基于近紅外光譜特征提取的花椰菜灰霉病早期檢測

穆炳宇, 張淑娟, 李澤珍, 王 凱, 李紫輝, 薛建新*

1. 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，山西 晉中 030801 2. 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西 晉中 030801

引 言

十字花科農(nóng)作物已成為全球種植最多的作物之一，其中花椰菜(BrassicaoleraceaL.botrytis)因其高產(chǎn)量和經(jīng)濟效益脫穎而出，其需求旺盛的主要原因是存在多種促進健康的生物活性物質(zhì)，如芥子油苷，多酚或維生素C，為其可食部分增添了巨大的營養(yǎng)價值[1]。并且已發(fā)現(xiàn)花椰菜可有效預(yù)防慢性疾病，例如某些癌癥和心血管疾病[2]。然而，隨著種植面積和產(chǎn)量的不斷增加，花椰菜病害(灰霉病等)發(fā)生情況逐漸加重，使得花椰菜品質(zhì)受到影響?；ㄒ嘶颐共∈怯苫移咸焰?Botrytis Cinerea Pers)引起的真菌性病害[3]。植物感染灰霉病之后，其組織表面會產(chǎn)生大量灰色霉層，造成大量減產(chǎn)[4]。因此實現(xiàn)對花椰菜灰霉病的早期檢測非常重要。

近紅外光譜技術(shù)作為無損檢測技術(shù)，檢測速度快、 效率高，在研究植物病害方面有很大的作用[5]。Anna等[6]使用高光譜成像技術(shù)檢測出感染灰霉病的草莓，所建模型的R2達到了0.85。有研究建立CARS-PCA-SVM模型，可實現(xiàn)對水稻感染稻瘟病早期和無病斑葉片的檢測。Bin等[7]使用光譜技術(shù)鑒別了真菌性病原體，為農(nóng)作物疾病的快速診斷和預(yù)警提供了技術(shù)參考。He等[8]使用近紅外光譜和計算機視覺在線無損檢測了受到脫氧性苯酚污染的小麥谷物。秦立峰等[9]對溫室黃瓜早期霜霉病光譜圖像田間采集存在的問題，提出融合病害差異信息的特征波段提取方法，建立了黃瓜霜霉病早期檢測模型。Shen等[10]使用NIR光譜技術(shù)鑒定受到不同濃度曲霉菌株污染的花生，實現(xiàn)了92.11%的正確分類率。Sun等[12]使用光譜技術(shù)檢測了接種灰霉菌的桃子，在36 h時對測試數(shù)據(jù)集的分類準確率達到了97.5%。應(yīng)用近紅外光譜技術(shù)對花椰菜灰霉病早期無病斑階段的檢測未見報道。

本工作以健康和感染灰霉病的花椰菜為研究對象，應(yīng)用近紅外光譜技術(shù)，對花椰菜灰霉病早期分級檢測進行研究，主要對染病但無病斑階段進行檢測。先從外觀和品質(zhì)指標上對早期染病花椰菜階段進行判定，之后使用CARS算法對光譜數(shù)據(jù)進行特征波段的提取，構(gòu)建花椰菜灰霉病的早期PLSR單一判別模型以及組合判別模型，目的是確定對花椰菜快速、 準確的早期分類檢測模型，為花椰菜灰霉病的早期診斷提供科學(xué)依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 樣本制備

實驗所用花椰菜品種為“松花”，于2020年10月采摘于大田地，當天運至實驗室并對花椰菜進行篩選，以保證實驗前花椰菜樣本的初始狀態(tài)相對一致，降低個體差異對實驗結(jié)果的影響[12]?；移咸焰?Botrytis Cinerea Pers)由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護研究中心提供，在馬鈴薯葡萄糖瓊脂(Potato Dextrose Agar)培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)后[13]，配置成孢子濃度為1×106mL的孢子懸浮液。

