牛蒡子苷對高糖誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡和氧化損傷的影響

馮萬國，徐昕涌，許慧

糖尿病是世界范圍內(nèi)發(fā)病率較高的疾病，而糖尿病視網(wǎng)膜病變（diabetic retinopathy,DR）是常見的糖尿病損傷之一[1]。視網(wǎng)膜是人體代謝活動最為活躍的組織，其可以將光轉(zhuǎn)化成為神經(jīng)沖動，通過視神經(jīng)傳遞到大腦[2]。視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞（retinal ganglion cells,RGCs）是視神經(jīng)的重要組成部分，高糖刺激后的RGCs 出現(xiàn)氧化損傷和凋亡過度，高糖誘導(dǎo)RGCs損傷是DR 發(fā)生的重要原因[3]。牛蒡子苷是一個從牛蒡的成熟果實牛蒡子中提取出來的活性成分，有多重生物學(xué)作用，如抗炎、降血糖、調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤等[4]。研究[5]發(fā)現(xiàn)，牛蒡子苷具有改善糖尿病相關(guān)并發(fā)癥的作用，能夠緩解糖尿病腎組織損傷。牛蒡子苷治療后的糖尿病大鼠視網(wǎng)膜以及視神經(jīng)損傷得到明顯改善[6]?，F(xiàn)階段對于牛蒡子苷對體外高糖誘導(dǎo)的RGCs 氧化損傷和細(xì)胞凋亡的作用仍不明確。本次體外實驗建立高糖RGCs 損傷模型，明確牛蒡子苷對高糖誘導(dǎo)的RGCs 凋亡和氧化損傷的影響，以期為牛蒡子苷治療DR 提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

RGCs-5（上海滬震生物科技有限公司）；牛蒡子苷（大連美侖生物技術(shù)有限公司）；SOD 活性檢測試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）；caspase-3 活性檢測試劑盒（北京諾博萊德科技有限公司）；ROS 水平檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所）；Lipofectamine 2000（美國invitrogen）；MDA 水平檢測試劑盒（上?？道噬锟萍加邢薰荆?；TLR4 抗體（美國Santa Cruz Biotechnology）；TLR4 過表達(dá)載體（pcDNATLR4）由和元生物技術(shù)(上海)股份有限公司構(gòu)建。

1.2 分組及處理方法

將RGCs 細(xì)胞分成5 組，分別是對照組、高糖組、牛蒡子苷低劑量組(ARC-Ⅰ組)、中劑量組(ARC-Ⅱ組)、高劑量組(ARC-Ⅲ組)，其中高糖組、ARC-I 組、ARC-Ⅱ組、ARC-Ⅲ組細(xì)胞在培養(yǎng)時分別添加50 mmol/L 的葡萄糖，ARC-I 組、ARC-Ⅱ組、ARC-Ⅲ組依次添加牛蒡子苷濃度為0.2 mg/mL、0.4 mg/mL、0.8 mg/mL。對照組為空白對照。

1.3 MTT 實驗檢測細(xì)胞增殖

將RGCs 細(xì)胞接種到96 孔板內(nèi)，按照對照組、高糖組、ARC-Ⅰ、ARC-Ⅱ、ARC-Ⅲ組分組方法處理細(xì)胞，放在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，在每個孔內(nèi)加入10 μL 的MTT 溶液，繼續(xù)放在37℃孵育4 h。取出培養(yǎng)板，用移液槍把每個孔中的液體吸掉，再加入150 μL 的甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)，反應(yīng)10 min 后，觀察結(jié)晶物溶解，用酶標(biāo)儀測定光密度（optical density，OD）值，經(jīng)過空白孔調(diào)零以后，以對照組細(xì)胞存活率為100%，分析其余各組細(xì)胞存活率。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡

按照對照組、高糖組、ARC-Ⅰ、ARC-Ⅱ、ARC-Ⅲ組分組方法處理培養(yǎng)細(xì)胞48 h 以后，收集各組細(xì)胞，分別添加提前預(yù)冷以后的PBS 緩沖溶液將細(xì)胞洗滌3 次。每組收集約106 個細(xì)胞，用結(jié)合緩沖液將細(xì)胞懸浮以后，添加PI 以及Annexin V-FITC 溶液各5 μL，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡變化。

