老年重癥急性胰腺炎合并應(yīng)激性高血糖患者血清miR-223、HMGB1檢測(cè)及意義

金旭，包先麗，張春芳，楊科

重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis，SAP)是一種病情嚴(yán)重、并發(fā)癥多、病死率較高的急腹癥，占全部急性胰腺炎的10%～20%。SAP發(fā)生時(shí)，機(jī)體處于應(yīng)激狀態(tài)，伴發(fā)高代謝、胰島素抵抗及胰腺功能紊亂等，患者易出現(xiàn)應(yīng)激性高血糖[1]。隨著生物分子技術(shù)的發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)多種微小RNA(miRNA)在各個(gè)疾病中發(fā)揮重要作用。多項(xiàng)基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)，微小RNA-223(miR-223)通過(guò)多種通路參與小鼠炎性反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展，且與病情嚴(yán)重程度有關(guān)[2-3]；另有報(bào)道稱(chēng)miR-223在胰腺癌患者血清中表達(dá)上調(diào)，提高了腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力[4]。然而關(guān)于miR-223在胰腺炎中的研究國(guó)內(nèi)外鮮見(jiàn)報(bào)道。高遷移率族蛋白1(high mobility group box 1，HMGB1)是一組序列高度保守的核蛋白，分布于機(jī)體各重要器官組織中，作為一種晚期炎性介質(zhì)，參與機(jī)體炎性反應(yīng)的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸，已有研究報(bào)道其在急性胰腺炎、慢性腎衰竭血透、膿毒癥等中發(fā)揮重要作用[5-7]。但二者在SAP合并應(yīng)激性高血糖患者中的表達(dá)情況，尚未有報(bào)道。因此，現(xiàn)分析合并應(yīng)激性高血糖老年SAP患者血清miR-223、HMGB1水平及其臨床意義，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2017年9月—2020年9月于北京市和平里醫(yī)院急診科診治的老年SAP患者108例為研究對(duì)象，男62例，女46例，年齡60～81(71.18±3.84)歲。以入院后24 h空腹血糖(FPG)水平≥6.9 mmol/L診斷為應(yīng)激性高血糖[8]，并據(jù)此分為合并應(yīng)激性高血糖組(高血糖組)57例，正常血糖組51例。2組患者性別、年齡、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)水平、病因、家族史比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，高血糖組患者急性生理學(xué)與慢性健康狀況評(píng)分Ⅱ(APACHE Ⅱ)[9]、FPG、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)顯著高于正常血糖組患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)(審批號(hào)：2017-P2-07-09)，患者及家屬均知情同意并簽署知情同意書(shū)。

表1 2組老年SAP患者臨床資料比較

1.2 病例選擇標(biāo)準(zhǔn) (1)納入標(biāo)準(zhǔn)：①所有患者均符合“中國(guó)急性胰腺炎診治指南(2019年,沈陽(yáng))”[10]中有關(guān)SAP的診斷標(biāo)準(zhǔn)；首次發(fā)病且病程≤2 d；③臨床資料完整。(2)排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并惡性腫瘤、血液系統(tǒng)疾病；②合并糖尿病患者；③近1個(gè)月服用過(guò)對(duì)血清生化指標(biāo)有影響的藥物患者。

1.3 觀測(cè)指標(biāo)與方法

1.3.1 血清miR-223水平檢測(cè)：入院后抽取患者晨起空腹肘靜脈血5 ml，離心將上層清液移至干凈EP管，-20 ℃冰箱保存待測(cè)。利用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)血清miR-223水平。將血清先以TRIzol試劑(美國(guó)Sigma公司)提取總RNA，測(cè)定其濃度和純度，以O(shè)D260/OD280值在1.8～2.0判斷為純度較好。使用PrimeScript RT反轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國(guó)Thermo Scientific公司)將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用PCR擴(kuò)增試劑盒(美國(guó)Thermo Scientific公司)進(jìn)行相關(guān)反應(yīng)。miR-223以U6為內(nèi)參，由上海生工生物工程公司合成。miR-223上游引物：5’-ACACTCCAGCTGGGTGTCAGTTTGTC-3’，下游引物：5’-CTCAACTGGTGGTCGTGGAGTCGGCAA-3’；U6上游引物：5’-GCTTCGGCAGCACATATATA-3’，下游引物：5’-CGCTTCACGAATTTGCGTGTG-3’。循環(huán)參數(shù)：95 ℃孵育10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，40個(gè)循環(huán)，72 ℃延長(zhǎng)10 min。用2-△△Ct法計(jì)算miR-223水平。

1.3.2 血清HMGB1水平檢測(cè)：上述血清利用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)血清HMGB1水平(試劑盒購(gòu)自北京百奧萊博生物科技有限公司)，檢測(cè)方法按照說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行。

1.3.3 預(yù)后情況：治療后，患者癥狀恢復(fù)正?；蚺c治療前相比，機(jī)體功能大幅改善為預(yù)后良好；患者癥狀無(wú)明顯改善或者加重，甚至死亡為預(yù)后不良。

