李偉博，韓佳欣，何洋，周靜，紀(jì)麗蓮，胡衛(wèi)成

1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院（烏魯木齊 830052）；2.淮陰師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，江蘇省環(huán)洪澤湖生態(tài)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（淮安 223300）

藏藥密生波羅花（Incarvillra compacta）為紫葳科角蒿屬植物，是中國(guó)特有的草本植物[1]。其主要生長(zhǎng)于海拔在2600～4100 m的甘肅南部、青海、西藏等地，與兩頭毛和西藏羅花共同作為傳統(tǒng)藥材“歐曲”，其花、根、種子均可入藥，主要治療高血壓、月經(jīng)不調(diào)、胃痛、黃疸、消化不良，具有陣痛功效[2-3]。密生波羅花主要生長(zhǎng)于空曠石礫山坡及草灌叢中，具有很強(qiáng)的滋補(bǔ)作用，常被當(dāng)?shù)厝俗鳛橐环N養(yǎng)身的保健藥材來(lái)食用。

目前為止，有關(guān)密生波羅花的研究主要集中在其化學(xué)成分及藥理活性方面。密生波羅花主要的化學(xué)成分包括單萜生物堿、環(huán)己乙醇、神經(jīng)酰胺、香豆素和苯乙醇苷類等[4-5]。但目前還未見(jiàn)有關(guān)密生波羅花營(yíng)養(yǎng)成分的報(bào)道。

此次試驗(yàn)對(duì)密生波羅花的營(yíng)養(yǎng)成分和體外抗氧化活性進(jìn)行基礎(chǔ)研究，為保護(hù)和合理開(kāi)發(fā)利用我國(guó)這一民族藥用植物資源提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

密生波羅花，青海省西寧市藥材市場(chǎng)經(jīng)干燥的整株花；福林酚，索萊寶公司；?唑藍(lán)（MTT），賽國(guó)生物科技；二苯基苦味?；诫拢―PPH）、沒(méi)食子酸、生育酚、1-甲基-4-苯基吡啶離子（MPP+），均為分析純，SIGMA公司；槲皮素、石油醚、無(wú)水乙醇、丙酮、硫酸、氫氧化鈉、鹽酸、乙醚、氫氧化鉀、無(wú)水硫酸銅、亞硝酸鈉、硝酸鋁、無(wú)水碳酸鈉、鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵，均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)。

1.2 儀器與設(shè)備

BS224分析天平，北京多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；5810R臺(tái)式高速離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf公司；DI-220/KD-310全自動(dòng)凱氏定氮儀，瑞典Opsis公司；RE-3000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；DHG-9240A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；Infinite M200 Pro酶標(biāo)儀，瑞士Tecan；DK-8BD電熱恒溫水槽，上海精宏試驗(yàn)設(shè)備有限公司；日立L8900氨基酸分析儀，日本日立公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品處理

將密生波羅花在60 ℃干燥箱中干燥4 h，經(jīng)粉碎機(jī)粉碎后過(guò)1 mm篩，放至干燥處保存，備用。

1.3.2 營(yíng)養(yǎng)成分的測(cè)定方法

總糖的測(cè)定方法參照SN/T 4260—2015[6]，使用苯酚硫酸法測(cè)定；粗脂肪的測(cè)定參照GB/T 5009.6—2016[7]，使用索氏提取法；粗纖維的測(cè)定參照GB 5009.10—2003[8]，使用植物類粗纖維含量的測(cè)定方法；粗蛋白的測(cè)定參照GB/T 6432—2018[9]，使用凱氏定氮法測(cè)定；水分的測(cè)定參照GB/T 5009.3—2016[10]，使用直接干燥法測(cè)定；灰分的測(cè)定參照GB 2019.4—2016[11]，使用高溫灼燒法測(cè)定；氨基酸的測(cè)定參照GB 5009.124—2016[12]，使用日立L8900氨基酸分析儀測(cè)定。

1.3.3 乙醇提取物和水提取物的制備

精確稱取5 g密生波羅花粉末，以料液比1∶20（g/mL）的比例分別加入水和70%乙醇，在90 ℃水浴鍋中加熱3 h，過(guò)濾，旋蒸，冷凍干燥，分別獲得70%乙醇提取物和水提取物，放置干燥器中備用。

1.3.4 黃酮的測(cè)定

將0.3 mL 3%的NaNO2加入0.5 mL 80%乙醇，配制不同質(zhì)量濃度的槲皮素標(biāo)準(zhǔn)溶液（0，25，50，100，200，300，400和500 μg/mL），混勻，避光靜置5 min，然后加入0.3 mL 10% Al(NO3)2和2 mL 4% NaOH，混勻，室溫靜置15 min后在510 nm處測(cè)其吸光度，重復(fù)3次。建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)槲皮素的標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)得密生波羅花中黃酮的含量。

