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      牛耳楓質(zhì)量標準提升研究

      2021-08-18 06:31:16唐靖雯彭政忠李嬌嬌
      中國民族民間醫(yī)藥 2021年13期
      關鍵詞:浸出物蘆丁藥材

      唐靖雯 彭政忠 潘 梅 李嬌嬌 楊 桃 潘 婷 王 歡

      貴州威門藥業(yè)股份有限公司,貴州 貴陽 550018

      牛耳楓為虎皮楠科交讓木屬植物牛耳楓DaphniphyllumcalycinumBenth的干燥帶葉莖枝,收載于《廣西中藥材標準》,具有清熱解毒、活血舒筋的功效,分布于湖南、廣東、江西等地[1-2]。主要含有黃酮類化合物及少量的生物堿、三萜類、甾醇類和酚酸類等其它化合物,其中黃酮類化合物蘆丁不僅具有調(diào)節(jié)毛細血管壁的滲透性和脆性、防止血管破裂、止血的作用,還具有抗菌消炎、抗氧化等作用[3-4]。牛耳楓可治療糖尿病、心血管疾病和高血壓等多種疾病,其葉和種子中含有的生物堿具有抗腫瘤的作用[5],種子可榨油做肥皂、潤滑油等[6]。牛耳楓作為臨床上常用中藥,其質(zhì)量真?zhèn)?、?yōu)劣嚴重影響臨床療效,但目前只有《廣西中藥材標準》[7]的質(zhì)量標準中僅有性狀、顯微鑒別,缺少具有代表性的薄層鑒別和含量測定,不夠全面反映牛耳楓藥材的內(nèi)在質(zhì)量,達不到判斷質(zhì)量優(yōu)劣的目的。因此本研究在牛耳楓的性狀、顯微鑒別的基礎上增加薄層鑒別、含量測定,并考察了水分、總灰分和浸出物,以更有效地鑒定牛耳楓藥材質(zhì)量,為牛耳楓藥材的進一步開發(fā)應用提供鑒定依據(jù)。

      1 儀器與材料

      1.1 儀器 高效液相色譜儀Agilent-1260型(美國Agilent公司);檢測器:二極管陣列檢測器;萬分之一電子天平AY120型(日本島津公司);十萬分之一電子天平AG135型(瑞士梅特勒公司)。

      1.2 藥品與試劑 乙腈(色譜純,美國TEDIA天地試劑公司);娃哈哈純凈水;水合氯醛、間苯三酚、濃鹽酸、稀甘油均為分析純;牛耳楓對照藥材(批號:121660-201201),中國食品藥品檢定研究院;蘆丁對照品(批號:100080-201409;含量:91.9%),中國食品藥品檢定研究院。

      研究所用的牛耳楓藥材均來源于廣西、湖南和廣東等地,詳見表1。

      表1 樣品來源表

      2 方法與結(jié)果

      2.1 形態(tài)鑒別 主干呈類圓柱形,直徑0.8~4.0 cm,切后呈斜切片,切片橢圓形,直徑1.0~5.0 cm,厚0.3~1.0 cm,皮表面具皮孔,灰褐色至褐色,質(zhì)堅硬,不易折斷;枝呈圓柱形,直徑0.3~2.0 cm,切后呈斜切片狀或枝段,切片橢圓形,直徑0.3~3.0 cm,厚0.2~0.8 cm,枝段直徑0.3~0.5 cm,長0.5~1.5 cm,表面灰綠色或淺灰棕色,具稀疏皮孔,體輕質(zhì)硬,較難折斷,斷面灰白色或淺棕色,髓部疏松或形成髓腔。葉片基部寬楔形,全緣;上表面草綠色至淺灰棕色,下表面淺綠色至灰棕色;葉脈下表面突起,側(cè)脈明顯;葉柄長3~8 cm,革質(zhì)。偶見果實,果實卵圓形,具有不規(guī)則的皺紋。氣微,味苦澀。如圖1所示。

      圖1 牛耳楓形態(tài)鑒定(來源于廣西省桂林市荔浦縣)