1.4 病情判定 根據(jù)患者進(jìn)入ICU或手術(shù)情況進(jìn)行APACHE Ⅱ評(píng)分，分值越高提示病情越嚴(yán)重[9]。

2 結(jié) 果

2.1 2組血清miR-223、HMGB1水平比較 合并應(yīng)激性高血糖組患者血清miR-223、HMGB1水平均顯著高于正常血糖組(P<0.01)，見(jiàn)表2。

表2 2組老年SAP患者血清miR-223、HMGB1水平比較

2.2 高血糖組預(yù)后情況 合并應(yīng)激性高血糖老年SAP患者經(jīng)治療后根據(jù)各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)及癥狀恢復(fù)情況分為預(yù)后良好亞組26例和預(yù)后不良亞組31例，預(yù)后不良亞組APACHE Ⅱ評(píng)分為(16.73±5.27)分，高于預(yù)后良好亞組的(11.53±5.21)分，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t/P=3.730/0.000)。

2.3 2亞組患者血清miR-223、HMGB1水平比較 預(yù)后不良亞組患者血清miR-223、HMGB1水平高于預(yù)后良好亞組(P<0.01)，見(jiàn)表3。

表3 2亞組合并應(yīng)激性高血糖老年SAP患者血清miR-223、HMGB1水平比較

2.4 血清miR-223、HMGB1對(duì)合并應(yīng)激性高血糖老年SAP患者預(yù)后不良的診斷價(jià)值 ROC曲線(xiàn)分析結(jié)果顯示，血清miR-223、HMGB1預(yù)測(cè)合并應(yīng)激性高血糖老年SAP患者預(yù)后不良的曲線(xiàn)下面積(AUC)分別為0.881(95%CI0.768～0.952)、0.911(95%CI0.805～0.960)，敏感度分別為77.42%、80.65%，特異度分別為88.46%、96.15%，二者聯(lián)合診斷的AUC為0.952(95%CI0.860～0.971)，敏感度和特異度分別為93.55%、88.46%，見(jiàn)圖1、表4。

表4 血清miR-223、HMGB1對(duì)合并應(yīng)激性高血糖老年SAP患者預(yù)后不良的診斷價(jià)值比較

2.5 影響合并應(yīng)激性高血糖老年SAP患者預(yù)后不良的危險(xiǎn)因素分析 以合并應(yīng)激性高血糖SAP患者預(yù)后情況為因變量，以血清miR-223、HMGB1水平及APACHE Ⅱ評(píng)分為自變量進(jìn)行多因素Logistic分析，結(jié)果顯示，血清高miR-223水平、高HMGB1水平及高APACHE Ⅱ評(píng)分是影響合并應(yīng)激性高血糖SAP患者預(yù)后不良的危險(xiǎn)因素，見(jiàn)表5。

表5 影響合并應(yīng)激性高血糖老年SAP患者預(yù)后不良的危險(xiǎn)因素分析

注：SAP.重癥急性胰腺炎；miR-223.微小RNA-223；HMGB1.高遷移率族蛋白1圖1 血清miR-223、HMGB1預(yù)測(cè)合并應(yīng)激性高血糖老年SAP患者預(yù)后不良的ROC曲線(xiàn)

3 討 論

SAP患者并發(fā)應(yīng)激性高血糖是一種臨床常見(jiàn)癥狀，導(dǎo)致SAP患者血糖升高的可能原因?yàn)榛颊咴趹?yīng)激狀態(tài)下胰島B細(xì)胞功能被破壞，胰島素分泌量減少，分解血糖減少，患者效應(yīng)細(xì)胞受體下調(diào)，產(chǎn)生胰島素抵抗，導(dǎo)致血糖水平上升。臨床研究發(fā)現(xiàn)，有60%左右行外科大手術(shù)的患者發(fā)生血糖升高[11]，高血糖提示胰腺功能不全，在急性胰腺炎期間或之后更容易發(fā)生。加強(qiáng)SAP患者術(shù)后監(jiān)護(hù)及血糖控制，對(duì)減少感染、改善預(yù)后具有重要意義。