1.5 caspase-3 活性變化

按照對照組、高糖組、ARC-Ⅰ、ARC-Ⅱ、ARC-Ⅲ組分組方法處理培養(yǎng)細(xì)胞48 h 以后，收集各組細(xì)胞，用caspase-3 活性檢測試劑盒檢測細(xì)胞中caspase-3 的活性變化，步驟完全按照試劑盒操作說明進行，結(jié)果以對照組為參照，分析高糖組及ARC 3種濃度組細(xì)胞caspase-3 活性變化。

1.6 ROS、MDA、SOD 水平

按照對照組、高糖組、ARC-Ⅰ、ARC-Ⅱ、ARC-Ⅲ組分組方法處理培養(yǎng)細(xì)胞48 h 以后，收集各組細(xì)胞，用ROS 水平測定試劑盒、MDA 含量檢測試劑盒、SOD 活性檢測試劑盒分別測定細(xì)胞中ROS、MDA、SOD 水平，步驟完全按照試劑盒操作說明進行。ROS 水平檢測結(jié)果以對照組為參照，分析高糖組及ARC 3 種濃度組ROS 水平變化。

1.7 TLR4 蛋白表達(dá)

按照對照組、高糖組、ARC-Ⅰ、ARC-Ⅱ、ARC-Ⅲ組分組方法處理培養(yǎng)細(xì)胞48 h 以后，收集各組細(xì)胞，添加含有PMSF 的RIPA 裂解試劑，放在冰上裂解20 min 以后，收集細(xì)胞裂解溶液，12,000 g 離心10 min，吸取上清即為細(xì)胞蛋白。用BCA 方法測定細(xì)胞蛋白濃度。SDS-PAGE 電泳用12%的分離膠以及5%的濃縮膠，在上樣孔內(nèi)添加蛋白樣品50 μg，以80 V 的電壓在濃縮膠中跑20 min，再以100 V 的電壓在分離膠中跑1 h。切下分離膠，將PVDF 膜裁剪成合適大小，浸泡在甲醇中活化3 min，然后放在轉(zhuǎn)膜緩沖液中結(jié)合5 min，設(shè)置100 mA 的電流轉(zhuǎn)膜50 min。PVDF 膜放在封閉液（5%脫脂奶粉）中孵育1.5 h；再放在一抗稀釋液中，在4℃孵育過夜；最后放在二抗稀釋液中，在室溫孵育1.5 h。用ECL 方法顯色。掃描條帶的灰度值，內(nèi)參為GAPDH，分析目的蛋白TLR4 的表達(dá)變化。TLR4 一抗按照1:1,000 稀釋，二抗按照1:4,000 稀釋。

1.8 TLR4 過表達(dá)載體對細(xì)胞增殖、凋亡和ROS 水平作用檢測

RGCs 中轉(zhuǎn)染TLR4 過表達(dá)載體和空載體（NC）陰性對照，再用含有50 mmol/L 的葡萄糖、0.4 mg/mL的牛蒡子苷聯(lián)合培養(yǎng)，分別記為ARC-Ⅱ+TLR4 和ARC-Ⅱ+NC 組，細(xì)胞轉(zhuǎn)染按照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑操作說明進行。細(xì)胞培養(yǎng)48 h 以后，MTT檢測細(xì)胞增殖活性（步驟參照1.3），流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡（步驟參照1.4），試劑盒檢測caspase-3 活性（步驟參照1.5）和ROS、MDA、SOD 水平（步驟參照1.6），Western blot 檢測TLR4 蛋白表達(dá)（步驟參照1.7）。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法

采用軟件SPSS21.0 進行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)按照均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用方差分析中LSD-t 檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RGCs 細(xì)胞增殖率和凋亡率比較

增殖率：5 組間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=78.63，P=0.000）。與對照組比較，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（t高糖組=13.310，P=0.000；tARC-Ⅰ=9.785，P=0.000；tARC-Ⅱ=5.162，P=0.000；tARC-Ⅲ=1.640，P=0.121）。與高糖組比較，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（tARC-Ⅰ=6.643，tARC-Ⅱ=10.880，tARC-Ⅲ=15.925，均P=0.000）。與ARC-Ⅰ組比較，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（tARC-Ⅱ=5.795，tARC-Ⅲ=10.812，均P=0.000）。與ARC-Ⅱ組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（tARC-Ⅲ=15.925，P=0.000）（圖1、表1）。

