不同外源物質(zhì)對(duì)三種柴胡種胚發(fā)育的影響

劉計(jì)權(quán)，王 宇，劉 昕，劉佳寧，王永輝*

(1. 山西中醫(yī)藥大學(xué)，山西 榆次 030619； 2. 北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 102488)

傘形科(Umbelliferae)柴胡屬(Bupleurum)植物約有150種，我國(guó)分布有42 種、17 變種、7 變型[1]。2020版《中國(guó)藥典》規(guī)定，中藥柴胡來(lái)源于藥用植物柴胡(BupleurumchinensisDC.)或狹葉柴胡(B.scorzonerifoliumWilld.)的根，按性狀不同，分別習(xí)稱(chēng)“北柴胡”和“南柴胡”[2]。藥用植物黑柴胡(B.smithiiWolff)的根在華北、西北地區(qū)作柴胡藥用，被收載于山西、甘肅等地方中藥材標(biāo)準(zhǔn)中[3-5]。

野生柴胡主要分布于華北、東北、西北、山東等地，由于柴胡野生資源蘊(yùn)藏量非常有限，目前商品柴胡主要來(lái)源于人工栽培。20世紀(jì)90年代初，山西、陜西、甘肅和河北等地開(kāi)始人工種植柴胡。在柴胡規(guī)范化栽培中以種子進(jìn)行繁殖，所以種子質(zhì)量是影響柴胡產(chǎn)量和品質(zhì)的重要因素。由于柴胡種子具有胚后熟的特性，新收獲柴胡種子的種胚體積僅占胚腔的5.1%，尚處于休眠狀態(tài)，需經(jīng)過(guò)形態(tài)后熟過(guò)程才能發(fā)芽。而且柴胡種子極小，千粒重只有1 g左右，常溫下貯藏的種子壽命不超過(guò)1年。這些因素導(dǎo)致柴胡播種后發(fā)芽率和出苗率極低、出苗不整齊現(xiàn)象，嚴(yán)重影響到柴胡栽培中的產(chǎn)量和質(zhì)量[6]。

通過(guò)GA3、肌醇、煙酸三種不同外源物質(zhì)處理三種柴胡種子，研究其對(duì)柴胡種胚發(fā)育的影響，以期加速柴胡種胚的發(fā)育、縮短后熟期、提高種子的發(fā)芽率，服務(wù)于柴胡的規(guī)范化種植。

1 材 料

供試種子：柴胡(B.chinensis)種子采自山西省絳縣規(guī)范化種植基地2年生植株，狹葉柴胡(B.scorzonerifolium)種子采自山西省朔州市平魯區(qū)野生植株，黑柴胡(B.smithii)種子采自山西省寧武縣野生植株。2019年新采集的3種柴胡種子均經(jīng)過(guò)鑒定，保存于4℃冰箱備用。

試劑：GA3(北京索萊寶科技有限公司)、肌醇(上海信裕生物科技有限公司)、煙酸(上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司)、無(wú)水乙醇(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)。

儀器：FA2014電子天平(北京中儀宇盛科技有限公司)、BA410生物顯微鏡(麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司)、HZC-250恒溫培養(yǎng)箱(蘇州市培英實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)、4號(hào)不銹鋼手術(shù)刀柄(潮安縣彩塘世紀(jì)順興發(fā)醫(yī)療器械)、22號(hào)手術(shù)刀片(揚(yáng)州源康醫(yī)療器械有限公司)、5 cm×2.6 cm不銹鋼雙面刀片(上海吉列有限公司)。

2 方法

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 溶液配制

用電子天平分別稱(chēng)取GA3、肌醇和煙酸適量，用蒸餾水將其溶解，配制GA3(50、100、150、200、250 mg/L)、肌醇(25、50、75、100、125 mg/L)和煙酸(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/L)系列濃度溶液，放置冰箱4℃保存。

2.1.2 供試種子處理

挑選飽滿、大小、色澤一致的優(yōu)質(zhì)柴胡種子，用70%酒精溶液消毒30 s，消毒后用蒸餾水反復(fù)清洗種子3次，之后分別將種子浸泡在配制好的系列濃度溶液中，室溫下浸泡24 h，蒸餾水做空白對(duì)照。

2.1.3 供試種子培養(yǎng)

