IGF-1 和IGF-2 基因在關(guān)嶺牛不同組織中的表達(dá)分析

付開斌，陳 祥*，吳 雨，周志楠，張 艷，惠茂茂

（1.貴州大學(xué)高原山地動物遺傳育種與繁殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州省動物遺傳育種與繁殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽 550025；2.貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，貴州貴陽 550025）

IGF（Insulin-Like Growth Factors）家族因其結(jié)構(gòu)與胰島素十分相似，故被人們稱作“胰島素樣生長因子”。IGF 有3 種配體：IGF-1、IGF-2以及胰島素[1]。IGF 通過基因間的相互作用，共同調(diào)節(jié)動物的生物學(xué)過程，也是動物胚胎正常發(fā)育以及出生后動物生長發(fā)育所必需的生長因子[2]。研究表明，IGF 信號系統(tǒng)是構(gòu)成下丘腦-垂體-肝臟軸的主要調(diào)控部分，可以通過控制不同的生長因子及激素的分泌從而控制生物有機(jī)體的生長和發(fā)育[3]。IGF-1是一種多效性激素，可影響葡萄糖代謝、內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、免疫和神經(jīng)系統(tǒng)[4]。此外，IGF-1能控制脂肪、背最長肌比重、體重，促進(jìn)非組蛋白磷酸化和細(xì)胞的生長和分化[5]。在斑馬魚咽裂期，在其胚胎中注射IGF-1，可提高相關(guān)家族基因的表達(dá)量，這表明IGF-1在促進(jìn)前側(cè)結(jié)構(gòu)的生長發(fā)育方面有作用[6]。同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)IGF-1基因還可作為生長發(fā)育的候選基因[7]。IGF-2被人們稱為生長調(diào)節(jié)素A，在細(xì)胞增殖分化、有絲分裂以及程序性死亡等方面發(fā)揮重要作用，對生物個(gè)體的生長發(fā)育有重要影響[8]。有研究顯示，IGF-2在機(jī)體中樞神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)量較高，說明IGF-2與大腦的生長及智力發(fā)育密切相關(guān)[9]。同時(shí)IGF-2還是胚胎和胎兒時(shí)期最重要的生長因子之一，IGF-2在胎兒時(shí)期的血液中濃度較高，出生后IGF-1的濃度迅速上升，推測IGF-2主要是調(diào)節(jié)胚胎時(shí)的生長，而IGF-1則主要調(diào)節(jié)出生后的生長發(fā)育[10]。另有研究發(fā)現(xiàn)IGF-2基因多態(tài)性對豬有重要的生理影響，它可以調(diào)節(jié)豬的瘦肉率、生長速度、背膘厚、心臟重量和背最長肌面積[11-13]。且IGF-2基因與腫瘤的發(fā)生有密切聯(lián)系，在動物體內(nèi)過表達(dá)會導(dǎo)致動物產(chǎn)生乳腺癌、前列腺癌和肝癌等多種疾病，在腫瘤病人的血中發(fā)現(xiàn)IGF-2及其結(jié)合蛋白異常增高[14]。IGF 家族在被研究者發(fā)現(xiàn)后，大多數(shù)動物IGFs 相繼被克隆并測序驗(yàn)證，但I(xiàn)GF-1與IGF-2基因在牛不同組織中的表達(dá)譜卻鮮有報(bào)道。

關(guān)嶺牛作為貴州寶貴的畜禽遺傳資源，具有許多獨(dú)特的優(yōu)勢，其在數(shù)量性狀、經(jīng)濟(jì)性狀以及質(zhì)量性狀方面與其他黃牛相比，均呈現(xiàn)出顯著優(yōu)勢，在地方畜禽動物資源保護(hù)與利用方面具有重要的研究意義和較大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。因此，本研究通過熒光定量PCR 檢測IGF-1和IGF-2基因在關(guān)嶺牛不同組織中的表達(dá)，構(gòu)建關(guān)嶺牛IGF-1基因和IGF-2基因組織表達(dá)圖譜，以期為關(guān)嶺牛的生長發(fā)育、良種選育等提供基礎(chǔ)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 關(guān)嶺牛來自貴州省關(guān)嶺縣，根據(jù)生長飼養(yǎng)記錄，選取年齡為18 月齡、飼養(yǎng)條件相同、體重與體格相近的公牛3 頭。屠宰后，迅速采集肺臟、心臟、脾臟、腎臟、肝臟及背最長肌組織樣，對組織樣進(jìn)行處理并標(biāo)記，放入液氮中冷凍保存。帶回實(shí)驗(yàn)室后，立即轉(zhuǎn)入-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 儀器設(shè)備 PCR 擴(kuò)增儀（C1000 TouchTM）、凝膠成像系統(tǒng)（Universal Hood II）及電泳儀（DYY-2C 型）均購自美國BIO-RAD 公司；超微量紫外分光光度計(jì)（μl trospec 2100 pro）購自安瑪西亞中國有限公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（CFX96 Real-Time System）購自上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