將菜花用小刀(0.1%的次氯酸鈉溶液消毒)切成大小基本一致，約為3 cm的花球浸泡在1%的次氯酸鈉溶液中2 min，進行消毒滅菌，取出后用無菌水清洗三次。用無菌的接種針在菜花上刺孔，深度3 mm，向孔中注入10 μL孢子菌懸液，自然晾干，放入墊有無菌紗布的滅菌密封托盤中，轉(zhuǎn)入溫度為21 ℃，相對濕度為90%的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中貯藏。另有相等數(shù)量的花椰菜樣本經(jīng)消毒滅菌后轉(zhuǎn)入溫度為21 ℃，相對濕度為90%的同等環(huán)境下貯藏。分別在接種后0.5，1，2和3 d后取出對照和接菌樣本各76個，共608個樣本分批次進行近紅外光譜和圖片信息的采集，隨機選取對照和接種樣本各9個用于測定品質(zhì)指標。

1.2 儀器

采用美國ASD(Analytical Spectral Device)公司的Field Spec 3型光譜儀對花椰菜樣本光譜數(shù)據(jù)進行采集。光譜數(shù)據(jù)間隔為1 nm，光譜范圍為350～2 500 nm，采樣方式為漫反射。在使用前儀器至少預(yù)熱30 min，并置于暗箱中進行黑白板校正。

1.3 光譜數(shù)據(jù)獲取與品質(zhì)指標測量

使用Field Spec 3型光譜儀分別采集對照組花椰菜上表面中心點、 處理組花椰菜接種點位置的光譜數(shù)據(jù)。每個點位掃描3次，并取3次反射光譜平均值作為該樣本的光譜數(shù)據(jù)。之后每天對照組和處理組各取9個樣本進行理化指標的測定。多酚氧化酶(PPO)測定采用鄰苯二酚法，過氧化物酶(POD)活性測定采用愈創(chuàng)木酚法，具體操作參考文獻[14]； 丙二醛(MDA)測定參照張承等[15]的方法。為了減少儀器與外界環(huán)境等因素對光譜曲線的影響，去除兩端噪聲后，用500～2 400 nm波段的光譜數(shù)據(jù)進行分析[16]。

1.4 光譜數(shù)據(jù)處理方法

采用K-S算法(Kennard-Stone)劃分校正集和預(yù)測集。為了提高建模速度、 縮短建模時間，采用競爭性自適應(yīng)加權(quán)采樣法(competitive adaptive reweighted sampling，CARS)對光譜數(shù)據(jù)進行特征波長的選擇。采用偏最小二乘回歸(partial least squares regression，PLSR)方法建模。選擇決定系數(shù)(determination coefficient，R2)和均方根誤差(root mean square error，RMSE)作為模型評價的指標。數(shù)據(jù)處理軟件包括SPSS19.0(Version20.0，Inc.，Chicago，IL，USA)、 Matlab 2014 a (The MathWorks，USA)、 The Unscramber X10.1(CAMO ASA，Norway)，利用Origin2019b繪圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 外觀變化分析

花椰菜4個不同貯藏期(0.5，1，2和3 d)對照和接菌樣本如表1所示。隨著貯藏時間的延長，花椰菜樣本顏色逐漸變暗。第0.5 d與1 d的對照和處理組花椰菜樣本從外觀上看并無明顯差異，無法判別是否感染灰霉菌。而在第2 d，約有30%的接種花椰菜在接種點周圍出現(xiàn)黑斑，而到了第3 d時，已進入花椰菜灰霉病高發(fā)期，約有80%的接種花椰菜已出現(xiàn)明顯的黑斑，可以用肉眼觀察出花椰菜是否染病。但是在2 d之前從外觀上不能直接觀察出花椰菜是否感染灰霉病。