1.3.5 Fe3+能力的測(cè)定

參照景臨林等[13]方法，分別稱取10 mg密生波羅花的兩種提取物，用甲醇配制成0.25，0.5，1，1.5和2 mg/mL的溶液。分別取0.2 mL上述溶液，加入0.5 mL 0.2 mmol/L pH 6.6的磷酸鹽緩沖液和0.5 mL 1%的鐵氰化鉀，渦旋混勻，于50 ℃孵育30 min，在冰上冷卻，加入0.5 mL 10%的三氯乙酸，渦旋混勻。取0.5 mL，加入0.5 mL純水和0.1 mL 1%的三氯化鐵，渦旋混勻，各取0.2 mL加入96孔板，重復(fù)3次，以VE作為標(biāo)準(zhǔn)參照物，用酶標(biāo)儀在700 nm處測(cè)定吸光度。吸光度越大表示鐵還原能力越強(qiáng)。

1.3.6 DPPH自由基清除能力的測(cè)定

參照張良等[14]方法，精確稱取7.88 mg DPPH溶于100 mL甲醇溶液中，得到0.2 mmol/L的DPPH溶液。分別取0.1 mL不同質(zhì)量濃度的受試物（50，100，200，400和600 μg/mL）和0.1 mL DPPH加入96孔板中。按照上述方法，將DPPH與甲醇混合作為對(duì)照組，不同濃度的樣品液與甲醇混合作為空白組。以VE作為標(biāo)準(zhǔn)參照物，避光反應(yīng)30 min，使用酶標(biāo)儀在517 nm處測(cè)得吸光度。DPPH自由基清除率按式（1）計(jì)算。

式中：A1為DPPH甲醇溶液與甲醇溶液混合后的吸光度；A2為待測(cè)液與甲醇溶液混合后的吸光度；A3為DPPH甲醇溶液與甲醇混合后的吸光度。

1.3.7 MTT法檢測(cè)密生波羅花抗氧化應(yīng)激能力

將PC12細(xì)胞接種于DMEM培養(yǎng)基中，在37 ℃，5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取適量對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PC12細(xì)胞，以3×105接種進(jìn)96孔板，待細(xì)胞長(zhǎng)至70%～80%，分別用乙醇提取物和水提取物以不同的質(zhì)量濃度（12.5，25，50和100 μg/mL）處理細(xì)胞30 min，然后加入MPP+誘導(dǎo)細(xì)胞24 h，加入0.05 mL 1 mg/mL的MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，吸去上清液，每孔加入0.1 mL異丙醇，振蕩10 min使紫色結(jié)晶充分溶解，在570 nm處測(cè)其吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)分析均使用Origin 8.0，SPSS 23軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 密生波羅花中的營(yíng)養(yǎng)成分

由表1可知，密生波羅花中粗脂肪為5.33±1.15 g/100 g；粗蛋白為14.36±0.28 g/100 g；粗纖維為66.01±1.8 g/100 g；粗灰分為2.3±0.14 g/100 g；粗水分為4.88±0.3 g/100 g；總糖為1.77±0.09 g/100 g。

表1 密生波羅花中營(yíng)養(yǎng)成分表

2.2 密生波羅花中氨基酸成分和質(zhì)量分?jǐn)?shù)的分析

由表2可知，密生波羅花中共含有17種氨基酸，總氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7.28%，其中必需氨基酸（EAA）共7種，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.84 g/100 g，占總氨基酸（TAA）的39%；非必需氨基酸（NEAA）共10種，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4.442 g/100 g，占總氨基酸（TAA）的61%，EAA/NEAA為64%，均接近于FAO/WHO所推薦的EAA/TAA約為40%，EAA/NEAA約為60%的要求。

表2 密生波羅花中氨基酸含量

密生波羅花中藥用氨基酸共11種，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5.27 g/100 g，占總氨基酸（TAA）的72%。鮮味氨基酸共4種，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.311 g/100 g，占總氨基酸的32%。其中谷氨酸最高，為1.044 g/10 g，占總氨基酸的14%，不僅為人類和動(dòng)物提供了重要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，還可以和氨反應(yīng)增加還原型谷胱甘肽的生成，促進(jìn)抗氧化作用[16]。

2.3 呈味氨基酸分析

密生波羅花中呈味氨基酸分析見(jiàn)圖1。密生波羅花中谷氨酸和天冬氨酸總的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.643 g/100 g，占總氨基酸的22.56%。谷氨酸呈酸性，天冬氨酸呈甜性，它們能很好地調(diào)和其他滋味，從而使藥物體現(xiàn)出微苦、微甘的口感。

圖1 密生波羅花中呈味氨基酸分析

2.4 密生波羅花中抗氧化活性的研究

2.4.1 密生波羅花中總黃酮的測(cè)定

密生波羅花總黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=0.0013X-0.0039（R2=0.9987），測(cè)得密生波羅花中總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6.78 g/100 g。

2.4.2 乙醇提取物和水提取物的制備

乙醇提取物和水提取物的得率如表3所示。結(jié)果表明，水提取物的得率明顯高于70%乙醇提取物的得率。

表3 密生波羅花提取物的得率

2.4.3 DPPH清除能力的測(cè)定[17]

如圖2所示，在相同提取條件不同提取溶液中，當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到600 μg/mL時(shí)，乙醇提取物和水提取物對(duì)DPPH的清除能力基本一致，略高于VE對(duì)DPPH自由基的清除能力并且隨著濃度的增加保持穩(wěn)定狀態(tài)。由此表明密生波羅花具有一定的DPPH自由基清除能力。