1.1.3 主要試劑 TRIzol、FirstStrand cDNA Synthesis、氯仿、異丙醇及2×Taq MasterMix 均購自貴州艾瑞特生物有限公司；八聯(lián)管、熒光染料UitraSYBRMixture（With ROX）及DNA Marker 1000 均購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)及合成 在NCBI 數(shù)據(jù)庫中查找牛IGF-1基因（NM_001077828.1）和IGF-2基因（NM_001367627.1）mRNA 序列，通過Primer 5.0 軟件設(shè)計(jì)IGF-1基因和IGF-2基因的熒光定量引物，以GAPDH基因作為qRTPCR內(nèi)參基因，送生工生物（上海）股份有限公司進(jìn)行合成。引物序列信息詳見表1。

表1 熒光定量引物信息

1.2.2 總RNA 的提取與檢測 使用TRIzol 法提取關(guān)嶺牛肝臟、脾臟、心臟、肺臟、腎臟及背最長肌組織的總RNA，使用超微量分光光度計(jì)測定RNA 的濃度與純度值，將檢測結(jié)果為單峰且A260/A280 值在1.80～2.10 之間的RNA 置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 cDNA 第一鏈合成 根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，對所采集的關(guān)嶺牛心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟及背最長肌6 種不同組織樣品中的總RNA 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反應(yīng)體系為20 μL：RNA Template（ng/μL）9 μL，Oligo（dT）18Primer 1 μL，RI 1 μL，RT 1 μL，dNTP Mix 2 μL，Buffer 4 μL，Nuclease-free Water 1 μL，Random 1 μL。反應(yīng)條件為42℃孵育60 min，70℃孵育5 min。結(jié)束后在超微量紫外分光光度計(jì)下進(jìn)行濃度和純度檢測，將cDNA 產(chǎn)物置于-20℃冰箱保存。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 以GAPDH為內(nèi)參基因，對所采集的關(guān)嶺牛6 種不同組織的IGF-1基因和IGF-2基因mRNA 進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測。反應(yīng)體系為10 μL：2×UltraSYBR Mixture 5 μL，Primer Sense（10 pmol/μL）0.5 μL，Primer Anti-sense（10 pmol/μL）0.5 μL，cDNA（ng/μL）1 μL，ddH2O 3 μL。反應(yīng)條件為：95℃ 3 min，95℃ 15 s，60℃ 15 s，72℃ 1 min，循環(huán)39 次后進(jìn)行溶解曲線分析，以每5 s 上升0.5℃的速率從65℃上升到95℃，實(shí)驗(yàn)的每個(gè)樣品檢測做3 個(gè)重復(fù)，取平均值。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理及分析 采用2-ΔΔCt法分析IGF-1基因和IGF-2基因在關(guān)嶺牛6 個(gè)不同組織中的相對表達(dá)量，使用SPSS 19.0 軟件對2-ΔΔCt相對定量法所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，比較采用單因素方差分析，并使用LSD 法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，分別以P＜0.05 和P＜0.01 為差異顯著和極顯著的判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1IGF-1基因和IGF-2基因的PCR 擴(kuò)增 通過反轉(zhuǎn)錄，以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA 為模板，對IGF-1基因和IGF-2基因進(jìn)行普通PCR 擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，結(jié)果見圖1。由圖1 可見，擴(kuò)增產(chǎn)物條帶清晰、明亮、透明，無雜帶，且并未發(fā)現(xiàn)條帶上有引物二聚體，特異性較好，與本實(shí)驗(yàn)所需要目的片段大小相符合，可進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

圖1 IGF-1 基因和IGF-2 基因瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果

2.2IGF-1基因和IGF-2基因熒光定量PCR 特異性檢測 由圖2、3 可見，在關(guān)嶺牛各組織中，IGF-1基因和IGF-2基因擴(kuò)增曲線呈現(xiàn)完好的“S”形狀，無非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，產(chǎn)物單一，擴(kuò)增曲線平滑且未出現(xiàn)特殊趨勢；溶解曲線均呈單峰，峰值較好，且無其他引物二聚體雜峰出現(xiàn)，達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求。熒光強(qiáng)度均來源于特異性擴(kuò)增的產(chǎn)物，表明關(guān)嶺牛IGF-1基因和IGF-2基因?qū)崟r(shí)熒光定量qRT-PCR 擴(kuò)增的結(jié)果合理，并具有較好的代表性，所得數(shù)據(jù)可用于實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析。

圖2 IGF-1 基因在關(guān)嶺牛不同組織的擴(kuò)增曲線與溶解曲線

2.3IGF-1基因在關(guān)嶺牛不同組織中的表達(dá)IGF-1基因在關(guān)嶺牛6 個(gè)不同組織中均有表達(dá)，表達(dá)結(jié)果如圖4所示。IGF-1基因表達(dá)趨勢由高到低依次為：肺臟＞肝臟＞心臟＞脾臟＞腎臟＞背最長??；通過比較分析可知，IGF-1基因在肺臟中的表達(dá)量極顯著高于所有組織，在肝臟中的表達(dá)量顯著高于背最長肌，其余各組織間均未達(dá)到差異顯著水平。

