梁雨娜 程 杰 張 屏* 包保全 劉德旺 唐雨晨

1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010110；2.包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，內(nèi)蒙古 包頭 014010

蒙藥阿格希日嘎，異名“杜日吉德”、“扎洛爾欽”，中文名藜蘆，為百合科植物藜蘆VeratrumnigrumL.的干燥根及根莖。分布于內(nèi)蒙古呼倫貝爾盟、哲里木盟，赤峰和錫林郭勒盟；以野生資源入藥；春季抽花莖前采挖，除去苗葉，泥沙，曬干[1-2]。本品為蒙藥寒熱癥總瀉藥，味苦、辛，性平，效銳、糙、重、浮、稀，有毒，具有瀉下、催吐之功效，用于治療“希拉”病、消化不良、鐵垢巴達(dá)干，劍突痞，痧癥，蟲癥，疫熱，胎衣不下，水腫，瘡疽等[3-5]。藜蘆屬植物的主要活性成分有甾體生物堿類、二苯乙烯類、黃酮類等[6-8]。其中，甾體生物堿具有抗癌、抗病毒、鎮(zhèn)咳、抗炎、降血壓、防止血栓生成等多種生物活性，也是藜蘆的主要毒性成分。近年來(lái)，其抗癌活性的研究成為熱點(diǎn)，作用機(jī)制包括Hedgehog信號(hào)通路、Caspase-3依賴的細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期和自噬等[9-10]。迄今為止，已從藜蘆屬植物中分離得到甾體生物堿70多種，已建立藜蘆胺、介芬胺等成分的高效液相色譜法[11-12]，但尚無(wú)有關(guān)藜蘆總堿含量測(cè)定的文獻(xiàn)報(bào)道。

酸性染料比色法具有靈敏度高和操作簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn)，是測(cè)定中藥總生物堿含量的經(jīng)典方法之一[13-14]。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)酸性染料比色法的染料種類、酸性染料用量、測(cè)定波長(zhǎng)、緩沖液的選擇及其pH等因素[15]進(jìn)行考察，首次建立測(cè)定蒙藥阿格希日嘎中總生物堿含量的最佳酸性染料比色方法，為蒙藥阿格希日嘎的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考與依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 島津UV-1280紫外可見分光光度計(jì)(日本Shimadzu公司)；AB135-S十萬(wàn)分之一分析天平(瑞士METTLER TOLED公司)；WR-100型微型粉碎機(jī)(鶴壁市天冠儀器儀表有限公司)；KQ2200超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋(國(guó)華電器有限公司)；PHS-3E型精密pH計(jì)(上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司)。

1.2 試藥 介芬胺(批號(hào)：YL-2013091833，純度：98.0%，上海一林生物科技有限公司，供含量測(cè)定用)；溴甲酚綠(天津市大茂化學(xué)試劑廠)；溴百里香酚蘭(天津市大茂化學(xué)試劑廠)；枸櫞酸(天津博迪化工股份有限公司)；枸櫞酸鈉(天津市大茂化學(xué)試劑廠)；磷酸氫二鈉(天津市化學(xué)試劑批發(fā)公司)；鄰苯二甲酸氫鉀(天津博迪化工股份有限公司)；氫氧化鈉(天津市津東天正化學(xué)試劑廠)；三氯甲烷(天津市津東天正化學(xué)試劑廠)；甲醇(天津市津東天正化學(xué)試劑廠)；水為蒸餾水。

1.3 藥材 蒙藥阿格希日嘎樣品于2018年6月采自內(nèi)蒙古、黑龍江、吉林3個(gè)不同的產(chǎn)區(qū)，每個(gè)產(chǎn)區(qū)采集6批樣品，采集地點(diǎn)詳見表1。包保全教授進(jìn)行原植物鑒定為百合科植物藜蘆VeratrumnigrumL.，模式標(biāo)本存放于內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院標(biāo)本室。取其根及根莖，去除泥沙，于陰涼處干燥，即得。中藥藜蘆樣品于2020年9月購(gòu)自河北省安國(guó)藥材市場(chǎng)，包保全教授進(jìn)行原植物鑒定為百合科植物藜蘆VeratrumnigrumL.，編號(hào)Z2020。

表1 蒙藥阿格希日嘎樣品產(chǎn)地及地理信息

2 方法與結(jié)果

2.1 試驗(yàn)溶液的制備

2.1.1 對(duì)照品溶液的制備 稱取介芬胺對(duì)照品約5 mg，精密稱定，置于5 mL量瓶中，加三氯甲烷溶解并定容至刻度。精密量取1 mL，置于10 mL量瓶中，用三氯甲烷稀釋至刻度，搖勻，得濃度為0.0994 mg·mL-1的對(duì)照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 取本品粉末約 1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加濃氨試液2 mL，浸潤(rùn)1 h，加三氯甲烷-甲醇(4∶1)混合溶液40 mL，置80 °C水浴加熱回流2 h，放冷，濾過，濾液置50 mL量瓶中，用適量三氯甲烷-甲醇(4∶1)混合溶液洗滌藥渣2～3次，洗液并入同一量瓶中，加三氯甲烷-甲醇(4∶1)混合溶液至刻度，搖勻。精密量取1 mL，置25 mL具塞試管中，水浴上蒸干，精密加入三氯甲烷10 mL使溶解，即得供試品溶液[16-17]。