表1 貯藏期花椰菜樣本圖

2.2 品質(zhì)指標分析

花椰菜樣本在貯藏期間品質(zhì)指標(PPO，POD，MDA)平均值、 均方根誤差以及顯著性分析如表2所示。POD在0.5～1 d一直處于升高的狀態(tài)，在1 d到達最高值后開始下降，處理組的POD上升速率和下降速率均高于對照組，并在第3 d達到最低。PPO在貯藏初期呈現(xiàn)上升趨勢，在2 d時達到最高峰后開始下降，處理組花椰菜在第2 d與3 d時的PPO值遠大于對照組。從0.5 d到3 d，對照組和處理組的MDA值均在一直上升。

PPO活性的變化即為組織褐變發(fā)生的進程，POD活性的提高則有效抑制灰霉菌的侵染，切分時的機械操作對細胞造成傷害并提高了酶的活性，而后期伴隨著花椰菜的衰老與抵御病害的失敗以及病害的進一步發(fā)展，PPO和POD酶的活性逐漸降低。在整個貯藏期間，MDA值的含量一直在增加，這是因為細胞膜透性增大，花椰菜處于不斷衰老的進程中。

表2 貯藏期花椰菜品質(zhì)指標的變化Table2 Changes of cauliflower quality indexes during storage

從表2可知，在0.5 d時，接種花椰菜和對照花椰菜樣本的理化指標并無顯著性差異，測量值差距較??； 而到了第1 d時，僅有MDA在處理組和對照組之間出現(xiàn)了顯著性差異，無法從第1 d的樣本來區(qū)分花椰菜是否感染灰霉??； 在第2 d時，POD，PPO和MDA三個指標均出現(xiàn)了顯著性差異，且處理組均值都高于對照組； 第3d時，對照組的POD均值高于處理組，而POD和MDA均值低于處理組，表明接菌的花椰菜樣本衰老速度高于對照組，從第2 d，品質(zhì)指標就可以檢測出花椰菜是否感染灰霉病，但是仍無法有效判別第0.5 d和1 d的患病花椰菜。

2.3 花椰菜樣本近紅外反射光譜特征分析

圖1是每個貯藏天數(shù)(0.5，1，2和3 d)，所有健康和染病“松花”花椰菜樣本在500～2 400 nm波段的平均光譜反射曲線。從圖1可知： 隨著貯藏期的延長，對照組和處理組花椰菜樣本平均光譜反射率逐漸升高，光譜反射曲線趨勢大致相同，但不同樣本的吸收峰強度不同。從圖中可知，不同天數(shù)的花椰菜光譜圖在980，1 180，1 260，1 450，1 660，2 250 nm都出現(xiàn)了吸收峰，其中980和1 180 nm為O—H鍵的二級倍頻峰，1 450 nm為O—H鍵的一級倍頻峰，1 660和2 250 nm處的吸收峰則與C—H鍵和C—O鍵有關(guān)。

圖1 花椰菜樣本平均反射光譜圖Fig.1 Average reflection spectrum of cauliflower sample

2.4 花椰菜灰霉病早期檢測模型建立與分析

2.4.1 花椰菜樣本集數(shù)據(jù)劃分

將每一天的花椰菜樣本(健康76個、 染病76個)光譜信息使用K-S算法按照3∶1劃分為校正集(114個樣本)和預(yù)測集(38個樣本)。

2.4.2 基于CARS算法的花椰菜樣本特征波長選擇

CARS算法是效仿達爾文進化理論中“適者生存”的原理提出的變量選擇理論[17]，既可以去除無信息變量，也可以減少共線性變量對模型的影響。在實際特征波長選擇過程中，保留PLSR模型中回歸系數(shù)絕對值大的波長變量，去除絕對值小的變量，多次篩選后可以獲得一系列變量子集，之后采用交叉驗證的方法建模，獲得模型交叉驗證均方根誤差最小的變量子集，即為最優(yōu)波長變量子集。

表3 CARS算法提取的特征波長Table 3 Characteristic wavelength tableextracted by CARS algorithm