凋亡率：5 組間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=282.60，P=0.000）。與對照組比較，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（t高糖組=29.123，tARC-Ⅰ=24.175，tARC-Ⅱ=24.748，tARC-Ⅲ=14.672，均P=0.000）。與高糖組比較，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（tARC-Ⅰ=4.540，tARC-Ⅱ=12.009，tARC-Ⅲ=21.367，均P=0.000）。與ARC-Ⅰ組比較，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（tARC-Ⅱ=7.705，tARC-Ⅲ=16.314，均P=0.000）。與ARC-Ⅱ組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（tARC-Ⅲ=10.491，P=0.000）（圖1、表1）。

圖1 流式細(xì)胞術(shù)測定牛蒡子苷對高糖誘導(dǎo)的RGCs 凋亡影響。ARC-Ⅰ牛蒡子苷低劑量組；ARC-Ⅱ牛蒡子苷中劑量組；ARC-Ⅲ牛蒡子苷高劑量組

表1 牛蒡子苷處理后的高糖條件下RGCs 增殖率、凋亡率以及caspase-3 活性變化（，n=9）

表1 牛蒡子苷處理后的高糖條件下RGCs 增殖率、凋亡率以及caspase-3 活性變化（，n=9）

注：* 與對照組比較，P＜0.05；# 與高糖組比較，P＜0.05；&與ARC-I 組比較，P＜0.05；▲與ARC-Ⅱ組比較，P＜0.05。ARC-Ⅰ牛蒡子苷低劑量組；ARC-Ⅱ牛蒡子苷中劑量組；ARC-Ⅲ牛蒡子苷高劑量組；caspase-3 剪切的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3

2.2 caspase-3 蛋白表達(dá)水平比較

5 組間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=410.90，P=0.000）。與對照組比較，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（t高糖組=32.126，tARC-Ⅰ=24.371，tARC-Ⅱ=15.881，tARC-Ⅲ=8.199，均P=0.000）。與高糖組比較，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（tARC-Ⅰ=12.640，tARC-Ⅱ=20.360，tARC-Ⅲ=25.989，均P=0.000）。與ARC-Ⅰ組比較，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（tARC-Ⅱ=9.161，tARC-Ⅲ=16.279，均P=0.000）。與ARC-Ⅱ組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（tARC-Ⅲ=7.467，P=0.000）（表1、圖1）。

2.3 ROS、MDA、SOD 水平比較

ROS 水平：5 組組間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=195.89，P=0.000）。與對照組比較，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（t高糖組=25.564，tARC-Ⅰ=17.409，tARC-Ⅱ=14.698，tARC-Ⅲ=6.240，均P=0.000）。與高糖組比較，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（tARC-Ⅰ=6.103，tARC-Ⅱ=12.481，tARC-Ⅲ=19.101，均P=0.000）。與ARC-Ⅰ組比較，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（tARC-Ⅱ=5.653，tARC-Ⅲ=12.219，均P=0.000）。與ARC-Ⅱ組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（tARC-Ⅲ=7.972，P=0.000）（表2）。

表2 牛蒡子苷處理后的高糖條件下RGCs 的ROS、MDA、SOD 及TLR4 蛋白水平變化（，n=9）

表2 牛蒡子苷處理后的高糖條件下RGCs 的ROS、MDA、SOD 及TLR4 蛋白水平變化（，n=9）

注：* 與對照組比較，P＜0.05；# 與高糖組比較，P＜0.05；&與ARC-I 比較，P＜0.05；▲與ARC-Ⅱ比較，P＜0.05。ARC-Ⅰ牛蒡子苷低劑量組；ARC-Ⅱ牛蒡子苷中劑量組；ARC-Ⅲ牛蒡子苷高劑量組；ROS 活性氧；MDA 丙二醛；SOD 超氧化物歧化酶；TLR4 Toll 樣受體4

MDA 水平：5 組組間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=276.18，P=0.000）。與對照組比較，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（t高糖組=25.468，tARC-Ⅰ=25.358，tARC-Ⅱ=17.985，tARC-Ⅲ=18.807，均P=0.000）。與高糖組比較，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（tARC-Ⅰ=7.991，tARC-Ⅱ=13.309，tARC-Ⅲ=19.815，均P=0.000）。與ARC-Ⅰ組比較，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（tARC-Ⅱ=6.923，tARC-Ⅲ=16.259，均P=0.000）。與ARC-Ⅱ組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（tARC-Ⅲ=8.341，P=0.000）（表2）。