      2.2 顯微鑒定 莖橫切面:表皮具表皮細胞1列,外被厚角質(zhì)層;有的老枝可見木栓層。皮層由數(shù)列至十余列薄壁細胞組成,內(nèi)含眾多草酸鈣簇晶,有的薄壁細胞含黃褐色塊狀物。韌皮部由1~2列細胞組成韌皮射線,細胞內(nèi)常見草酸鈣簇晶。木質(zhì)部寬廣,導管類方形或多角形,多單個或 2~3個成群,木纖維胞腔較大,木射線為1~2列細胞組成。髓部薄壁細胞類圓形;中央多成空隙。葉表面觀:上表皮細胞垂周壁波狀彎曲,部分細胞含草酸鈣簇晶,常并列或成群分布。下表皮細胞垂周壁較平直,乳頭狀突起呈小圓圈狀,氣孔平軸式;草酸鈣簇晶較多,常并列或成群分布。粉末:粉末灰褐色或黃灰色。內(nèi)含草酸鈣簇晶較多,直徑10~30 μm,大多存在于細胞內(nèi)。石細胞類圓形或類長多角形,胞腔內(nèi)含紅棕色內(nèi)含物。導管多為螺紋導管和梯紋導管,直徑23~45 μm。纖維束狹長,長短不一。粉末中偶有破碎的細胞塊,如葉下表皮細胞垂周壁較平直,乳頭狀突起呈小圓圈狀,氣孔平軸式。如圖2所示。

      圖2 牛耳楓顯微鑒定

      2.3 薄層鑒別 取牛耳楓粉末1 g,加甲醇25 mL,超聲處理30 min,濾過,濾液蒸干,殘渣加甲醇 1 mL 使溶解,作為供試品溶液。另取牛耳楓對照藥材0.5 g,同法制成對照藥材溶液;再取蘆丁對照品,加甲醇制成每1 mL含1.0 mg的溶液,作為對照品溶液。按2015年版《中國藥典》四部通則0502薄層色譜法試驗,吸取上述3種溶液各2 μL,分別點于同一硅膠G薄層板上,以乙酸乙酯-甲酸-水(8∶1∶1)為展開劑,展開,取出,晾干,噴以5%三氯化鋁乙醇溶液,置紫外光燈365 nm下檢視,結(jié)果如圖3所示。在供試品、對照藥材和對照品色譜相應的位置上,顯相同顏色的熒光斑點。

      圖3 牛耳楓TLC色譜圖

      2.4 檢查項及浸出物 采用2015年版《中國藥典》四部通則0832水分測定法第二法(烘干法)測定含水量,通則2302灰分測定法測定總灰分,通則2201項下醇溶性浸出物測定法(熱浸法)測定浸出物含量(溶劑:稀乙醇),平行3份,結(jié)果見表2。根據(jù)測定的結(jié)果,初步擬定含水量不超過11.0%,總灰分含有量不得超過5.0%,浸出物含有量不得少于14.0%。

      2.5 含量測定

      2.5.1 色譜條件 色譜柱:Agilent TC-C18 (250 mm×4.6 mm,5 μm);流動相:乙腈-0.1%磷酸溶液(54∶46,V/V);流速:1.0 mL/min;檢測波長:354 nm;柱溫:25 ℃;進樣量:10 μL;理論板數(shù)按蘆丁峰計算應不低于3000。

      2.5.2 溶液制備 對照品溶液的制備:取蘆丁對照品適量,精密稱定,加甲醇制成每1 mL含60 μg的溶液,即得。供試品溶液的制備:取本品粉末(過二號篩)約2 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入50%甲醇25 mL,密塞,稱定重量,加熱回流1 h,放冷,再稱定重量,用50%甲醇補足減失的重量,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,即得。

      2.5.3 系統(tǒng)適用性試驗 分別精密吸取“2.5.2”項下蘆丁對照品溶液、供試品溶液及缺牛耳楓藥材的陰性空白溶液按“2.5.1”項下色譜條件進行測定,分離度R=1.8,理論塔板數(shù)為5500。色譜如圖4所示。

      表2 水分、總灰分、浸出物含有量測定結(jié)果 (n=3)

      圖4 蘆丁HPLC色譜圖

      2.5.4 線性關系 精密吸取蘆丁對照品貯備液(200.34 μg/mL) 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 mL,分別置10 mL的量瓶中,用甲醇稀釋至刻度,分別進樣10 μL,按“2.5.1”項下色譜條件,各進樣10 μL, 記錄峰面積。以對照品的質(zhì)量數(shù)為橫坐標,峰面積為縱坐標,繪制標準曲線,進行線性回歸。回歸方程:A=1696.9C-21.296,r=0.9996。結(jié)果表明,蘆丁在0.200~1.403 μg范圍內(nèi),其質(zhì)量數(shù)與峰面積呈良好的線性關系。

      2.5.5 精密度試驗 精密吸取蘆丁對照品溶液(80.2 μg/mL) 10 μL,重復進樣6次,按“2.5.1”項下色譜條件測定其峰面積。結(jié)果RSD為1.17%,表明儀器精密度較好。