取直徑12 cm的干凈培養(yǎng)皿，每個(gè)培養(yǎng)皿底部墊2層吸水紙，加入5 mL蒸餾水浸潤(rùn)吸水紙。將上述浸泡處理的柴胡種子均勻擺放至培養(yǎng)皿，每個(gè)培養(yǎng)皿擺放100粒種子，蓋上蓋子置于20℃培養(yǎng)箱進(jìn)行無(wú)光培養(yǎng)，每處理重復(fù)4次。

在供試種子培養(yǎng)期間，每天查看培養(yǎng)皿中供試種子的情況，如有發(fā)霉種子及時(shí)進(jìn)行清洗并更換吸水紙，每天中午定時(shí)添加1 mL蒸餾水以保持濕度。

2.1.4 種子胚率和發(fā)芽率測(cè)定

上述種子培養(yǎng)第20天測(cè)定種子胚率和發(fā)芽率。從每個(gè)培養(yǎng)皿中隨機(jī)抽取10枚種子，從種子中間縱切、制片，在顯微鏡下測(cè)定種子的胚長(zhǎng)、胚乳長(zhǎng)，并計(jì)算胚率(胚率=胚長(zhǎng)/胚乳長(zhǎng)×100%)；培養(yǎng)結(jié)束后記錄發(fā)芽種子數(shù)，并計(jì)算發(fā)芽率。

2.2 正交優(yōu)化試驗(yàn)

通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)得到GA3、肌醇和煙酸浸種后促進(jìn)柴胡種胚發(fā)育的最適宜濃度，在此基礎(chǔ)上選用L9(34)正交表，以GA3(A)、肌醇(B)、煙酸(C)作為考察因素，按照體積比為1∶1∶1進(jìn)行組合，對(duì)柴胡種子浸泡處理。以種子的胚率為指標(biāo)，進(jìn)行最佳組合考察，每個(gè)因素設(shè)3個(gè)水平。

3 結(jié)果

3.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

3.1.1 GA3處理對(duì)柴胡種子胚率的影響

GA3處理對(duì)柴胡種子胚率的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。隨著GA3處理濃度的加大，柴胡種子的胚率呈現(xiàn)遞增趨勢(shì)，當(dāng)處理濃度為200 mg/L時(shí)，種子胚率達(dá)到最大67.44%，當(dāng)處理濃度為250 mg/L時(shí)，種子胚率出現(xiàn)下降。本試驗(yàn)中GA3為200 mg/L時(shí)是最適宜的處理濃度。

表1 GA3對(duì)柴胡種子胚率的影響Table 1 Effects of GA3 on embryo rates of B. chinensis seeds

3.1.2 肌醇處理對(duì)柴胡種子胚率的影響

肌醇處理對(duì)柴胡種子胚率的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。肌醇系列濃度處理柴胡種子后，種子胚率出現(xiàn)先增加后下降的趨勢(shì)，其中本試驗(yàn)中處理濃度為75 mg/L時(shí)為最適宜濃度，種子胚率達(dá)到最大46.01%。

表2 肌醇對(duì)柴胡種子胚率的影響Table 2 Effects of inositol on embryo rate of B. chinensis seeds

3.1.3 煙酸處理對(duì)柴胡種子胚率的影響

煙酸處理對(duì)柴胡種子胚率的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。煙酸不同濃度對(duì)柴胡種胚發(fā)育有一定的促進(jìn)作用，當(dāng)煙酸濃度達(dá)到2.0 mg/L時(shí)，種子胚率達(dá)到最大48.17%，之后隨著濃度增加種子胚率出現(xiàn)下降。本試驗(yàn)中煙酸濃度為2.0 mg/L時(shí)是最適宜濃度。

表3 煙酸對(duì)柴胡種子胚率的影響Table 3 Effects of nicotinic acid on embryo rate of B. chinensis seeds

3.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

選用L9(34)正交表進(jìn)行最佳組合考察，以GA3(A)、肌醇(B)、煙酸(C)作為考察因素，每個(gè)因素設(shè)3個(gè)水平，各因素水平表見(jiàn)表4。

表4 因素水平表Table 4 Factor level table

三種外源物質(zhì)組合的正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5。由表中數(shù)值進(jìn)行直觀分析可以看出，各因素對(duì)柴胡種子胚率影響作用由大到小依次為GA3濃度>煙酸濃度>肌醇濃度，初步確定最佳的濃度組合為A2B3C3，即GA3濃度為200 mg/L、肌醇濃度為90 mg/L、煙酸濃度為2.25 mg/L。