SOD 水平：5 組組間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=273.88，P=0.000）。與對照組比較，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（t高糖組=22.891，tARC-Ⅰ=17.698，tARC-Ⅱ=10.224，tARC-Ⅲ=4.510，均P=0.000）。與高糖組比較，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（tARC-Ⅰ=19.128，tARC-Ⅱ=28.021，tARC-Ⅲ=29.600，均P=0.000）。與ARC-Ⅰ組比較，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（tARC-Ⅱ=14.773，tARC-Ⅲ=20.215，均P=0.000）。與ARC-Ⅱ組比較，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（tARC-Ⅲ=8.093，P=0.000）（表2）。

2.4 TLR4 蛋白表達(dá)比較

5 組組間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=149.90，P=0.000）。與對照組比較，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（t高糖組=17.441，tARC-Ⅰ=14.000，tARC-Ⅱ=8.485，tARC-Ⅲ=4.160，均P=0.000）。與高糖組比較，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（tARC-Ⅰ=6.240，tARC-Ⅱ=12.075，tARC-Ⅲ=16.128，均P=0.000）。與ARC-Ⅰ組比較，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（tARC-Ⅱ=7.200，tARC-Ⅲ=12.746，均P=0.000）。與ARC-Ⅱ組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（tARC-Ⅲ=5.824，P=0.000）（表2、圖2）。

圖2 Western blot 檢測牛蒡子苷對高糖條件下RGCs 中TLR4 蛋白表達(dá)影響。ARC-Ⅰ牛蒡子苷低劑量組；ARC-Ⅱ牛蒡子苷中劑量組；ARC-Ⅲ牛蒡子苷高劑量組；TLR4 Toll 樣受體4；GAPDH 甘油醛-3-磷酸脫氫酶

2.5 TLR4 過表達(dá)載體對牛蒡子苷影響高糖條件下RGCs 中TLR4 蛋白表達(dá)作用

在RGCs 中轉(zhuǎn)染TLR4 過表達(dá)載體，經(jīng)過高糖和牛蒡子苷處理后，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（t=9.391，P=0.001）（表3、圖3）。

圖3 Western blot 檢測TLR4 過表達(dá)載體轉(zhuǎn)染后對牛蒡子苷影響高糖條件下RGCs 中TLR4 蛋白表達(dá)作用。ARC-Ⅱ+NC 牛蒡子苷中劑量組+空載體；ARC-Ⅱ+TLR4 牛蒡子苷中劑量組+過表達(dá)TLR4；TLR4 Toll 樣受體4；GAPDH 甘油醛-3-磷酸脫氫酶

2.6 TLR4 過表達(dá)載體對牛蒡子苷影響高糖條件下RGCs 增殖率、凋亡率及ROS、MDA、SOD 水平比較

在RGCs 中轉(zhuǎn)染TLR4 過表達(dá)載體，經(jīng)過高糖和牛蒡子苷處理后，ARC-Ⅱ+NC 與ARC-Ⅱ+TLR4比較，細(xì)胞增殖率（t=7.639，P=0.000），凋亡率（t=7.129，P=0.000）和caspase-3 活性（t=8.231，P=0.000），ROS水平（t=13.891，P=0.000）和MDA 水平（t=8.406，P=0.000），SOD 活性（t=9.966，P=0.000），差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（表3、圖4）。

圖4 流式細(xì)胞術(shù)測定TLR4 過表達(dá)載體轉(zhuǎn)染后對牛蒡子苷影響高糖條件下RGCs 凋亡影響。ARC-Ⅱ+NC 牛蒡子苷中劑量組+空載體；ARC-Ⅱ+TLR4 牛蒡子苷中劑量組+過表達(dá)TLR4

表3 TLR4 過表達(dá)載體轉(zhuǎn)染后對牛蒡子苷影響高糖條件下RGCs 增殖率、凋亡率、caspase-3 活性和ROS、MDA、SOD 及TLR4 水平變化（，n=9）

表3 TLR4 過表達(dá)載體轉(zhuǎn)染后對牛蒡子苷影響高糖條件下RGCs 增殖率、凋亡率、caspase-3 活性和ROS、MDA、SOD 及TLR4 水平變化（，n=9）