      2.5.6 穩(wěn)定性試驗 取牛耳楓藥材按“2.5.2”項下法制成供試品溶液,“2.5.1”項下色譜條件分別于0、3、6、9、15、24 h測定其峰面積。結(jié)果,蘆丁峰面積的RSD為0.41%,說明牛耳楓藥材供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

      2.5.7 重復性試驗 分別精密稱取牛耳楓藥材粉末(藥材編號:Y063-15-11-24-01)6份,按 “2.5.2”項下法制成供試品溶液,按“2.5.1”項下色譜條件進行測定,以外表一點法計算蘆丁含量。結(jié)果,蘆丁含量的RSD為1.47%,表明該方法的重復性良好。

      2.5.8 加樣回收率試驗 分別精密稱取9份已知含量的牛耳楓藥材粉末(過二號篩) (藥材編號:Y063-15-11-24-01) 1 g,置于具塞錐形瓶中,按蘆丁對照品與牛耳楓藥材中蘆丁含量1.5∶1、1∶1、0.5∶1加入蘆丁對照品,按“2.5.2”項下法制成供試品溶液,按“2.5.1”項下色譜條件進行測定。結(jié)果:牛耳楓藥材中蘆丁平均回收率為101.65%,RSD為2.42%,說明該方法可用于測定牛耳楓藥材中蘆丁的含量,結(jié)果詳見表3。

      表3 蘆丁加樣回收率試驗結(jié)果

      2.5.9 樣品含量測定 取20批不同產(chǎn)地牛耳楓藥材,按“2.5.2”項下法制成供試品溶液和按“2.5.1”項下色譜條件進行測定其峰面積。以干燥品計算牛耳楓藥材中蘆丁的含量(%)。結(jié)果詳見表4。根據(jù)測定的結(jié)果,初步擬定蘆丁含量不得低于0.07%。

      表4 不同產(chǎn)地牛耳楓藥材蘆丁含量測定

      3 討論

      3.1 指標性成分的確定 牛耳楓主要成分為黃酮類、酚酸類和生物堿類。據(jù)文獻報道[8],從牛耳楓枝干和葉中分離可得到羽扇豆酮、β-谷甾醇、胡蘿卜苷、deoxycalyciphylline B、daphiodhanins D、calyciphylline B、槲皮素、蘆丁等化合物,其蘆丁是牛耳楓中主要的黃酮類成分;因此,本研究以蘆丁作為指標進行含量測定。

      3.2 展開劑的考察 本研究以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G板為載體,5%三氯化鋁乙醇溶液為顯色劑,曾采用乙酸乙酯-甲醇-濃氨試液(20∶5∶1)[9]、甲苯(水飽和)-甲酸乙酯-甲酸(4∶4∶2)[10]作為展開劑進行研究,但因斑點不清晰,且存在拖尾現(xiàn)象;因此,研究中調(diào)整了展開劑及比例,分別以丙酮-乙酸-水(9∶1∶1)、丙酮-甲酸-水(10∶1∶1)、乙酸乙酯-甲酸-水(8∶1∶1)為展開劑進行考察研究,結(jié)果表明:以乙酸乙酯-甲酸-水(8∶1∶1)為展開劑,斑點清晰,分離度好。

      3.3 TLC法耐用性考察 本研究考察了溫度(25 ℃、4 ℃)、相對濕度(75%、52%) 、廠家、薄層硅膠板(G型、H型)對蘆丁TLC鑒別的影響,發(fā)現(xiàn)各廠家G 型硅膠板在不同溫度、相對濕度下,TLC 色譜圖中蘆丁斑點清晰,與相鄰斑點分離度較好,而H 型硅膠板效果較差,故選擇G 型板。

      3.4 HPLC法耐用性考察 本研究考察了色譜柱[Ultimate XB-C18(250×4.6 mm)、Diamonsil C18(250×4.6 mm,5 μm)、Agilent TC-C18(2) (250×4.6 mm,5 μm)],柱溫(25 ℃、30 ℃、40 ℃),流動相比例[乙腈-0.1%磷酸(16∶84)、乙腈-0.1%磷酸(15∶85)、乙腈-0.11%磷酸(14∶86)],流速(0.9 mL/min、1.0 mL/min、1.1 mL/min),考察發(fā)現(xiàn)流動相比例和流速的改變對蘆丁的檢測影響較大。

      4 結(jié)論

      本研究通過對牛耳楓水分、灰分、浸出物的測定,為制訂牛耳楓藥材質(zhì)量標準提供實驗依據(jù);對牛耳楓顯微鑒別、薄層鑒別、含量測定進行較為全面的研究,建立專屬性強的定性、定量測定方法,能夠準確、科學地評價牛耳楓質(zhì)量,也為相關地方標準的制定以及現(xiàn)有質(zhì)量標準的提升提供參考。

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