表5 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 5 Results of orthogonal test

為進(jìn)一步明確各因素水平變化對(duì)試驗(yàn)結(jié)果是否具有顯著影響，進(jìn)行方差分析。表6方差分析結(jié)果顯示，因素A和C的水平變化對(duì)試驗(yàn)結(jié)果有顯著影響，故因素A和C確定為3水平；因素B對(duì)試驗(yàn)結(jié)果無(wú)顯著影響，確定因素B為1水平。因此確定處理柴胡種子最佳濃度組合為A3B1D3，即GA3濃度為225 mg/L、肌醇濃度為60 mg/L、煙酸濃度為2.25 mg/L。

表6 正交試驗(yàn)方差分析表Table 6 Analysis of variance for orthogonal test

4 結(jié)果驗(yàn)證

為了驗(yàn)證最優(yōu)濃度組合，采用正交試驗(yàn)優(yōu)選出的最佳因素水平A3B1C3。按上述方法處理三種柴胡種子，以蒸餾水做對(duì)照，重復(fù)3次。三種柴胡種子胚率、發(fā)芽率測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表7。與對(duì)照相比，GA3、肌醇、煙酸三種外源物質(zhì)最優(yōu)濃度組合能夠明顯促進(jìn)三種柴胡種胚的發(fā)育，提高種子的發(fā)芽率，說(shuō)明該結(jié)果用于柴胡種子的處理具有可行性。三種外源物質(zhì)最優(yōu)濃度組合對(duì)柴胡(B.chinensis)種胚的促進(jìn)作用最大，對(duì)狹葉柴胡(B.scorzonerifolium)種胚的促進(jìn)作用次之，對(duì)黑柴胡(B.smithii)種胚的促進(jìn)作用最小，這可能與三種柴胡的生物學(xué)特性、種子來(lái)源不同有關(guān)。

表7 胚率和發(fā)芽率測(cè)定結(jié)果Table 7 Results of determination of embryo rate and germination rate

5 討 論

柴胡種胚的發(fā)育先后要經(jīng)過(guò)原胚、棒狀胚、球形胚、心形胚、魚(yú)雷胚和雙子葉胚等幾個(gè)階段[7]。自然成熟期采收的柴胡種子的胚處于不同發(fā)育階段，經(jīng)石蠟切片研究發(fā)現(xiàn)，約20%左右的種胚處于球形胚，70%左右的種胚處于心形胚，10%左右的種胚發(fā)育到魚(yú)雷胚，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)處于雙子葉胚階段的種胚[8]。自然成熟期的柴胡種胚存在嚴(yán)重的形態(tài)后熟現(xiàn)象，所以即使給予適宜的發(fā)芽條件也不可能萌發(fā)。

柴胡種子胚率是種子質(zhì)量的重要指標(biāo)，當(dāng)種胚發(fā)育到一定階段才具備發(fā)芽的能力。研究報(bào)道，當(dāng)柴胡種子的胚長(zhǎng)達(dá)到胚乳長(zhǎng)的60%～70%時(shí)才能萌發(fā)[9]。新采收的柴胡種子常溫存放5個(gè)月后種子胚率只能達(dá)到16.69%；當(dāng)年生柴胡種子自然狀態(tài)下存放到下一年春季播種，發(fā)芽率僅為30%～40%[10]。因此，生產(chǎn)上為提高柴胡種子發(fā)芽率和出苗率，一般需要對(duì)新采集的柴胡種子進(jìn)行播種前處理。在土壤中層積處理能加速柴胡種胚的發(fā)育，促進(jìn)種胚后熟，層積處理5個(gè)月，發(fā)芽率可達(dá)到50%～60%[6]。

GA3能夠促進(jìn)已分化芽的伸長(zhǎng)生長(zhǎng)；肌醇參與植物碳水化合物代謝，對(duì)組織快速生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，對(duì)胚狀體和芽的形成有良好影響；煙酸對(duì)植物的代謝過(guò)程和胚的發(fā)育有一定的促進(jìn)作用[11]。本文研究結(jié)果可用于柴胡規(guī)范化種植中的種子處理，提高種子發(fā)芽率、出苗率和出苗整齊度。關(guān)于GA3、肌醇、煙酸三種外源物質(zhì)組合對(duì)柴胡后期種苗生長(zhǎng)、藥材產(chǎn)量和品質(zhì)形成的影響有待于進(jìn)一步研究。