注：* 與ARC-Ⅱ+NC 比較，P＜0.05。ARC-Ⅱ+NC 牛蒡子苷中劑量組+空載體；ARC-Ⅱ+TLR4 牛蒡子苷中劑量組+過表達(dá)TLR4；TLR4 Toll樣受體4；caspase-3 剪切的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3；ROS 活性氧；MDA 丙二醛；SOD 超氧化物歧化酶

3 討論

視網(wǎng)膜的內(nèi)層結(jié)構(gòu)是由RGCs 之間相互鑲嵌而構(gòu)成，RGCs 的軸突集合形成視神經(jīng)[7]。DR 發(fā)生的重要原因之一是RGCs 損傷。高糖條件下，RGCs 內(nèi)的抗氧化酶SOD 活性降低，細(xì)胞內(nèi)的ROS 不能被及時清除而聚集在細(xì)胞內(nèi)，這些ROS 可以將脂質(zhì)過氧化，產(chǎn)生大量的MDA，造成氧化損傷[8]。另外，ROS 還可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生，其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生的途徑與caspase 有關(guān)[9]。caspase 家族含有多個成員，這些蛋白家族成員活性升高后可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生[10]。caspase-3 是caspase 蛋白家族的成員之一，位于凋亡反應(yīng)的下游，其活性升高被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡發(fā)生的標(biāo)志[11]。本實驗結(jié)果顯示，高糖處理后的RGCs 活性降低，細(xì)胞凋亡率和caspase-3 活性升高，細(xì)胞中ROS 水平及MDA 水平也升高，SOD 活性下降，提示高糖誘導(dǎo)RGCs 氧化損傷和細(xì)胞凋亡，這與上述研究結(jié)果一致，提示成功構(gòu)建了體外高糖RGCs 損傷模型。

牛蒡子是我國的常見中藥，牛蒡子苷是其主要的活性成分之一，具有消炎、抗病毒、改善尿蛋白等功效[12-14]。研究[15]報道表明，牛蒡子苷對于糖尿病具有一定的治療作用，牛蒡子苷處理后的糖尿病腎病大鼠腎組織病變明顯減輕。還有研究[6]顯示，牛蒡子苷可以改善DR，牛蒡子苷灌胃處理后的糖尿病大鼠視網(wǎng)膜形態(tài)、厚度等發(fā)生明顯變化。本次的實驗顯示，牛蒡子苷處理可以提高高糖條件下的RGCs活性，減少細(xì)胞凋亡，降低細(xì)胞中ROS 和MDA 水平，提高SOD 活性，說明牛蒡子苷抑制高糖誘導(dǎo)的RGCs 氧化損傷和細(xì)胞凋亡，提示牛蒡子苷有改善DR 的作用。

實驗結(jié)果還顯示，高糖處理后的RGCs 中TLR4蛋白表達(dá)水平升高，并且牛蒡子苷可以減少TLR4的表達(dá)，提示牛蒡子苷的作用機制可能與TLR4 有關(guān)。TLR4 是一個在哺乳動物中能夠?qū)⒓?xì)胞外的抗原信息識別并傳遞至細(xì)胞內(nèi)的跨膜蛋白，參與組織炎癥、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞生長、組織代謝等多種生理過程[16-19]。研究[20]表明，糖尿病RGCs 中TLR4 過度表達(dá)，抑制TLR4 可以減少高糖誘導(dǎo)的RGCs 損傷。本實驗表明，過表達(dá)TLR4 可以逆轉(zhuǎn)牛蒡子苷對高糖誘導(dǎo)的RGCs 氧化損傷和凋亡的抑制作用，提示牛蒡子苷通過降低TLR4 的表達(dá)發(fā)揮高糖RGCs 損傷保護作用。

綜上，牛蒡子苷在糖尿病視網(wǎng)膜損傷中可能發(fā)揮保護作用，其可以抑制高糖誘導(dǎo)的RGCs 氧化損傷和細(xì)胞凋亡，作用機制與下調(diào)TLR4 的表達(dá)有關(guān)。本次的實驗結(jié)果為牛蒡子苷治療糖尿病視網(wǎng)膜損傷提供了參考，為研究牛蒡子苷在DR 中的作用機制提供了理論資料。