2.2 測(cè)定條件的選擇

2.2.1 酸性染料種類的選擇 精密量取“2.1.1” 項(xiàng)下對(duì)照品溶液2 mL，置25 mL具塞試管中，水浴上蒸干，精密加入三氯甲烷10 mL使溶解。精密加水5 mL、再精密加0.04%溴甲酚綠緩沖液(取溴甲酚綠0.04 g，用pH值為4.0的鄰苯二甲酸氫鉀-氫氧化鈉溶液溶解并稀釋至100 mL，即得)2 mL，密塞，劇烈振搖1 min，轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，放置30 min。取三氯甲烷液，用干燥濾紙濾過，取續(xù)濾液，以相應(yīng)的試劑為空白。同法制備溴百里香酚蘭溶液組。照紫外-可見分光光度法(通則0401)，進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描測(cè)定吸光度。根據(jù)結(jié)果可知，溴百里香酚蘭空白對(duì)照溶液在300～500 nm范圍內(nèi)有較大吸光度，干擾較大；溴甲酚綠與供試品提取液形成的離子對(duì)在300～500 nm范圍內(nèi)的最大吸光值度最高，故酸性染料確定為溴甲酚綠。

2.2.2 緩沖溶液的選擇 精密量取“2.1.1” 項(xiàng)下對(duì)照品溶液2 mL，置25 mL具塞試管中，水浴上蒸干，精密加入三氯甲烷10 mL使溶解。精密加水5 mL、再精密加0.04%溴甲酚綠緩沖液2 mL，密塞，劇烈振搖1 min，轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，放置30 min。取三氯甲烷液，用干燥濾紙濾過，取續(xù)濾液，以相應(yīng)的試劑為空白。同法制備枸櫞酸-枸櫞酸鈉，枸櫞酸-磷酸氫二鈉緩沖鹽溶液組。照紫外-可見分光光度法(通則0401)，進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描。根據(jù)結(jié)果可知，鄰苯二甲酸氫鉀-氫氧化鈉緩沖溶液中離子對(duì)吸光度最大，故緩沖溶液確定為鄰苯二甲酸氫鉀-氫氧化鈉溶液。

2.2.3 緩沖溶液pH的選擇 精密量取“2.1.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液2 mL，置25 mL具塞試管中，水浴上蒸干，精密加入三氯甲烷10 mL使溶解。精密加水5mL、再精密加0.04%溴甲酚綠緩沖液2 mL，密塞，劇烈振搖1 min，轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，放置30 min。取三氯甲烷液，用干燥濾紙濾過，取續(xù)濾液，以相應(yīng)的試劑為空白[18]。同法制備pH 值3.8、4.0、4.2時(shí)的溶液。照紫外-可見分光光度法(通則0401)，進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描。根據(jù)結(jié)果可知，pH值為4.0時(shí)離子對(duì)提取液組吸光度最大，故緩沖溶液pH 值應(yīng)為4.0。

2.2.4 酸性染料用量的選擇 精密量取“2.1.1” 項(xiàng)下對(duì)照品溶液2 mL，置25 mL 具塞試管中，水浴上蒸干，精密加入三氯甲烷10 mL使溶解。精密加水5mL、再精密加0.04%溴甲酚綠緩沖液2 mL，密塞，劇烈振搖1 min，轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，放置30 min。取三氯甲烷液，用干燥濾紙濾過，取續(xù)濾液，以相應(yīng)的試劑為空白。同法制備酸性染料濃度為0.3、0.4、0.5 mg·mL-1的溶液。照紫外-可見分光光度法(通則0401)，進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描。根據(jù)結(jié)果可知，酸性染料濃度為0.4 mg·mL-1時(shí)離子對(duì)吸光度最大，故酸性染料濃度為 0.4 mg·mL-1。

2.2.5 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇 精密量取“2.1.1” 項(xiàng)下對(duì)照品溶液2 mL，置25 mL具塞試管中，水浴上蒸干，精密加入三氯甲烷10 mL使溶解。精密加水5 mL、再精密加0.04%溴甲酚綠緩沖液2 mL，密塞，劇烈振搖1 min，轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，放置30 min。取三氯甲烷液，用干燥濾紙濾過，取續(xù)濾液，以相應(yīng)的試劑為空白[18]。同法制備空白對(duì)照組、供試品溶液組。照紫外-可見分光光度法(通則0401)，進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描。結(jié)果表明，介芬胺對(duì)照品和供試品溶液均在411 nm處有最大吸收，空白溶液則無(wú)吸收，結(jié)果如圖1所示，故選411 nm為測(cè)定波長(zhǎng)[19]。