miRNAs是一類(lèi)長(zhǎng)度約為22個(gè)氨基酸的非編碼單鏈RNA分子，由內(nèi)源性基因編碼，在細(xì)胞中調(diào)控基因表達(dá)發(fā)揮生理作用[12]。miRNAs表達(dá)紊亂通常與疾病發(fā)展的各個(gè)病理過(guò)程有關(guān)。Guan等[13]研究發(fā)現(xiàn)，在新生大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞受損后，miR-223-5p水平在1周內(nèi)顯著上升，在第3天達(dá)到高峰，而相應(yīng)抑制劑可明顯降低miR-223-5p蛋白表達(dá)，提示抑制miR-223-5p表達(dá)可減輕脊髓受損后的炎性反應(yīng)。本研究結(jié)果顯示，合并應(yīng)激性高血糖組老年SAP患者血清miR-223水平顯著高于正常血糖組，且合并應(yīng)激性高血糖老年SAP患者中預(yù)后不良亞組血清miR-223水平高于預(yù)后良好亞組，提示血清miR-223可能參與合并應(yīng)激性高血糖老年SAP患者病情的發(fā)生發(fā)展，其水平高表達(dá)可能是導(dǎo)致患者預(yù)后不良的原因。結(jié)合Guan等[13]研究可知，靶向抑制miR-223表達(dá)可能是治療SAP的潛在有效方法。隨著對(duì)急性胰腺炎的深入研究，細(xì)胞因子在SAP發(fā)展中的作用越來(lái)越受到重視[14-15]。巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的炎性反應(yīng)是一種強(qiáng)有力的生物反應(yīng)，通過(guò)消除有害物質(zhì)在維持組織內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)中起關(guān)鍵作用[16]。另有學(xué)者研究報(bào)道稱(chēng)[17]，Kruppel樣因子6基因在分子水平通過(guò)占據(jù)巨噬細(xì)胞啟動(dòng)子區(qū)直接抑制miR-223的表達(dá)來(lái)促進(jìn)炎性反應(yīng)，發(fā)揮毒性作用。由此推測(cè)miR-223可能通過(guò)調(diào)控炎性介質(zhì)活化或通路激活，參與SAP的發(fā)生發(fā)展，具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

本結(jié)果顯示，合并應(yīng)激性高血糖組老年SAP患者血清HMGB1水平顯著高于正常血糖組，且合并應(yīng)激性高血糖老年SAP患者中預(yù)后不良亞組血清HMGB1水平高于預(yù)后良好亞組，提示血清HMGB1參與SAP患者炎性反應(yīng)損害過(guò)程，其表達(dá)水平越高患者病情越嚴(yán)重，預(yù)后越差。分析其原因，HMGB1是SAP患者全身性炎性反應(yīng)的重要介質(zhì)，發(fā)生SAP時(shí)，HMGB1被主動(dòng)釋放到胞外進(jìn)入外循環(huán)，與晚期糖基化終末產(chǎn)物受體特異性結(jié)合傳遞胞內(nèi)信號(hào)，介導(dǎo)細(xì)胞反應(yīng)，如釋放促炎因子、激活炎性反應(yīng)等[18-19]。研究發(fā)現(xiàn)，SAP患者腸黏膜通透性增加，屏障功能受損，細(xì)菌侵襲作用增強(qiáng)，使胰腺組織發(fā)生繼發(fā)性感染，進(jìn)一步刺激活化單核巨噬細(xì)胞分泌炎性介質(zhì)如白介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等，而TNF-α是導(dǎo)致全身炎性反應(yīng)綜合征和多器官功能障礙綜合征的直接原因[20-22]。由于HMGB1晚于TNF-α、IL-6等早期炎性因子出現(xiàn)，并且持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)，故稱(chēng)之為晚期炎性因子，多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，HMGB1在心肌細(xì)胞再灌注損傷、血腦屏障功能障礙等重要組織器官病變中發(fā)揮作用[23-25]。由此推測(cè)，在HMGB1大量合成分泌之前，機(jī)體就處于炎性浸潤(rùn)狀態(tài)，及早治療是改善SAP患者預(yù)后的有效方法。ROC分析結(jié)果顯示，血清miR-223、HMGB1預(yù)測(cè)合并應(yīng)激性高血糖老年SAP患者預(yù)后不良的AUC分別為0.881、0.911，二者聯(lián)合檢測(cè)的AUC為0.952，提示血清miR-223、HMGB1對(duì)患者預(yù)后均有一定的預(yù)測(cè)價(jià)值，聯(lián)合檢測(cè)的診斷效能更好。進(jìn)一步Logistic分析顯示，血清高miR-223水平、高HMGB1水平、高APACHE Ⅱ評(píng)分均是影響合并應(yīng)激性高血糖SAP患者預(yù)后不良的危險(xiǎn)因素，提示在校正APACHE Ⅱ評(píng)分后，血清miR-223、HMGB1水平仍然與合并應(yīng)激性高血糖SAP患者預(yù)后密切相關(guān)。

綜上所述，合并應(yīng)激性高血糖老年SAP患者血清miR-223、HMGB1呈高表達(dá)，血清miR-223、HMGB1水平升高與患者預(yù)后不良密切相關(guān)，提示監(jiān)測(cè)合并應(yīng)激性高血糖老年SAP患者血清miR-223、HMGB1對(duì)判斷患者病情發(fā)展、改善患者預(yù)后具有一定的臨床意義。但SAP患者伴發(fā)血糖升高是個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，血清miR-223、HMGB1在SAP腸道黏膜屏障損傷、血糖升高中的具體作用機(jī)制仍未明確，有待更深入研究。

利益沖突：所有作者聲明無(wú)利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

金旭：設(shè)計(jì)研究方案，實(shí)施研究過(guò)程，課題設(shè)計(jì)，論文撰寫(xiě)；包先麗：提出研究思路，分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)，論文審核；張春芳：實(shí)施研究過(guò)程，資料搜集整理，論文修改；楊科：進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析