圖2 密生波羅花對(duì)DPPH自由基清除率

2.4.4 Fe3+還原能力的測(cè)定[18]

如圖3所示，隨著密生波羅花中提取物濃度的增加，其吸光度也呈上升趨勢(shì)。當(dāng)乙醇提取物為1.5 mg時(shí)，與0.4 mg的VE的還原能力相同；當(dāng)水提取物為0.25 mg時(shí)，與0.05 mg的VE的還原能力相同，由此表明密生波羅花具備一定的還原能力。

圖3 密生波羅花對(duì)Fe3+還原能力的測(cè)定

2.4.5 密生波羅花對(duì)MPP+誘導(dǎo)PC12細(xì)胞氧自由基損傷修復(fù)能力測(cè)定[19]

如圖4所示，與MPP+誘導(dǎo)組相比，低濃度的密生波羅花提取物處理組細(xì)胞存活率明顯升高。結(jié)果表明，密生波羅花能抑制MPP+誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷，具有一定的氧自由基修復(fù)能力。

圖4 密生波羅花對(duì)MPP+誘導(dǎo)PC12細(xì)胞氧自由基損傷修復(fù)能力測(cè)定

3 討論與結(jié)論

密生波羅花中營(yíng)養(yǎng)成分含量較為豐富，其中粗蛋白、粗纖維含量較高，蛋白質(zhì)是一切生命的物質(zhì)基礎(chǔ)，缺少蛋白質(zhì)可導(dǎo)致人體免疫力下降，粗纖維可以改善腸道蠕動(dòng)，有助于人體腸道的消化。氨基酸含量的測(cè)定，體現(xiàn)出藥材的質(zhì)量[20]，也是其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的重要組成部分。密生波羅花中氨基酸成分比較全面，其中必須氨基酸占總氨基酸的39%，藥效氨基酸占總氨基酸的72%。呈味氨基酸所呈現(xiàn)的酸甜味，可以掩蓋其他的不良風(fēng)味。

密生波羅花中水提取物的得率大于乙醇提取物的得率，可能是因?yàn)椴煌奶崛∪軇┰斐傻牟町悺Ｑ踝杂苫侨梭w代謝的產(chǎn)物，可造成生物膜系統(tǒng)損傷以及細(xì)胞內(nèi)氧化磷酸化障礙，與人體疾病、衰老、死亡密切相關(guān)[21]。密生波羅花具有較好的抗氧化活性，密生波羅花中乙醇提取物和水提取物對(duì)DPPH自由基的IC50分別為93.1和184.13 μg/mL，0.25 mg的水提取物還原力相當(dāng)于0.05 mg VE的還原能力，1.5 mg的乙醇提取物還原能力相當(dāng)于0.4 mg VE的還原能力。隨著濃度的升高，乙醇提取物的抗氧化能力高于水提取物的抗氧化能力，可能是因?yàn)橐掖继崛∥镏悬S酮的含量比較高。Chavan等[22]的研究表明，黃酮是大多數(shù)植物提取物抗氧化的物質(zhì)基礎(chǔ)，密生波羅花中黃酮含量比較豐富，可能是其發(fā)揮抗氧化的物質(zhì)基礎(chǔ)，具體的化合物成分需要進(jìn)一步的研究。

1-甲基-4-苯基吡啶離子（MPP+）是一種作為氧化應(yīng)激的誘導(dǎo)劑，可引起PC12細(xì)胞氧自由基損傷[23]。密生波羅花乙醇提取物和水提取物在低濃度時(shí)表現(xiàn)出明顯的對(duì)MPP+引起的PC12細(xì)胞氧自由基損傷修復(fù)作用，但水提取物明顯高于乙醇提取物的氧自由基修復(fù)能力，可能是因?yàn)槊苌_花乙醇提取物的提取溫度過(guò)高造成的。薛長(zhǎng)暉等[24]研究表明，提取液在提取過(guò)程中反應(yīng)溫度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致黃酮變質(zhì)。結(jié)合抗氧化活性可以得出，密生波羅花提取物可通過(guò)兩種途徑對(duì)MPP+誘導(dǎo)PC12細(xì)胞造成的氧自由基損傷進(jìn)行修復(fù)：一是直接清除氧自由基，減少自由基對(duì)蛋白、脂質(zhì)、DNA的損傷；二是通過(guò)對(duì)細(xì)胞內(nèi)抗氧化能力的改善和修復(fù)。

此次試驗(yàn)對(duì)密生波羅花中營(yíng)養(yǎng)成分、氨基酸及體外抗氧化活性進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果表明，密生波羅花中營(yíng)養(yǎng)成分豐富且氨基酸種類齊全，具有很好的抗氧化活性，而抗氧化活性是保健品的重要組成部分[25]。此次試驗(yàn)為密生波羅花作為天然抗氧化劑用于保健品的開(kāi)發(fā)利用指明了道路。