采用CARS算法對每天的花椰菜樣本數(shù)據(jù)提取特征波長，由表3可知，0.5～3 d的4個批次特征波長個數(shù)依次為11，10，10和9個，每個貯藏時間內(nèi)大多數(shù)特征波段并不相同，分析認為隨著貯藏時間的延長，花椰菜內(nèi)所含酶活性變化，MDA含量上升，而這些物質(zhì)內(nèi)部含有的O—H，C—O和C—H鍵時刻處在動態(tài)變化中。僅有少數(shù)波長重復(fù)。其中0.5和2 d重復(fù)的波長為1 874 nm，0.5和3 d重復(fù)的波長為2 354和2 383 nm。

2.4.3 CARS特征波長PLSR單一批次建模

將4個單一批次特征波段數(shù)據(jù)為自變量，以花椰菜的好壞類別為因變量，建立基于近紅外光譜的PLSR判別模型。目的是驗證使用近紅外光譜能否實現(xiàn)對早期感染灰霉病花椰菜的判別，以此建立的PLSR模型預(yù)測結(jié)果如表4所示。

表4 CARS特征波長PLSR單一批次建模Table 4 CARS characteristic wavelength PLSRsingle batch modeling

2.4.4 CARS特征波長PLSR組合批次建模

將花椰菜樣本4個批次(0.5～3 d)通過CARS算法提取的特征波段(共37個)組合起來作為自變量，以花椰菜的好壞類別為因變量，進行基于PLSR算法的組合批次建模，提高模型的泛化能力和檢測效率，并以此來判別單一批次花椰菜是否患病。

表5 CARS特征波長PLSR組合批次建模Table 5 CARS characteristic wavelength PLSRcombined batch modeling

使用0.5 d單一批次特征波段所建模型判別準確率達到了94.74%，而組合批次特征波段PLSR算法所建模型在0.5 d時判別準確率僅為92.11%，差距達到2.63%，1 d單一批次特征波段建模已達100%識別率，而1 d組合批次特征波段所建模型驗證時仍有1個誤判； 同樣使用組合批次特征波段建立基于PLSR算法的模型預(yù)測第2 d和第3 d時，預(yù)測均方根誤差低于單一批次特征波段建模，表明PLSR組合批次模型效果劣于PLSR單一批次模型。

利用可見/近紅外光譜技術(shù)對花椰菜灰霉病進行早期檢測。通過CARS算法進行特征波段的提取，既可以提取病害的特征信息，又可以對冗余數(shù)據(jù)進行剔除； 通過PLSR建立相應(yīng)的病害判別模型，對單一批次的花椰菜樣本進行檢測； 將CARS單一批次提取的特征波段組合進行總體PLSR建模，實驗結(jié)果表明，所有模型的樣本判別準確率全部大于92.11%，精度較高。CARS-PLSR單一批次模型可有效判別花椰菜是否感染灰霉病，對染病僅0.5 d的花椰菜檢測精度達到94.74%，比使用組合批次波段的整體模型高2.63%，輸入變量僅僅有11個； 對染病1 d之后的花椰菜檢測精度均達到100%。組合批次波段的整體建模在染病1 d時判別準確率達到了97.37%，處于較高水平，但輸入變量達到了37個，且效果差于單一批次模型，該模型在染病2d之后對花椰菜檢測精度也可達到100%。因此，綜合評價CARS-PLSR單一批次模型為最優(yōu)模型，其各天準確率分別為94.74%，100%，100%和100%。

3 結(jié) 論

基于花椰菜感染灰霉病，在肉眼無法觀察以及品質(zhì)指標沒有顯著性差異時，使用近紅外光譜對花椰菜是否患病進行了早期判別檢測，取得較好的效果。結(jié)果表明近紅外光譜可有效判別健康與感染灰霉病的花椰菜。為已經(jīng)感染灰霉病但是仍處于早期無病斑階段的花椰菜檢測提供了新思路，為花椰菜灰霉病檢測、 早期防治與科學(xué)用藥提供了參考，也為開發(fā)實時、 便攜病害檢測儀器提供理論支持。