guān)節(jié)退行性疾病，通常表現(xiàn)為關(guān)節(jié)疼痛、腫脹以及活動受限等，影響了世界約2.5 億人口[5]。OA 的病理過程非常復(fù)雜，主要表現(xiàn)為關(guān)節(jié)軟骨退變，同時伴有軟骨下骨硬化等諸多病理學(xué)改變[1]。成熟軟骨由軟骨細(xì)胞及其自身合成的ECM 共同構(gòu)成。軟骨細(xì)胞是關(guān)節(jié)軟骨中唯一的細(xì)胞成分，其受損可導(dǎo)致ECM 合成及分解代謝失衡，關(guān)節(jié)內(nèi)環(huán)境紊亂并進(jìn)展為OA[6-7]。因此，尋找新的靶向信號通路和有效治療途徑，以提高軟骨細(xì)胞活性，維持關(guān)節(jié)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，是當(dāng)前OA 研究的重要任務(wù)。

線粒體自噬可保護(hù)軟骨細(xì)胞并為細(xì)胞提供能量，是維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的重要機(jī)制，對軟骨細(xì)胞的正常運行具有重要意義[8-9]。Parkin 是一種泛素化連接酶，通過與上游分子聯(lián)合對線粒體膜電位丟失做出應(yīng)答，可啟動受損線粒體清除過程。近年來發(fā)現(xiàn)OA 軟骨細(xì)胞中線粒體自噬受損，Parkin 表達(dá)調(diào)控在其中起到重要作用[10]。當(dāng)線粒體膜去極化時，膜外電位降低導(dǎo)致線粒體外膜內(nèi)外失去電位梯度，Parkin 上游分子PINK1 無法進(jìn)入內(nèi)膜在線粒體膜外聚集。大量PINK1 聚集在線粒體表面可召集Parkin 及其他因子，啟動線粒體自噬，將受損線粒體從線粒體網(wǎng)中分離出來，通過Parkin招募泛素結(jié)合因子p62，后者與LC3A 結(jié)合促進(jìn)孤立膜對線粒體的包裹。通常LC3A 位于細(xì)胞質(zhì)中，當(dāng)游離的LC3A 轉(zhuǎn)化為磷脂酰乙醇胺共軛的LC3B 黏附在自噬體外膜上，標(biāo)志著自噬小體的形成，隨后與溶酶體結(jié)合對其進(jìn)行降解[11-13]。受損線粒體清除后可有效減少軟骨細(xì)胞內(nèi)的活性氧，降低氧化應(yīng)激對細(xì)胞的損害，提高軟骨細(xì)胞存活率。

瘦素是由ob 基因編碼、167 個氨基酸組成的肽類激素，除脂肪組織外，包括各種關(guān)節(jié)組織在內(nèi)的許多其他組織和細(xì)胞也產(chǎn)生瘦素[3]。研究證明關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)存在瘦素受體表達(dá)，且瘦素對OA 的發(fā)展具有兩面性。一方面，外源性瘦素應(yīng)用后關(guān)節(jié)軟骨的胰島素樣生長因子等蛋白表達(dá)增加，提示瘦素可能延緩軟骨退化；另一方面，瘦素可介導(dǎo)和調(diào)節(jié)軟骨和其他關(guān)節(jié)組織的許多炎癥和破壞性反應(yīng)[3,14-15]。瘦素在OA 關(guān)節(jié)軟骨穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮促進(jìn)分解代謝的作用[16-17]。前期研究發(fā)現(xiàn)瘦素干預(yù)人軟骨細(xì)胞后，MMP1、MMP3 及MMP13 和其他炎性因子表達(dá)均增加[18]。體外實驗證明敲低瘦素后MMP13 表達(dá)下降，軟骨分解代謝減慢[19]。

為探究瘦素調(diào)控線粒體自噬對軟骨細(xì)胞的影響，本課題組選取了Parkin、LC3A、LC3B 及MMP13 作為研究指標(biāo)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，瘦素干預(yù)OA軟骨細(xì)胞24 h 后，紅綠熒光比值下降，提示軟骨細(xì)胞線粒體膜電位進(jìn)一步降低；Parkin 和LC3B 蛋白表達(dá)下降，且100 ng/mL 濃度干預(yù)較10 ng/mL濃度干預(yù)下降更多，提示線粒體自噬受損；MMP13 表達(dá)升高，100 ng/mL 濃度干預(yù)較10 ng/mL濃度干預(yù)升高更多(P＜0.01)，與既往研究一致[18]。此外，當(dāng)MMP13 表達(dá)升高時，細(xì)胞代謝失衡，內(nèi)環(huán)境紊亂，促進(jìn)軟骨退化[20]。而LC3A在瘦素干預(yù)后無明顯變化，這可能是因為LC3A位于細(xì)胞質(zhì)中，當(dāng)線粒體自噬受抑制時，LC3A 未能轉(zhuǎn)化為磷脂酰乙醇胺共軛LC3B，完成自噬小體對受損線粒體的包裹，這也從側(cè)面解釋了LC3B 表達(dá)下降的原因。瘦素作為促分解代謝的脂肪因子，不僅促進(jìn)了MMP13 的表達(dá)，同時抑制了線粒體自噬Parkin、LC3B 蛋白的胞內(nèi)表達(dá)。因此，可以推測瘦素可能通過降低線粒體膜電位使線粒體功能受損，同時抑制軟骨細(xì)胞線粒體自噬，促進(jìn)細(xì)胞分解代謝，打破關(guān)節(jié)軟骨穩(wěn)態(tài)，導(dǎo)致軟骨退變。

本研究通過不同濃度的瘦素干預(yù)OA 軟骨細(xì)胞，初步證明了瘦素對線粒體去極化的促進(jìn)作用，以及瘦素在線粒體自噬調(diào)控中的抑制作用，這一作用可能是通過介導(dǎo)Parkin 信號通路來完成的。本研究從分子機(jī)制上部分驗證了瘦素對OA 發(fā)展的促進(jìn)作用，并論證了瘦素對線粒體自噬的抑制機(jī)制，可為OA 治療提供新的靶點。

綜上所述，瘦素可通過抑制Parkin 及LC3B等自噬蛋白表達(dá)，同時促進(jìn)MMP-13 表達(dá)，一定程度上抑制軟骨細(xì)胞線粒體自噬。然而，瘦素在線粒體自噬相關(guān)信號通路中的作用機(jī)制以及瘦素對軟骨下骨中成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞等細(xì)胞中線粒體自噬的作用有待下一步研究。