圖3 IGF-2 基因在關(guān)嶺牛不同組織的擴(kuò)增曲線與溶解曲線

圖4 IGF-1 基因在關(guān)嶺牛6 個(gè)組織中的相對表達(dá)量

2.4IGF-2基因在關(guān)嶺牛不同組織中的表達(dá) 如圖5 所示，IGF-2基因在關(guān)嶺牛6 個(gè)組織中均有表達(dá)，表達(dá)量由高到低依次為：肺臟＞肝臟＞腎臟＞心臟＞脾臟＞背最長肌。組內(nèi)分析得知，IGF-2基因在肺臟組織中的表達(dá)量極顯著高于其他組織，在腎臟、肝臟表達(dá)量顯著高于脾臟和背最長肌，其余各組織間均未達(dá)到差異顯著水平。

圖5 IGF-2 基因在關(guān)嶺牛6 個(gè)組織中的相對表達(dá)量

3 討 論

IGF 是調(diào)節(jié)動物體細(xì)胞生長的重要激素之一[15]。IGF-1是動物機(jī)體內(nèi)必不可少的重要調(diào)控因子，對動物機(jī)體的生長發(fā)育、生理代謝以及生產(chǎn)等具有重要作用，同時(shí)，IGF-1介導(dǎo)著動物生長激素的生長活性[16]。IGF-2基因的表達(dá)在動物的胚胎發(fā)育、脂肪沉積、骨骼與神經(jīng)發(fā)育、細(xì)胞的增殖分裂以及調(diào)控轉(zhuǎn)化等方面具有極其顯著的作用[17-18]。

本實(shí)驗(yàn)以關(guān)嶺牛為研究對象，采用qRT-PCR 方法，對關(guān)嶺牛6 個(gè)組織IGF-1基因和IGF-2基因的表達(dá)水平進(jìn)行了檢測，發(fā)現(xiàn)IGF-1基因和IGF-2基因在關(guān)嶺牛的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟以及背最長肌中均有表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與IGF-1基因mRNA 在藍(lán)塘仔豬[19]、薩?？斯騕20]、努比亞黑山羊[21]、昆明犬[22]、藏綿羊[23]諸多組織中均有表達(dá)的研究結(jié)果一致；與IGF-2基因mRNA 在河川沙塘鱧[24]、西藏小型豬[25]、揚(yáng)子鱷[26]、從江香豬[2]等均有表達(dá)的研究結(jié)果一致，說明IGF-1基因和IGF-2基因的表達(dá)具有廣譜性。

生長激素/ 類胰島素生長因子軸（GHR/IGF 軸）在調(diào)節(jié)動物機(jī)體生長發(fā)育和代謝方面具有極其重要的生理意義[24]。本研究發(fā)現(xiàn)，IGF-1基因和IGF-2基因均在關(guān)嶺牛肺臟組織中表達(dá)量最高，這可能就與GHR/IGF軸的調(diào)節(jié)機(jī)制有關(guān)。朱曉鋒[2]、李文楊[22]以及李豐耘[27]等研究表明，家畜組織器官中IGF-1基因高表達(dá)對動物機(jī)體的生長發(fā)育具有重要作用，可促進(jìn)生長，直接影響動物的個(gè)體體型，這可能與IGF-1基因在動物不同組織中均有表達(dá)的結(jié)果密切相關(guān)，其具體調(diào)控機(jī)制有待進(jìn)一步研究。在本實(shí)驗(yàn)中，IGF-1基因高表達(dá)于關(guān)嶺牛的肺臟組織，這與IGF-1在大白豬[2,25]背最長肌中表達(dá)量最高的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相反，推測可能是物種不同所致，其具體作用機(jī)理有待進(jìn)一步研究；本實(shí)驗(yàn)結(jié)果又與IGF-1基因在薩?？斯騕21]、昆明犬[23]較高表達(dá)于肝臟的結(jié)果一致，說明肝臟是IGF-1合成的主要器官之一[28]。早在2016 年就有研究報(bào)道，IGF-2基因在肝臟細(xì)胞的表達(dá)對反映肝功能狀態(tài)具有重要意義[29]。而馬彥等[30]研究發(fā)現(xiàn)IGF-2基因過表達(dá)可促進(jìn)肝癌細(xì)胞生長、遷移與侵襲，進(jìn)而參與肝細(xì)胞癌發(fā)生。IGF-2基因在從江香豬[2]肺臟和肝臟中為高表達(dá)，與本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果一致，說明IGF-2基因在肺臟和肝臟的功能調(diào)控中有重要意義。

4 結(jié) 論

關(guān)嶺牛IGF-1、IGF-2基因均于肺臟組織表達(dá)量最高，極顯著高于其他5 個(gè)組織，在背最長肌組織中的表達(dá)量最低，說明IGF-1、IGF-2基因主要定位于肺臟組織；推測IGF-1、IGF-2基因?qū)﹃P(guān)嶺牛的肺臟功能調(diào)控具有十分重要的生理意義。本研究結(jié)果為進(jìn)一步發(fā)掘我國優(yōu)質(zhì)地方畜禽遺傳資源、探究影響關(guān)嶺牛生長發(fā)育的分子機(jī)制提供了參考。