圖1 紫外-可見吸收?qǐng)D譜

2.3 酸性染料比色法的方法學(xué)考察

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密量取“2.1.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液0.2 mL、0.5 mL、1 mL、2 mL 、3mL、4 mL，置25 mL具塞試管中，水浴上蒸干，精密加入三氯甲烷10 mL使溶解。按“2.2.5”項(xiàng)下方法處理顯色后，于411 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值，記錄吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。介芬胺回歸方程y=31.521x+0.078，r= 0.9993。結(jié)果表明，介芬胺的濃度在0.001988～0.03976 mg·mL-1范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系[20]。

2.3.2 精密度試驗(yàn) 取“2.1.2”項(xiàng)下供試品溶液(編號(hào)：MH-1)，按“2.2.5”項(xiàng)下方法處理顯色后，于411 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值。連續(xù)測(cè)定6次，結(jié)果，RSD值<1.15%(n=6)，表明本方法精密度良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.1.2”項(xiàng)下供試品溶液(編號(hào)：MH-1)，按“2.2.5”項(xiàng)下方法處理顯色后，取三氯甲烷層分別于室溫下放置0、4、8、10、12 和24 h，于411 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值。結(jié)果，RSD值<2.15%(n=6)，表明供試品溶液室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液(編號(hào)：MH-1)，共6份，按“2.2.5”項(xiàng)下方法處理顯色后，于411 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值。結(jié)果，阿格希日嘎中總生物堿平均百分含量為5.801mg·g-1，RSD值<1.75%(n=6)，表明本方法重復(fù)性良好。

2.3.5加樣回收試驗(yàn) 稱取本品粉末(編號(hào)：MH-1)共9份，每份約0.5 g，精密稱定，分別置于具塞錐形瓶中，分別按樣品中生物堿含量的80%、100%、120%加入對(duì)照品，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2.5”項(xiàng)下方法處理顯色后，于411 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值，并計(jì)算回收率[21]。結(jié)果平均回收率為96.6%(RSD=2.00%)，結(jié)果見表2。

表2 加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果 (n=9)

2.4 樣品含量測(cè)定 分別稱取內(nèi)蒙古、黑龍江、吉林3個(gè)產(chǎn)地(每個(gè)產(chǎn)地6個(gè)批次)的18批蒙藥阿格希日嘎樣品，和中藥商品藜蘆樣品，每份約 1 g，精密稱定，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2.5”項(xiàng)下方法處理顯色后，于 411 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算總生物堿含量，結(jié)果見表3。

表3 含量測(cè)定結(jié)果 (n=3)

3 討論

3.1 提取方法的選擇 蒙藥阿格希日嘎中生物堿結(jié)構(gòu)多為甾體生物堿，與百合科植物貝母中生物堿結(jié)構(gòu)相近，故該實(shí)驗(yàn)中生物堿的提取方法參照《中國(guó)藥典》2015年版中川貝母中生物堿的提取方法，采用氨水浸潤(rùn)后，再用混合溶劑加熱回流提取，課題組前期研究表明，此方法對(duì)蒙藥阿格希日嘎總生物堿的提取效果也很好[22]。

3.2 實(shí)驗(yàn)條件的確定 本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)酸性染料比色法的染料種類、酸性染料用量、測(cè)定波長(zhǎng)、緩沖液的選擇及其pH等因素進(jìn)行了考察，最終確定了酸性染料為溴甲酚綠、緩沖液為鄰苯二甲酸氫鉀-氫氧化鈉溶液、緩沖液的pH為4.0、酸性染料濃度為0.4 mg·mL-1時(shí)，測(cè)得離子對(duì)在411 nm處吸光度最大。該方法具有一定的專屬性和準(zhǔn)確度，靈敏度高，簡(jiǎn)便易行，適用于蒙藥阿格希日嘎中總生物堿含量的測(cè)定。

3.3 不同產(chǎn)區(qū)藜蘆生物堿含量存在顯著差異 不同產(chǎn)區(qū)藜蘆總生物堿差異顯著，內(nèi)蒙古呼倫貝爾的總生物堿含量最高，黑龍江漠河和吉林遼源較少，分別為7.560、5.520、5.524 mg·g-1，而中藥藜蘆中總生物堿含量高達(dá)10.298 mg·g-1。課題組前期研究表明中藥藜蘆與蒙藥阿格西日嘎兩者之間生物堿的種類具有明顯差異，蒙藥阿格希日嘎中介芬胺和藜蘆胺含量極少[5]。植物次生代謝產(chǎn)物的積累與外界環(huán)境(海拔、光照、氣候、土壤等) 密切相關(guān)，不同植物不同的次級(jí)代謝產(chǎn)物受環(huán)境因子的影響程度不一樣[23]。由此，推測(cè)藜蘆生長(zhǎng)環(huán)境因素差異導(dǎo)致了不同產(chǎn)地的生物堿的含量不同。